引用本文： 聶佳瑩, 易陽艷, 朱元正. 人脂肪源細胞外囊泡聯合脫細胞脂肪組織支架構建組織工程脂肪. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(2): 226-233. doi: 10.7507/1002-1892.201903064 復制
脂肪移植已廣泛應用于美容整形外科和重建外科[1-2]，但存在移植后重吸收和成活率不高等缺陷[3-4]。因此，急需一種新的方式支持脂肪組織長期生長。近年來研究發現，使用生物材料搭載細胞或生長因子可促進脂肪組織在體內再生[5]。常見的生物材料有天然生物聚合物，如膠原蛋白、透明質酸等[6-7]，以及合成聚合物，如聚乙二醇、聚乙醇酸等[8-9]。然而，由于這些材料存在吸附、細胞相容性差、脂肪組織生成過少、異物反應等問題，阻礙了在臨床上的廣泛應用[10]。
脂肪組織細胞外基質與 MSCs 具有密切的相互作用，并且能影響 MSCs 體內外增殖、遷移和譜系分化[11]。因此，將脂肪組織細胞外基質衍生的支架材料應用于脂肪組織工程，具有促進脂肪組織再生的作用[12-13]。脫細胞脂肪組織支架（decellularized adipose tissues，DAT）有效保留了原始脂肪組織的三維結構、力學性質和生物環境[14]，具有天然的脂肪誘導特性，能促進脂肪組織生成。基于以上優點，DAT 已在脂肪組織工程中得到了廣泛研究，制備出多種類型的支架，如微載體[15]、水凝膠[10]和珠泡[16]等，并已在動物體內進行了實驗。然而 DAT 在誘導成脂方面效果并非十分理想[15, 17]；同時，DAT 在體內的長期生長和穩定性仍有待研究[15]。
細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是 MSCs 和靶細胞間溝通的關鍵工具，通過將與母細胞相似的生物活性物質（如蛋白質、生物活性磷脂和 RNA）攜帶至靶細胞而發揮通訊功能[18]。Kelly 等[19]研究發現，脂肪組織可以在無 MSCs 情況下誘導脂肪組織生成，但具體誘導脂肪新生的成分和機制仍不清楚。Dai 等[20]研究發現人脂肪源 EV（human adipose tissue derived EV，hAT-EV）可以誘導脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）成脂分化，并促進主動脈內皮細胞增殖、遷移和血管生成。因此，我們通過研究 hAT-EV 在體外對 ADSCs 成脂分化的影響，以及在小鼠體內誘導 DAT 脂肪生成的影響，探討其能否達到改善 DAT 體內成脂不足的目的。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6 周齡雌性 C57 小鼠 8 只，體質量（25±5）g，購自南昌大學實驗動物中心。人體脂肪取自南昌大學第二附屬醫院整形外科行腹部負壓吸脂術的健康女性患者，樣本獲取均經患者知情同意。
DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ 型膠原酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、油紅 O 染色劑、核酸酶（Sigma 公司，美國）；BCA 蛋白質定量試劑盒、兔抗人 Ⅰ 型膠原、Ⅳ 型膠原、層粘連蛋白、CD63、凋亡誘導因子 6 相互作用蛋白抗體（apoptosis-inducible factor 6 interacting protein antibody，Alix）、腫瘤易感基因 101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、辣根過氧物化酶標記的山羊抗兔 IgG（Abcam 公司，美國）。倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；CO2 培養箱、離心機（Thermo 公司，美國）；透射電鏡（Zeiss 公司，德國）；納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight（Malvern 公司，英國）；共聚焦熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；超高速離心機（Beckman 公司，美國）；掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；0.22 μm 孔隙過濾膜（Millipore 公司，美國）。
1.2 hAT-EV 獲取和鑒定
1.2.1 hAT-EV 獲取
采用超高速離心法獲取 hAT-EV[21]。具體方法：取 10 mL 新鮮脂肪組織，置于 30 mL 去除外泌體的完全培養基（含 1% 雙抗、10%FBS 的 DMEM 培養基），于 37℃、5%CO2 細胞培養箱孵育 48 h；以 1 500×g 離心 5 min，收集上清培養液，再以 1 500×g 離心 10 min、3 000×g 離心 20 min、10 000×g 離心 30 min 去除細胞碎片；用 0.22 μm 孔隙過濾膜過濾去除大膜囊泡，4℃ 采用超速離心機以 100 000×g、離心 90 min；去除上層液體，用 1 mL PBS 液重懸，再次4℃ 以 100 000×g、 離心 60 min；去除上層液體，使用 100 μL PBS 液重懸。將獲取的 hAT-EV 經 BCA 試劑盒檢測蛋白濃度后，置于–80℃ 保存備用。
1.2.2 hAT-EV 鑒定
① 透射電鏡觀察 hAT-EV 形態：取 hAT-EV 10 μL 滴于透射電鏡專用的載樣銅網上，常溫靜置 2 min，濾紙吸去浮液，用 1%（W/V）磷鎢酸溶液染色 5 min 后，濾紙吸去多余染色液，晾干，透射電鏡觀察 hAT-EV 形態。② hAT-EV 粒徑分布分析：取濃度為 50 μg/mL 的 hAT-EV 100 μL 重懸于 1.5 mL PBS 內，經納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 進行檢測。③ Western blot 檢測 hAT-EV 的膜蛋白：取 hAT-EV 總蛋白質裂解液，使用 BCA 蛋白測定法估計蛋白濃度。采用 NuPage 電泳系統對蛋白提取物進行 SDS-PAGE 電泳，然后轉移固定至聚偏二氟乙烯膜上；分別加入兔抗人 CD63、TSG 101、Alix 一抗（1∶200）孵育過夜。然后加入二抗室溫孵育 1 h，加入顯影液，上機曝光。以脂肪組織作為對照，檢測方法同上。
