目的 總結近年來 3-D 成球培養 MSCs 的研究進展及臨床應用前景。 方法 廣泛查閱國內外 3-D 成球培養 MSCs 的相關研究，重點關注 3-D 培養模式下 MSCs 細胞球的形成機制，3-D 培養的 MSCs 細胞球與傳統貼壁培養的 MSCs 在生物功能上存在的差異，以及造成這些差異的生物學機制，探討 MSCs 細胞球的臨床應用前景。 結果 與傳統貼壁培養的 MSCs 相比，3-D 培養的 MSCs 細胞球在抗凋亡、多向分化、旁分泌、抗炎等多項生物功能上明顯增強，其機制與細胞骨架的改變、細胞接觸的增加和低氧微環境的刺激有關，在動物實驗中對于難愈性創面的修復、缺血組織的修復、組織重塑具有顯著治療效果，有廣闊臨床應用前景。 結論 3-D 培養的 MSCs 細胞球較傳統貼壁培養的 MSCs 具有更強的生物功能和治療效果，可成為臨床上優化干細胞療法、提高其治療效果的一種手段。
目的總結近年來 MSCs 來源外泌體（exosomes，EXOs）在創面修復中的研究進展。方法廣泛查閱國內外有關 MSCs-EXOs 在創面修復中作用的文獻，總結分析 MSCs-EXOs 在創面修復過程中的作用機制及其臨床應用前景。結果MSCs-EXOs 在創面愈合過程中可抑制早期的炎性反應，促進血管新生和上皮細胞的增殖與遷移，后期調控膠原合成并抑制瘢痕增生。與 MSCs 相比，MSCs-EXOs 具有高穩定性、易于儲存、不易致瘤、無需增殖、便于定量使用等優點，有著廣闊的臨床應用前景。結論MSCs-EXOs 能夠促進創面修復，且有希望發展成為臨床上一種促進急性或慢性創面修復的產品。
目的探討人脂肪源細胞外囊泡（human adipose tissue derived extracellular vesicle，hAT-EV）聯合脫細胞脂肪組織支架（decellularized adipose tissues，DAT）構建組織工程脂肪的可能性，為臨床上軟組織缺損修復提供新方案。方法將吸脂手術患者自愿捐贈的脂肪組織分為 2 份，1 份脂肪組織進行脫細胞處理，并采用組織學（HE、Masson 染色）、掃描電鏡觀察，Ⅰ、Ⅳ 型膠原及層粘連蛋白免疫組織化學染色和 Western blot 檢測進行表征。另 1 份脂肪組織使用去外泌體的完全培養基孵化 48 h，離心收集培養基上清并使用超高速離心法獲取 hAT-EV。使用透射電鏡觀察其形態，納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 分析 hAT-EV 粒徑分布范圍，Western blot 檢測分析 hAT-EV 膜表面蛋白。將 PKH26 熒光標記的 hAT-EV 與脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）共培養后，共聚焦熒光顯微鏡觀察 hAT-EV 能否進入 ADSCs；將 hAT-EV 與 ADSCs 共培養 15 d，油紅 O 染色評估其成脂效果。將 DAT 組織剪碎并注射至 8 只 6 周齡雌性 C57 小鼠背部兩側，左側每周注射 0.2 mL hAT-EV 作為實驗組，右側每周注射 0.2 mL PBS 作為對照組。12 周后處死小鼠，取兩側 DAT 新生物進行濕重稱量，并通過 HE 染色和圍脂滴蛋白免疫熒光染色評估 hAT-EV 在體內誘導脂肪新生的能力。結果脂肪組織經脫細胞后，HE、Masson 染色示 DAT 主要由排列松散的膠原構成，未見細胞核；掃描電鏡示 DAT 中未發現細胞和細胞碎片，同時可見到粗大的膠原纖維束；免疫組織化學染色及 Western blot 檢測示，DAT 中保留了 Ⅰ、Ⅳ 型膠原和層粘連蛋白。經鑒定，hAT-EV 呈雙層包膜的球形，高表達 CD63、凋亡誘導因子 6 相互作用蛋白抗體、腫瘤易感基因 101，97.9% 粒徑分布范圍為 32.67～220.20 nm，峰值為 91.28 nm。共聚焦熒光顯微鏡和油紅 O 染色示，hAT-EV 被 ADSCs 攝取并誘導其成脂分化。大鼠體內實驗顯示，實驗組新生脂肪組織濕重顯著高于對照組（t=2.278，P=0.048）；HE 染色示，實驗組脂滴結構較對照組多，對照組膠原含量高于實驗組；圍脂滴蛋白免疫熒光染色示，實驗組 DAT 新生物中脂肪組織比例高于對照組（t=4.648，P=0.017）。結論DAT 搭載 hAT-EV 可作為一種誘導脂肪組織新生的新方法，在軟組織缺損修復中具有潛在應用前景。