1.3 ADSCs 分離培養
按本課題組前期研究方案[22]分離 ADSCs并傳代[15-16]。具體方法：無菌條件下采集吸脂術獲得的游離脂肪組織 10 mL，PBS 沖洗 3 次去除血液、結締組織后，加入等體積 0.2% Ⅰ 型膠原酶，置于 37℃ 恒溫水浴箱消化，直至變為糊狀。以 1 200×g 離心 5 min，棄上清，保留最下層沉淀。完全培養基重懸沉淀后接種于培養瓶內，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，48 h 后首次換液，之后每隔 24 h 換液，待細胞融合至 90% 后傳代。
1.4 hAT-EV 與 ADSCs 共培養觀察
1.4.1 hAT-EV 能否進入 ADSCs 觀察
取濃度為 50 μg/mL hAT-EV 備用液 100 μL，重懸于 1 mL PBS 內，加入 4 μL PKH26 熒光染料溶液，37℃、5%CO2 孵育 20 min；將混合物于 4℃ 以 100 000×g 離心 70 min，棄上清液，并將 hAT-EV 輕輕重懸于 10 mL PBS 中；4℃、100 000×g 離心 70 min 去除多余染料，棄上清液，將 hAT-EV 重懸于 100 μL PBS 中備用。取第 2 代 ADSCs 重懸于無血清培養基中，置于 37℃、5%CO2 培養箱，待細胞貼壁后加入上述 PKH26 熒光標記的 hAT-EV，孵育 24 h 后采用 PBS 洗滌細胞 2 次，4% 多聚甲醛固定、DAPI 染色。共聚焦熒光顯微鏡下觀察 hAT-EV 是否進入細胞，鏡下 PKH26 熒光標記的 hAT-EV 呈紅色熒光。
1.4.2 hAT-EV 誘導 ADSCs 成脂分化作用評價
取第 3 代 ADSCs，以 5×105個/孔濃度接種至 6 孔板。實驗分為 3 組，分別為陰性對照組、陽性對照組和實驗組。陰性對照組采用單純完全培養基培養；陽性對照組采用成脂誘導培養基（含 10%FBS、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IMBX、10 μmol/L 胰島素、200 μmol/L 吲哚美辛的 DMEM 培養基）培養；實驗組采用添加 50 μg/mL hAT-EV 的完全培養基培養。每隔 3 d 換液，第 15 天行油紅 O 染色觀察。每張切片隨機選取 5 個油紅 O 染色表達區域的視野，通過 Image J 軟件計算油紅 O 染色陽性脂滴的密度。
1.5 DAT 制備及表征
1.5.1 DAT 制備
取吸脂術獲取的游離脂肪組織 100 mL，以 1 000×g 離心 5 min 后保留下層脂肪組織，棄中層液體和上層油脂；使用勻漿機將脂肪組織與等體積 PBS 以 12 000 r/min 勻漿 10 min；將勻漿后的樣品在 37～?80℃ 反復凍融 3 次，每次凍融時間約 1 h；將凍融后的脂肪組織以 3 000×g離心 10 min，棄上層油脂和液體并收集白色沉淀。按 Flynn 等[14]無洗滌劑方案對白色沉淀物進行脫細胞處理，具體方法：將白色沉淀物孵化于 0.05% 胰蛋白酶中，放入 37℃ 恒溫水浴鍋消化 16 h 并不斷攪拌；然后將白色沉淀物在 99.9% 異丙醇溶液中萃取 18 h 去除脂質；然后使用核酸酶（包括 500 U/mL DNase TypeⅠ和 1 mg/mL RNase）孵化過夜處理；用 99.9% 異丙醇溶液萃取 6 h，棄剩余脂質；最后用 70% 乙醇消毒 4 h。以上每個步驟結束后樣品均使用 PBS 液至少清洗 3 遍。將獲得的 DAT 樣品一部分進行表征檢測，剩余 DAT 樣品冷凍干燥儲存備用。
1.5.2 組織學觀察
DAT 樣品用 4% 多聚甲醛固定、石蠟包埋，5 μm 厚切片，常規行 HE 染色和 Masson 染色觀察。
1.5.3 掃描電鏡觀察
DAT 樣品于 2.5% 戊二醛溶液固定 4 h，梯度乙醇脫水處理后臨界點干燥，涂覆金，掃描電鏡下觀察 DAT 微觀結構。
1.5.4 免疫組織化學染色觀察
DAT 樣品經石蠟包埋、10 μm 厚切片后，脫石蠟并用甲醇和丙酮固定；室溫下用 2% 牛血清白蛋白、0.1%Triton X-100 和 1×PBS 溶液封閉 45 min；加入兔抗人 Ⅰ 型膠原（1∶200）、Ⅳ 型膠原（1∶200）、層粘連蛋白一抗（1∶200），4℃ 潮濕環境孵育過夜；PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔熒光二抗 IgG，4℃ 潮濕環境孵育 1 h；PBS 沖洗切片，DAPI 封固劑固定，共聚焦熒光顯微鏡觀察。
1.5.5 Western blot 檢測
取 DAT 總蛋白質裂解液，使用 BCA 蛋白測定法估計蛋白濃度；采用 NuPage 電泳系統對蛋白提取物進行 SDS-PAGE 電泳，然后轉移固定至聚偏二氟乙烯膜上；分別加入兔抗人 Ⅰ 型膠原（1∶200）、Ⅳ 型膠原（1∶200）、層粘連蛋白一抗（1∶200），再加入二抗室溫孵育 1 h，加入顯影液，上機曝光。通過 Image J 軟件半定量分析各蛋白相對灰度值。
1.6 hAT-EV 對 DAT 體內成脂的影響
1.6.1 實驗分組及方法
無菌條件下將 DAT 剪碎至小米粒大小。取 C57 小鼠 8 只，以 1.5% 戊巴比妥腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，使用 18 號針分別將 DAT 點狀注射至小鼠雙側背部皮下，每側注射 0.3 mL。左側為實驗組，每周注射 0.2 mL、50 μg/mL hAT-EV 至 DAT 內；右側為對照組，每周注射等量 PBS 液。
1.6.2 大體觀察及濕重檢測
于 12 周處死小鼠，從周圍組織中分離 DAT，大體觀察外觀；使用電子天平稱量 DAT 新生物濕重。
1.6.3 組織學及免疫組織化學染色
取 DAT 樣本，4% 多聚甲醛固定后冰凍切片，片厚 10 μm，常規行 HE 染色和圍脂滴蛋白免疫熒光染色[20]，共聚焦熒光顯微鏡觀察新生組織中細胞和纖維分布。隨機選取 5 個高倍鏡（×400）視野，采用 Image J 軟件計算圍脂滴蛋白熒光面積，用以表示新生物中脂肪組織比例，從而評估 hAT-EV 在體內誘導脂肪新生的能力。
1.7 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用配對 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hAT-EV 的鑒定
透射電鏡觀察示，hAT-EV 呈雙層包膜的球形。納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 檢測結果顯示，97.9% 的 hAT-EV 粒徑為 32.67～220.20 nm，峰值為 91.28 nm。Western blot 檢測示 hAT-EV 高表達 CD63、TSG101 和 Alix，不表達細胞骨架蛋白 β-actin；而脂肪組織高表達 β-actin，低表達 CD63、TSG101 和 Alix。見圖 1。
圖1
hAT-EV 鑒定
a. 透射電鏡觀察（×25 k）；b. 納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 檢測；c. Western blot 檢測 1：hAT-EV 2：脂肪組織
Figure1. Identification of hAT-EVa. Transmission electron microscope observation (×25 k); b. Nanoparticles tracking analyzer NanoSight detection; c. Western blot detection 1：hAT-EV 2: Adipose tissue
2.2 hAT-EV 與 ADSCs 共培養觀察
2.2.1 hAT-EV 能否進入 ADSCs 觀察
共聚焦熒光顯微鏡觀察示，PKH26 標記的 hAT-EV 被 ADSCs 攝取并分布于細胞核周圍，表明 hAT-EV 可進入 ADSCs。見圖 2a。
圖2
hAT-EV 與 ADSCs 共培養觀察
a. 共聚焦熒光顯微鏡觀察（×400）；b. 油紅 O 染色觀察（×400） 從左至右依次為陰性對照組、陽性對照組和實驗組
Figure2. Observation on co-culture of hAT-EV and ADSCsa. Confocal fluorescence microscope observation (×400); b. Oil red O staining observation (×400) From left to right for negative control group, positive control group, and experimental group, respectively
2.2.2 hAT-EV 誘導 ADSCs 成脂分化作用評價
油紅 O 染色示，陰性對照組、陽性對照組、實驗組油紅 O 染色陽性脂滴的密度分別為 0.05±0.01、0.18±0.02、0.12±0.03，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2b。
2.3 DAT 表征
① 大體觀察：脂肪組織經脫細胞處理后由黃色變成白色。② 組織學觀察：HE 染色示，經脫細胞處理后，DAT 中無細胞和細胞碎片；Masson 染色示 DAT 主要成分為膠原蛋白。③ 掃描電鏡觀察：脂肪組織經脫細胞處理后，細胞外基質中未發現細胞和細胞碎片存在，同時可見粗大膠原纖維束。④ 免疫組織化學染色觀察：DAT 中可見 Ⅰ 型膠原、Ⅳ 型膠原和層粘連蛋白陽性表達。⑤ Western blot 檢測：DAT 中 Ⅰ 型膠原、Ⅳ 型膠原和層粘連蛋白呈陽性表達，相對灰度值分別為 1.12±0.08、1.04±0.02、0.89±0.04。見圖 3。
圖3
DAT 表征
a. 大體觀察；b. HE 染色觀察（×400）；c. Masson 染色觀察（×400）；d. 掃描電鏡觀察（×2 000）；e. Ⅰ 型膠原免疫組織化學染色觀察（×400）；f. Ⅳ 型膠原免疫組織化學染色觀察（×400）；g. 層粘連蛋白免疫組織化學染色觀察（×400）；h. Western blot 檢測
Figure3. Characterization of DATa. General observation; b. HE staining observation (×400); c. Masson staining observation (×400); d. SEM observation (×2 000); e. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅰ (×400); f. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅳ（×400); g. Immunohistochemical staining of laminin (×400); h. Western blot detection
2.4 hAT-EV 對 DAT 體內成脂的影響
① 大體觀察兩組均可見黃色 DAT 樣本，實驗組 DAT 新生物濕重為（0.76±0.21）g，顯著高于對照組的（0.52±0.15）g，差異有統計學意義（t=2.278，P=0.048）。② HE 染色示，實驗組圓形脂滴結構比對照組多，對照組膠原含量高于實驗組；兩組均無明顯炎性細胞浸潤和壞死。③ 圍脂滴蛋白免疫熒光染色示，對照組新生脂肪組織僅生長在 DAT 外周，而實驗組新生脂肪組織生長在 DAT 外周和內部。高倍鏡下實驗組 DAT 新生物中脂肪組織比例為 13.02%±5.24%，高于對照組的 8.12%±4.38%，差異有統計學意義（t=4.648，P=0.017）。見圖 4。