目的 探討脂肪干細胞來源外泌體（adipose-derived stem cell released exosomes，ADSC-Exos）對人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖、遷移及管樣分化的影響。 方法 取吸脂患者自愿捐贈的脂肪組織，采用酶消化法分離培養獲得 ADSCs，并行流式細胞檢測及成脂誘導鑒定。收集第 3 代 ADSCs 上清液提取外泌體，透射電鏡觀察其形態，Western blot 檢測其膜表面標志性蛋白 Alix 和 CD63，用納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 分析外泌體粒徑分布范圍。用 PKH26 熒光標記的 ADSC-Exos 與 HUVECs 共培養后，共聚焦顯微鏡觀察 ADSC-Exos 能否進入 HUVECs。將 ADSC-Exos 與 HUVECs 共培養 1、2、3、4、5 d，CCK-8 法檢測 ADSC-Exos 對 HUVECs 增殖影響；共培養 12 h 時 ELISA 法檢測細胞上清液 VEGF 蛋白表達量。采用 Transwell 遷移實驗檢測 ADSC-Exos 對 HUVECs 遷移能力的影響。通過體外 Matrigel 基質膠實驗，觀察 ADSC-Exos 對 HUVECs 管狀結構形成的影響；將 HUVECs 與 Matrigel 基質膠混合后聯合 ADSC-Exos 注射在 BALB/c 雄性裸鼠皮下，2 周后檢測基質膠中新生血管情況，計算平均血管密度（mean blood vessel density，MVD）。上述實驗均以等量 PBS 作為對照。 結果 經鑒定所培養細胞符合 ADSCs 的特征。ADSC-Exos 為形態一致的圓形或橢圓形膜性囊泡，表達標志性蛋白 Alix 和 CD63，粒徑范圍 30～200 nm。共聚焦顯微鏡觀察示 ADSC-Exos 可被 HUVECs 攝取。CCK-8 法檢測示，各時間點實驗組細胞增殖均優于對照組（P<0.05）。Transwell 實驗結果顯示，實驗組跨膜遷移細胞數較對照組顯著增多（t=9.534，P=0.000）。在體外 Matrigel 膠成管實驗中，實驗組管樣結構數明顯多于對照組（t=15.910，P=0.000）；在體內實驗中，實驗組 MVD 亦顯著高于對照組（t=16.710，P=0.000）。ELISA 檢測示，實驗組細胞上清液 VEGF 蛋白表達量明顯高于對照組（t=21.470，P=0.000）。 結論 ADSC-Exos 可促進 HUVECs 增殖、遷移及管樣結構形成，提示 ADSC-Exos 可促進血管新生。
目的探討循環雌激素水平對裸鼠顆粒脂肪移植轉歸的影響。方法取 6～8 周齡雌性裸鼠 18 只（體質量 20～25 g），隨機分為 3 組（n=6）。去勢組采用卵巢切除術制備去勢裸鼠模型，高雌激素組及正常雌激素組僅作相同切口進入腹膜后，不切除卵巢組織。術后高雌激素組每 3 天灌胃雌二醇（0.2 mg/g）1 次，共持續 30 d；其他兩組同時間點等量 PBS 灌胃。術后 30 d 取 3 組裸鼠尾靜脈血經 ELISA 檢測雌二醇濃度后，將接受抽脂術的健康女性捐贈的顆粒脂肪注入裸鼠頭皮下（0.3 mL/只）。脂肪移植后 8 周取材大體觀察、稱重后，制備切片行 HE 染色、CD31-圍脂滴蛋白熒光染色、解耦聯蛋白 1（uncoupling protein 1，UCP1）免疫組織化學染色和雌激素受體 α 免疫熒光染色，測量脂肪細胞直徑及脂肪組織血管密度；實時熒光定量 PCR 檢測 UCP1 和雌激素受體 α mRNA 表達。