圖4
hAT-EV 聯合 DAT 在 C57 小鼠皮下構建組織工程脂肪觀測
從左至右分別為實驗組、對照組 a. 大體觀察（箭頭示 DAT）；b. HE 染色觀察（×400）；c. 圍脂滴蛋白免疫熒光染色觀察（共聚焦熒光顯微鏡×50）；d. 圍脂滴蛋白免疫熒光染色觀察（共聚焦熒光顯微鏡×400）
Figure4. Observation on the subcutaneous construction of tissue engineered fat in C57 mice with hAT-EV and DATFrom left to right for experimental group and control group，respectively a. General observation (Arrow indicated DAT); b. HE staining observation (×400); c. Immunofluorescence staining of peri-lipoprotein (Confocal fluorescence microscope×50); d. Immunofluorescence staining of peri-lipoprotein (Confocal fluorescence microscope×400)
3 討論
DAT 是近年發展起來的一種新型支架材料，在脂肪組織工程中具有廣闊應用前景。與合成或天然生物聚合物支架相比，DAT 的主要優勢是具備天然的脂肪誘導特性——可以誘導 MSCs 成脂分化[14-15]；此外，由于脂肪組織具有來源豐富、獲取簡便的優點，使得 DAT 的原材料比其他組織細胞外基質的原材料更易獲取[23]；最后，應用自體 DAT 還可以避免動物源性支架，如牛或豬膠原蛋白潛在的免疫反應和異種疾病傳播風險[24]。盡管 DAT 有諸多優點，但既往研究表明，將 DAT 或 DAT 搭載 ADSCs 植入小鼠體內，未誘導生成足夠的脂肪組織[15]。引起脂肪組織生成不足的原因可能是體內血管組織缺乏或誘導脂肪組織新生的生長因子不足[25]。同時，在體內 DAT 和新生脂肪組織的長期穩定性仍有待明確。
因此，在本研究中我們采用了一種新方案誘導脂肪組織生成——DAT 搭載 hAT-EV。DAT 組織學觀察顯示，經過脫細胞處理后脂肪組織達到了徹底脫細胞和保留天然細胞外基質的目的。其中，細胞外基質蛋白對于維持脂肪細胞的結構完整至關重要，同時對脂肪組織的發育和生長也發揮重要作用[26-27]。異丙醇作為脂肪組織脫細胞常用有機溶劑，可以有效去除油脂，但同時也會導致細胞外基質蛋白沉淀，從而破壞細胞外基質蛋白成分[28-30]。本實驗脫細胞前先使用勻漿機處理脂肪組織 30 min，再放入?80℃ 冰箱過夜，可以最大程度去除脂肪組織油脂，減少異丙醇處理時間，同時也能減少 DAT 中毒性化學物質殘留。掃描電鏡和 Masson 染色顯示，DAT 中網狀膠原保存良好；免疫組織化學染色和 Western blot 結果顯示，DAT 中含有豐富 Ⅰ、Ⅳ 型膠原蛋白和層粘連蛋白。這些蛋白是脂肪組織基底膜的主要成分，膠原蛋白網可為脂肪組織中細胞提供結構支持[31]，而層粘連蛋白可影響細胞活動，如細胞黏附、遷移和分化[32-34]。以上結果表明我們成功制備 DAT。
Dai 等[20]研究發現，脂肪組織上清液可以誘導 ADSCs 成脂分化，并促進主動脈內皮細胞增殖、遷移和血管生成，從而促進脂肪組織生成。Kato 等[28]也發現從脂肪組織提取的 EV 可誘導脂肪生成。本研究中，我們采用超高速離心法從脂肪組織上清液中獲取 hAT-EV。在體外實驗中，將 PKH26 熒光標記的 hAT-EV 與 ADSCs 共培養后發現， hAT-EV 可以被 ADSCs 攝取并促進 ADSCs 成脂分化；在體內實驗中，通過對比 DAT 新生物濕重、HE 染色和圍脂滴蛋白免疫熒光染色結果發現，hAT-EV 具有成脂誘導功能，在體內聯合 DAT 可構建脂肪細胞密度更高的組織工程脂肪。研究表明，移植物的脂肪生成和體積在 12 周后趨于穩定[28]，并且在之后的 1 年內移植物體積僅有輕微減少[12]。因此，我們選定 12 周取材來評估新生物的成脂效果。12 周時，通過 HE 染色和圍脂滴蛋白免疫熒光染色分析表明，DAT 搭載 hAT-EV 構建的組織工程脂肪中脂肪細胞密度更高；并且與其他 DAT 誘導脂肪再生的研究[15-16]相比，hAT-EV 顯著提高了 DAT 新生物濕重。值得注意的是，對比圍脂滴蛋白免疫熒光染色我們發現，經 hAT-EV 作用后 DAT 新生物中心可見脂肪組織，而對照組僅在 DAT 新生物外周有脂肪組織生長。因此，我們推測 hAT-EV 可能具有驅化脂肪前體細胞的能力，這一結論我們將在后續研究中進一步論證。此外，限制組織工程脂肪應用的主要原因除了脂肪再生困難外，如何促進新生物在移植早期快速再血管化也是當前研究瓶頸。血管再生是脂肪再生的前提條件[35-36]，因此發現一種既可以促進血管新生又可以誘導脂肪再生的物質十分重要。本研究僅觀察了 hAT-EV 的成脂效果，我們將在后續研究中進一步探討 hAT-EV 成血管作用。
綜上述，通過本研究我們發現 hAT-EV 在體內、外均可促進脂肪新生，DAT 搭載 hAT-EV 可作為一種誘導脂肪組織新生的新方法，在軟組織缺損修復領域具有潛在應用前景。
作者貢獻：聶佳瑩參與實驗設計及實施，數據收集整理及統計分析，文章起草；易陽艷參與實驗設計、對文章的知識性內容作批評性審閱；朱元正參與實驗設計及實施，數據收集整理及統計分析，對文章的知識性內容作批評性審閱
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經南昌大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準［2018 第（025）號］。所有動物實驗均經南昌大學第二附屬醫院實驗動物倫理委員會批準，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）2015-0001。
脂肪移植已廣泛應用于美容整形外科和重建外科[1-2]，但存在移植后重吸收和成活率不高等缺陷[3-4]。因此，急需一種新的方式支持脂肪組織長期生長。近年來研究發現，使用生物材料搭載細胞或生長因子可促進脂肪組織在體內再生[5]。常見的生物材料有天然生物聚合物，如膠原蛋白、透明質酸等[6-7]，以及合成聚合物，如聚乙二醇、聚乙醇酸等[8-9]。然而，由于這些材料存在吸附、細胞相容性差、脂肪組織生成過少、異物反應等問題，阻礙了在臨床上的廣泛應用[10]。
脂肪組織細胞外基質與 MSCs 具有密切的相互作用，并且能影響 MSCs 體內外增殖、遷移和譜系分化[11]。因此，將脂肪組織細胞外基質衍生的支架材料應用于脂肪組織工程，具有促進脂肪組織再生的作用[12-13]。脫細胞脂肪組織支架（decellularized adipose tissues，DAT）有效保留了原始脂肪組織的三維結構、力學性質和生物環境[14]，具有天然的脂肪誘導特性，能促進脂肪組織生成。基于以上優點，DAT 已在脂肪組織工程中得到了廣泛研究，制備出多種類型的支架，如微載體[15]、水凝膠[10]和珠泡[16]等，并已在動物體內進行了實驗。然而 DAT 在誘導成脂方面效果并非十分理想[15, 17]；同時，DAT 在體內的長期生長和穩定性仍有待研究[15]。
細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是 MSCs 和靶細胞間溝通的關鍵工具，通過將與母細胞相似的生物活性物質（如蛋白質、生物活性磷脂和 RNA）攜帶至靶細胞而發揮通訊功能[18]。Kelly 等[19]研究發現，脂肪組織可以在無 MSCs 情況下誘導脂肪組織生成，但具體誘導脂肪新生的成分和機制仍不清楚。Dai 等[20]研究發現人脂肪源 EV（human adipose tissue derived EV，hAT-EV）可以誘導脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）成脂分化，并促進主動脈內皮細胞增殖、遷移和血管生成。因此，我們通過研究 hAT-EV 在體外對 ADSCs 成脂分化的影響，以及在小鼠體內誘導 DAT 脂肪生成的影響，探討其能否達到改善 DAT 體內成脂不足的目的。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6 周齡雌性 C57 小鼠 8 只，體質量（25±5）g，購自南昌大學實驗動物中心。人體脂肪取自南昌大學第二附屬醫院整形外科行腹部負壓吸脂術的健康女性患者，樣本獲取均經患者知情同意。
DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ 型膠原酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、油紅 O 染色劑、核酸酶（Sigma 公司，美國）；BCA 蛋白質定量試劑盒、兔抗人 Ⅰ 型膠原、Ⅳ 型膠原、層粘連蛋白、CD63、凋亡誘導因子 6 相互作用蛋白抗體（apoptosis-inducible factor 6 interacting protein antibody，Alix）、腫瘤易感基因 101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、辣根過氧物化酶標記的山羊抗兔 IgG（Abcam 公司，美國）。倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；CO2 培養箱、離心機（Thermo 公司，美國）；透射電鏡（Zeiss 公司，德國）；納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight（Malvern 公司，英國）；共聚焦熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；超高速離心機（Beckman 公司，美國）；掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；0.22 μm 孔隙過濾膜（Millipore 公司，美國）。
1.2 hAT-EV 獲取和鑒定
1.2.1 hAT-EV 獲取
采用超高速離心法獲取 hAT-EV[21]。具體方法：取 10 mL 新鮮脂肪組織，置于 30 mL 去除外泌體的完全培養基（含 1% 雙抗、10%FBS 的 DMEM 培養基），于 37℃、5%CO2 細胞培養箱孵育 48 h；以 1 500×g 離心 5 min，收集上清培養液，再以 1 500×g 離心 10 min、3 000×g 離心 20 min、10 000×g 離心 30 min 去除細胞碎片；用 0.22 μm 孔隙過濾膜過濾去除大膜囊泡，4℃ 采用超速離心機以 100 000×g、離心 90 min；去除上層液體，用 1 mL PBS 液重懸，再次4℃ 以 100 000×g、 離心 60 min；去除上層液體，使用 100 μL PBS 液重懸。將獲取的 hAT-EV 經 BCA 試劑盒檢測蛋白濃度后，置于–80℃ 保存備用。
1.2.2 hAT-EV 鑒定
① 透射電鏡觀察 hAT-EV 形態：取 hAT-EV 10 μL 滴于透射電鏡專用的載樣銅網上，常溫靜置 2 min，濾紙吸去浮液，用 1%（W/V）磷鎢酸溶液染色 5 min 后，濾紙吸去多余染色液，晾干，透射電鏡觀察 hAT-EV 形態。② hAT-EV 粒徑分布分析：取濃度為 50 μg/mL 的 hAT-EV 100 μL 重懸于 1.5 mL PBS 內，經納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 進行檢測。③ Western blot 檢測 hAT-EV 的膜蛋白：取 hAT-EV 總蛋白質裂解液，使用 BCA 蛋白測定法估計蛋白濃度。采用 NuPage 電泳系統對蛋白提取物進行 SDS-PAGE 電泳，然后轉移固定至聚偏二氟乙烯膜上；分別加入兔抗人 CD63、TSG 101、Alix 一抗（1∶200）孵育過夜。然后加入二抗室溫孵育 1 h，加入顯影液，上機曝光。以脂肪組織作為對照，檢測方法同上。