結果實驗期間裸鼠無死亡。ELISA 檢測顯示與正常雌激素組相比，去勢組雌二醇濃度明顯降低，高雌激素組明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。脂肪移植 8 周后，移植物體積從大到小依次為去勢組、正常雌激素組、高雌激素組，其中去勢組移植物濕重顯著高于高雌激素組（P<0.05）。組織學染色顯示，與正常雌激素組相比，去勢組脂肪細胞增大且圍脂滴蛋白表達較弱、血管密度減小，幾乎不表達脂肪標記物 UCP1，雌激素受體 α 陽性細胞減少；而高雌激素組上述觀察結果與去勢組相反；脂肪細胞直徑、血管密度及雌激素受體 α 陽性細胞組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。實時熒光定量 PCR 檢測顯示，與正常雌激素組相比，高雌激素組移植物 UCP1 和雌激素受體 α mRNA 相對表達量升高，而去勢組均降低；組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。結論體內循環雌激素水平對脂肪移植的轉歸有顯著影響。低雌激素水平導致移植物脂肪細胞肥大，高雌激素水平導致脂肪移植物中生成大量米色脂肪并伴隨血管密度增大，其機制可能與升高的循環雌激素水平活化脂肪細胞上雌激素受體 α 相關。
目的探討構建可注射型組織工程脂肪的可行性，為臨床軟組織缺損修復及美容填充提供簡便易行的方法。方法取脂肪抽吸術獲取的脂肪組織，采用酶消化法分離培養獲得人脂肪來源干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs），進行細胞形態觀察、流式細胞術及成脂誘導鑒定。用攜帶肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒 HGF-GFP-LVs，以不同感染復數（multiplicity of infection，MOI）（分別為 10、30、50、100）轉染 hADSCs，計算轉染效率以確定最適 MOI。取 SPF 級 6 周齡單純 T 細胞缺陷 BALB/c 雌性裸鼠 10 只，將經過最適 MOI HGF-GFP-LVs 轉染并成脂誘導的 hADSCs 與纖維蛋白膠混合注入裸鼠背部右側皮下（轉染組），單純成脂誘導的 hADSCs 與纖維蛋白膠混合注入背部左側皮下（未轉染組），單純纖維蛋白膠注入頸后正中皮下（空白對照組），每點注射 0.4 mL。移植后 12 周處死裸鼠，取出移植物，行大體觀察、濕重測量、HE 染色、GFP 熒光標記檢測及免疫熒光染色觀察，評價種子細胞的體內成脂能力以及移植物血管新生情況。結果經鑒定所培養細胞為 hADSCs。MOI 為10 和 30 時 HGF-GFP-LVs 轉染率較低，MOI 為50 和 100 時轉染率較高（均>80%），確定最適 MOI 為 50。移植 12 周，轉染組和未轉染組均獲得外觀類似脂肪組織的新生物，濕重分別為（32.30±4.06）mg 和（25.27±3.94）mg，差異有統計學意義（t=3.929，P=0.001）；空白對照組未見新生物。轉染組新生脂肪細胞數為（126.93±5.36）個/視野，顯著高于未轉染組的（71.36±4.52）個/視野（t=30.700，P=0.000）。熒光顯微鏡下可見部分單房脂肪細胞發出網狀綠色熒光。免疫熒光染色示轉染組血管密度為（16.37±2.76）個/視野，顯著高于未轉染組的（9.13±1.68）個/視野（t=8.678，P=0.000）。結論以 hADSCs 為種子細胞，經慢病毒轉染 HGF 基因并成脂誘導后與纖維蛋白膠支架復合可在體內成功構建成熟脂肪，能促進移植后的血管新生，從而提高移植物的存活率。