1.3 ADSCs 分離培養
按本課題組前期研究方案[22]分離 ADSCs并傳代[15-16]。具體方法：無菌條件下采集吸脂術獲得的游離脂肪組織 10 mL，PBS 沖洗 3 次去除血液、結締組織后，加入等體積 0.2% Ⅰ 型膠原酶，置于 37℃ 恒溫水浴箱消化，直至變為糊狀。以 1 200×g 離心 5 min，棄上清，保留最下層沉淀。完全培養基重懸沉淀后接種于培養瓶內，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，48 h 后首次換液，之后每隔 24 h 換液，待細胞融合至 90% 后傳代。
1.4 hAT-EV 與 ADSCs 共培養觀察
1.4.1 hAT-EV 能否進入 ADSCs 觀察
取濃度為 50 μg/mL hAT-EV 備用液 100 μL，重懸于 1 mL PBS 內，加入 4 μL PKH26 熒光染料溶液，37℃、5%CO2 孵育 20 min；將混合物于 4℃ 以 100 000×g 離心 70 min，棄上清液，并將 hAT-EV 輕輕重懸于 10 mL PBS 中；4℃、100 000×g 離心 70 min 去除多余染料，棄上清液，將 hAT-EV 重懸于 100 μL PBS 中備用。取第 2 代 ADSCs 重懸于無血清培養基中，置于 37℃、5%CO2 培養箱，待細胞貼壁后加入上述 PKH26 熒光標記的 hAT-EV，孵育 24 h 后采用 PBS 洗滌細胞 2 次，4% 多聚甲醛固定、DAPI 染色。共聚焦熒光顯微鏡下觀察 hAT-EV 是否進入細胞，鏡下 PKH26 熒光標記的 hAT-EV 呈紅色熒光。
1.4.2 hAT-EV 誘導 ADSCs 成脂分化作用評價
取第 3 代 ADSCs，以 5×105個/孔濃度接種至 6 孔板。實驗分為 3 組，分別為陰性對照組、陽性對照組和實驗組。陰性對照組采用單純完全培養基培養；陽性對照組采用成脂誘導培養基（含 10%FBS、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IMBX、10 μmol/L 胰島素、200 μmol/L 吲哚美辛的 DMEM 培養基）培養；實驗組采用添加 50 μg/mL hAT-EV 的完全培養基培養。每隔 3 d 換液，第 15 天行油紅 O 染色觀察。每張切片隨機選取 5 個油紅 O 染色表達區域的視野，通過 Image J 軟件計算油紅 O 染色陽性脂滴的密度。
1.5 DAT 制備及表征
1.5.1 DAT 制備
取吸脂術獲取的游離脂肪組織 100 mL，以 1 000×g 離心 5 min 后保留下層脂肪組織，棄中層液體和上層油脂；使用勻漿機將脂肪組織與等體積 PBS 以 12 000 r/min 勻漿 10 min；將勻漿后的樣品在 37～?80℃ 反復凍融 3 次，每次凍融時間約 1 h；將凍融后的脂肪組織以 3 000×g離心 10 min，棄上層油脂和液體并收集白色沉淀。按 Flynn 等[14]無洗滌劑方案對白色沉淀物進行脫細胞處理，具體方法：將白色沉淀物孵化于 0.05% 胰蛋白酶中，放入 37℃ 恒溫水浴鍋消化 16 h 并不斷攪拌；然后將白色沉淀物在 99.9% 異丙醇溶液中萃取 18 h 去除脂質；然后使用核酸酶（包括 500 U/mL DNase TypeⅠ和 1 mg/mL RNase）孵化過夜處理；用 99.9% 異丙醇溶液萃取 6 h，棄剩余脂質；最后用 70% 乙醇消毒 4 h。以上每個步驟結束后樣品均使用 PBS 液至少清洗 3 遍。將獲得的 DAT 樣品一部分進行表征檢測，剩余 DAT 樣品冷凍干燥儲存備用。
1.5.2 組織學觀察
DAT 樣品用 4% 多聚甲醛固定、石蠟包埋，5 μm 厚切片，常規行 HE 染色和 Masson 染色觀察。
1.5.3 掃描電鏡觀察
DAT 樣品于 2.5% 戊二醛溶液固定 4 h，梯度乙醇脫水處理后臨界點干燥，涂覆金，掃描電鏡下觀察 DAT 微觀結構。
1.5.4 免疫組織化學染色觀察
DAT 樣品經石蠟包埋、10 μm 厚切片后，脫石蠟并用甲醇和丙酮固定；室溫下用 2% 牛血清白蛋白、0.1%Triton X-100 和 1×PBS 溶液封閉 45 min；加入兔抗人 Ⅰ 型膠原（1∶200）、Ⅳ 型膠原（1∶200）、層粘連蛋白一抗（1∶200），4℃ 潮濕環境孵育過夜；PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔熒光二抗 IgG，4℃ 潮濕環境孵育 1 h；PBS 沖洗切片，DAPI 封固劑固定，共聚焦熒光顯微鏡觀察。
1.5.5 Western blot 檢測
取 DAT 總蛋白質裂解液，使用 BCA 蛋白測定法估計蛋白濃度；采用 NuPage 電泳系統對蛋白提取物進行 SDS-PAGE 電泳，然后轉移固定至聚偏二氟乙烯膜上；分別加入兔抗人 Ⅰ 型膠原（1∶200）、Ⅳ 型膠原（1∶200）、層粘連蛋白一抗（1∶200），再加入二抗室溫孵育 1 h，加入顯影液，上機曝光。通過 Image J 軟件半定量分析各蛋白相對灰度值。
1.6 hAT-EV 對 DAT 體內成脂的影響
1.6.1 實驗分組及方法
無菌條件下將 DAT 剪碎至小米粒大小。取 C57 小鼠 8 只，以 1.5% 戊巴比妥腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，使用 18 號針分別將 DAT 點狀注射至小鼠雙側背部皮下，每側注射 0.3 mL。左側為實驗組，每周注射 0.2 mL、50 μg/mL hAT-EV 至 DAT 內；右側為對照組，每周注射等量 PBS 液。
1.6.2 大體觀察及濕重檢測
于 12 周處死小鼠，從周圍組織中分離 DAT，大體觀察外觀；使用電子天平稱量 DAT 新生物濕重。
1.6.3 組織學及免疫組織化學染色
取 DAT 樣本，4% 多聚甲醛固定后冰凍切片，片厚 10 μm，常規行 HE 染色和圍脂滴蛋白免疫熒光染色[20]，共聚焦熒光顯微鏡觀察新生組織中細胞和纖維分布。隨機選取 5 個高倍鏡（×400）視野，采用 Image J 軟件計算圍脂滴蛋白熒光面積，用以表示新生物中脂肪組織比例，從而評估 hAT-EV 在體內誘導脂肪新生的能力。
1.7 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用配對 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hAT-EV 的鑒定
透射電鏡觀察示，hAT-EV 呈雙層包膜的球形。納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 檢測結果顯示，97.9% 的 hAT-EV 粒徑為 32.67～220.20 nm，峰值為 91.28 nm。Western blot 檢測示 hAT-EV 高表達 CD63、TSG101 和 Alix，不表達細胞骨架蛋白 β-actin；而脂肪組織高表達 β-actin，低表達 CD63、TSG101 和 Alix。見圖 1。
圖1
hAT-EV 鑒定
a. 透射電鏡觀察（×25 k）；b. 納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 檢測；c. Western blot 檢測 1：hAT-EV 2：脂肪組織
Figure1. Identification of hAT-EVa. Transmission electron microscope observation (×25 k); b. Nanoparticles tracking analyzer NanoSight detection; c. Western blot detection 1：hAT-EV 2: Adipose tissue
2.2 hAT-EV 與 ADSCs 共培養觀察
2.2.1 hAT-EV 能否進入 ADSCs 觀察
共聚焦熒光顯微鏡觀察示，PKH26 標記的 hAT-EV 被 ADSCs 攝取并分布于細胞核周圍，表明 hAT-EV 可進入 ADSCs。見圖 2a。
圖2
hAT-EV 與 ADSCs 共培養觀察
a. 共聚焦熒光顯微鏡觀察（×400）；b. 油紅 O 染色觀察（×400） 從左至右依次為陰性對照組、陽性對照組和實驗組
Figure2. Observation on co-culture of hAT-EV and ADSCsa. Confocal fluorescence microscope observation (×400); b. Oil red O staining observation (×400) From left to right for negative control group, positive control group, and experimental group, respectively
2.2.2 hAT-EV 誘導 ADSCs 成脂分化作用評價
油紅 O 染色示，陰性對照組、陽性對照組、實驗組油紅 O 染色陽性脂滴的密度分別為 0.05±0.01、0.18±0.02、0.12±0.03，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2b。
2.3 DAT 表征
① 大體觀察：脂肪組織經脫細胞處理后由黃色變成白色。② 組織學觀察：HE 染色示，經脫細胞處理后，DAT 中無細胞和細胞碎片；Masson 染色示 DAT 主要成分為膠原蛋白。③ 掃描電鏡觀察：脂肪組織經脫細胞處理后，細胞外基質中未發現細胞和細胞碎片存在，同時可見粗大膠原纖維束。④ 免疫組織化學染色觀察：DAT 中可見 Ⅰ 型膠原、Ⅳ 型膠原和層粘連蛋白陽性表達。⑤ Western blot 檢測：DAT 中 Ⅰ 型膠原、Ⅳ 型膠原和層粘連蛋白呈陽性表達，相對灰度值分別為 1.12±0.08、1.04±0.02、0.89±0.04。見圖 3。
圖3
DAT 表征
a. 大體觀察；b. HE 染色觀察（×400）；c. Masson 染色觀察（×400）；d. 掃描電鏡觀察（×2 000）；e. Ⅰ 型膠原免疫組織化學染色觀察（×400）；f. Ⅳ 型膠原免疫組織化學染色觀察（×400）；g. 層粘連蛋白免疫組織化學染色觀察（×400）；h. Western blot 檢測
Figure3. Characterization of DATa. General observation; b. HE staining observation (×400); c. Masson staining observation (×400); d. SEM observation (×2 000); e. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅰ (×400); f. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅳ（×400); g. Immunohistochemical staining of laminin (×400); h. Western blot detection
2.4 hAT-EV 對 DAT 體內成脂的影響
① 大體觀察兩組均可見黃色 DAT 樣本，實驗組 DAT 新生物濕重為（0.76±0.21）g，顯著高于對照組的（0.52±0.15）g，差異有統計學意義（t=2.278，P=0.048）。② HE 染色示，實驗組圓形脂滴結構比對照組多，對照組膠原含量高于實驗組；兩組均無明顯炎性細胞浸潤和壞死。③ 圍脂滴蛋白免疫熒光染色示，對照組新生脂肪組織僅生長在 DAT 外周，而實驗組新生脂肪組織生長在 DAT 外周和內部。高倍鏡下實驗組 DAT 新生物中脂肪組織比例為 13.02%±5.24%，高于對照組的 8.12%±4.38%，差異有統計學意義（t=4.648，P=0.017）。見圖 4。