目的探討脂肪干細胞來源外泌體（adipose-derived stem cell derived exosomes，ADSC-Exos）對大鼠皮瓣移植后血管新生的影響。方法取抽脂術患者自愿捐贈脂肪組織，采用酶消化法分離培養 ADSCs；取第 3 代細胞光鏡觀察形態，流式細胞術鑒定細胞表面標志物，成脂誘導培養 14 d 后油紅 O 染色觀察。細胞鑒定為 ADSCs 后，采用密度梯度離心法提取 ADSC-Exos；透射電鏡觀察形態，Western blot 檢測膜表面標志蛋白（CD63、TSG101），納米顆粒跟蹤分析儀測量其粒徑分布。取 20 只雄性 SD 大鼠，體質量 250～300 g，隨機分為 ADSC-Exos 組和 PBS 組，每組 10 只。兩組大鼠背部沿長軸方向制作面積為 9 cm×3 cm 隨意皮瓣后，分別于近端、中間和遠端區域注射 ADSC-Exos（ADSC-Exos 組）或 PBS（PBS 組）。術后大體觀察皮瓣成活情況，第 7 天測算皮瓣成活率后切取皮瓣組織，HE 染色觀察組織形態，CD31 免疫組織化學染色測定皮瓣微血管密度（mean blood vessel density，MVD）。結果光鏡、流式細胞術及成脂誘導培養鑒定培養細胞為 ADSCs。ADSC-Exos 為邊緣清晰、大小形態均勻的圓形或橢圓形膜性囊泡，高表達標志蛋白 CD63 和 TSG101，粒徑分布在 30～200 nm，符合外泌體粒徑范圍。術后兩組皮瓣遠端均出現不同程度壞死表現，但 ADSC-Exos 組程度較 PBS 組輕；第 7 天 ADSC-Exos 組皮瓣成活率為 64.2%±11.5%，顯著大于 PBS 組的 31.0%±6.6%（t=7.945，P=0.000）；中間區域皮膚附屬器官更完整，近端區域組織水腫程度輕、血管擴張更多。ADSC-Exos 組 MVD 為（103.3±27.0）個/視野，顯著多于 PBS 組（45.3±16.2）個/視野（t=3.190，P=0.011）。結論ADSC-Exos 可通過促進皮瓣移植后新生血管的形成，改善皮瓣血供，進而提高大鼠皮瓣成活率。
目的探討脂肪干細胞來源外泌體（adipose-derived stem cell released exosomes，ADSC-Exos）對糖尿病小鼠創面愈合的影響。方法取患者自愿捐贈脂肪組織，采用酶消化法分離培養 ADSCs，并于第 3 代細胞上清液提取 Exos（ADSC-Exos）；透射電鏡觀察 ADSC-Exos 形態，Western blot 檢測膜表面標志性蛋白 Alix、CD63，納米顆粒跟蹤分析儀檢測粒徑分布。取患者自愿捐贈皮膚組織，采用酶消化法分離培養成纖維細胞。將 PKH26 標記的 ADSC-Exos 與第 5 代成纖維細胞培養，共聚焦熒光顯微鏡觀察其能否進入細胞，采用細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8， CCK-8）及劃痕法觀察 ADSC-Exos 對成纖維細胞增殖及遷移的影響。取 24 只 8 周齡 Balb/c 雄性小鼠制備糖尿病模型后，背部制備直徑 8 mm 全層皮膚缺損創面，實驗組（n=12）及對照組（n=12）創面真皮層分別注射 0.2 mL ADSC-Exos 及 PBS。第 1、4、7、11、16、21 天大體觀察創面愈合情況，計算創面愈合率；第 7、14、21 天取材，行組織學（HE 及 Masson）及 CD31 免疫組織化學染色，觀察創面結構、膠原纖維及新生血管情況。結果ADSC-Exos 為邊緣清晰、大小分布均勻的膜性囊泡；粒徑為 40～200 nm，平均 102.1 nm；膜表面標志性蛋白 Alix、CD63 均呈陽性。ADSC-Exos 與成纖維細胞復合培養觀察示，ADSC-Exos 可進入成纖維細胞胞內，并能促進成纖維細胞增殖及遷移。動物實驗顯示，實驗組小鼠背部創面愈合明顯快于對照組，各時間點創面愈合率差異均有統計學意義（P<0.05）。與對照組比較，實驗組創面結構愈合更好，愈合前期新生微血管更多，愈合后期膠原纖維沉積更多；其中，第 7、14、21 天創面缺損長度，第 7、14 天微血管數量，第 14、21 天膠原纖維沉積百分比，組間差異均有統計學意義（P<0.05）。結論ADSC-Exos 通過促進創面血管新生以及成纖維細胞增殖、遷移和膠原合成來促進糖尿病小鼠創面愈合。