圖4
hAT-EV 聯合 DAT 在 C57 小鼠皮下構建組織工程脂肪觀測
從左至右分別為實驗組、對照組 a. 大體觀察（箭頭示 DAT）；b. HE 染色觀察（×400）；c. 圍脂滴蛋白免疫熒光染色觀察（共聚焦熒光顯微鏡×50）；d. 圍脂滴蛋白免疫熒光染色觀察（共聚焦熒光顯微鏡×400）
Figure4. Observation on the subcutaneous construction of tissue engineered fat in C57 mice with hAT-EV and DATFrom left to right for experimental group and control group，respectively a. General observation (Arrow indicated DAT); b. HE staining observation (×400); c. Immunofluorescence staining of peri-lipoprotein (Confocal fluorescence microscope×50); d. Immunofluorescence staining of peri-lipoprotein (Confocal fluorescence microscope×400)
3 討論
DAT 是近年發展起來的一種新型支架材料，在脂肪組織工程中具有廣闊應用前景。與合成或天然生物聚合物支架相比，DAT 的主要優勢是具備天然的脂肪誘導特性——可以誘導 MSCs 成脂分化[14-15]；此外，由于脂肪組織具有來源豐富、獲取簡便的優點，使得 DAT 的原材料比其他組織細胞外基質的原材料更易獲取[23]；最后，應用自體 DAT 還可以避免動物源性支架，如牛或豬膠原蛋白潛在的免疫反應和異種疾病傳播風險[24]。盡管 DAT 有諸多優點，但既往研究表明，將 DAT 或 DAT 搭載 ADSCs 植入小鼠體內，未誘導生成足夠的脂肪組織[15]。引起脂肪組織生成不足的原因可能是體內血管組織缺乏或誘導脂肪組織新生的生長因子不足[25]。同時，在體內 DAT 和新生脂肪組織的長期穩定性仍有待明確。
因此，在本研究中我們采用了一種新方案誘導脂肪組織生成——DAT 搭載 hAT-EV。DAT 組織學觀察顯示，經過脫細胞處理后脂肪組織達到了徹底脫細胞和保留天然細胞外基質的目的。其中，細胞外基質蛋白對于維持脂肪細胞的結構完整至關重要，同時對脂肪組織的發育和生長也發揮重要作用[26-27]。異丙醇作為脂肪組織脫細胞常用有機溶劑，可以有效去除油脂，但同時也會導致細胞外基質蛋白沉淀，從而破壞細胞外基質蛋白成分[28-30]。本實驗脫細胞前先使用勻漿機處理脂肪組織 30 min，再放入?80℃ 冰箱過夜，可以最大程度去除脂肪組織油脂，減少異丙醇處理時間，同時也能減少 DAT 中毒性化學物質殘留。掃描電鏡和 Masson 染色顯示，DAT 中網狀膠原保存良好；免疫組織化學染色和 Western blot 結果顯示，DAT 中含有豐富 Ⅰ、Ⅳ 型膠原蛋白和層粘連蛋白。這些蛋白是脂肪組織基底膜的主要成分，膠原蛋白網可為脂肪組織中細胞提供結構支持[31]，而層粘連蛋白可影響細胞活動，如細胞黏附、遷移和分化[32-34]。以上結果表明我們成功制備 DAT。
Dai 等[20]研究發現，脂肪組織上清液可以誘導 ADSCs 成脂分化，并促進主動脈內皮細胞增殖、遷移和血管生成，從而促進脂肪組織生成。Kato 等[28]也發現從脂肪組織提取的 EV 可誘導脂肪生成。本研究中，我們采用超高速離心法從脂肪組織上清液中獲取 hAT-EV。在體外實驗中，將 PKH26 熒光標記的 hAT-EV 與 ADSCs 共培養后發現， hAT-EV 可以被 ADSCs 攝取并促進 ADSCs 成脂分化；在體內實驗中，通過對比 DAT 新生物濕重、HE 染色和圍脂滴蛋白免疫熒光染色結果發現，hAT-EV 具有成脂誘導功能，在體內聯合 DAT 可構建脂肪細胞密度更高的組織工程脂肪。研究表明，移植物的脂肪生成和體積在 12 周后趨于穩定[28]，并且在之后的 1 年內移植物體積僅有輕微減少[12]。因此，我們選定 12 周取材來評估新生物的成脂效果。12 周時，通過 HE 染色和圍脂滴蛋白免疫熒光染色分析表明，DAT 搭載 hAT-EV 構建的組織工程脂肪中脂肪細胞密度更高；并且與其他 DAT 誘導脂肪再生的研究[15-16]相比，hAT-EV 顯著提高了 DAT 新生物濕重。值得注意的是，對比圍脂滴蛋白免疫熒光染色我們發現，經 hAT-EV 作用后 DAT 新生物中心可見脂肪組織，而對照組僅在 DAT 新生物外周有脂肪組織生長。因此，我們推測 hAT-EV 可能具有驅化脂肪前體細胞的能力，這一結論我們將在后續研究中進一步論證。此外，限制組織工程脂肪應用的主要原因除了脂肪再生困難外，如何促進新生物在移植早期快速再血管化也是當前研究瓶頸。血管再生是脂肪再生的前提條件[35-36]，因此發現一種既可以促進血管新生又可以誘導脂肪再生的物質十分重要。本研究僅觀察了 hAT-EV 的成脂效果，我們將在后續研究中進一步探討 hAT-EV 成血管作用。
綜上述，通過本研究我們發現 hAT-EV 在體內、外均可促進脂肪新生，DAT 搭載 hAT-EV 可作為一種誘導脂肪組織新生的新方法，在軟組織缺損修復領域具有潛在應用前景。
作者貢獻：聶佳瑩參與實驗設計及實施，數據收集整理及統計分析，文章起草；易陽艷參與實驗設計、對文章的知識性內容作批評性審閱；朱元正參與實驗設計及實施，數據收集整理及統計分析，對文章的知識性內容作批評性審閱
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經南昌大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準［2018 第（025）號］。所有動物實驗均經南昌大學第二附屬醫院實驗動物倫理委員會批準，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）2015-0001。
