引用本文： 吳舒, 朱元正, 張靜, 胡玄, 易陽艷. 循環雌激素水平對裸鼠顆粒脂肪移植轉歸的影響. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(2): 220-225. doi: 10.7507/1002-1892.201903011 復制
近年來，自體脂肪移植是臨床軟組織填充首選方案[1-3]。然而，盡管自體脂肪移植操作程序越來越標準化，但脂肪移植物存活率僅達 30%～90%，表明患者自身特征可能對脂肪細胞和脂肪來源干細胞的活性和生物學功能產生影響[4]。研究發現，體內循環雌激素可通過活化細胞上的雌激素受體參與血管新生、炎癥調控和脂肪細胞的轉分化[5]，但循環雌激素水平的差異對脂肪移植物的轉歸是否有顯著影響尚不明確。因此，本研究將建立不同循環雌激素水平的小鼠模型并進行顆粒脂肪移植，探討不同循環雌激素水平對脂肪移植物轉歸的影響及其作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡雌性裸鼠 18 只，體質量 20～25 g，購自南昌大學實驗動物中心。脂肪組織由南昌大學第二附屬醫院整形美容科行腹部抽脂術的健康女性自愿捐贈，年齡 18～35 歲；將脂肪抽吸物通過低速離心（800×g，離心 5 min）去除油脂和水分，獲取純化顆粒脂肪。
17β-雌二醇溶液（Sigma 公司，美國）；4% 多聚甲醛（廣州齊云生物科技有限公司）；圍脂滴蛋白一抗、CD3 一抗、解耦聯蛋白 1（uncoupling protein 1，UCP1）一抗、雌激素受體 α 一抗（Abcam 公司，英國）；小鼠雌二醇 ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。
高速冷凍離心機（Eppendorf 公司，德國）；熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；CO2 細胞孵箱（Thermo Fisher 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將 18 只裸鼠隨機分為去勢組、高雌激素組及正常雌激素組，每組 6 只。去勢組通過卵巢切除術制備去勢裸鼠模型。具體步驟：裸鼠以腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉麻醉后，為避免損傷子宮、輸卵管及子宮旁脂肪組織，通過雙側背部皮膚并平行于脊柱作寬 0.5 cm 切口，進入腹膜后完全結扎輸卵管上端并切除卵巢組織；5-0 可吸收線縫合腹膜并完整閉合，6-0 尼龍線縫合皮膚切口。高雌激素組及正常雌激素組裸鼠同法麻醉后，僅作相同切口進入腹膜后關閉切口，不結扎輸卵管及切除卵巢組織。術后，高雌激素組裸鼠每 3 天進行 1 次雌二醇（0.2 mg/g）灌胃，共 30 d；其他兩組同時間點進行等量 PBS 灌胃。
術后 30 d 時體循環激素水平穩定，取 3 組裸鼠尾靜脈血，以小鼠雌二醇 ELISA 試劑盒檢測雌二醇濃度。同上法麻醉后，通過 19 G 鈍針將制備的顆粒脂肪注入裸鼠頭皮下，每只移植 0.3 mL，切口涂抹紅霉素眼膏防止感染。脂肪移植后 8 周取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
記錄各組裸鼠存活情況。脂肪移植 8 周后取出移植物，肉眼觀察其大小、顏色，電子天平稱重（濕重）。
1.3.2 組織學、免疫熒光及免疫組織化學染色觀察
大體觀察后，將移植物置于 4% 多聚甲醛固定、乙醇梯度脫水、石蠟包埋，制成厚度為 0.5 μm 的切片。
① HE 染色：切片經蘇木素染液染色 3～5 min、伊紅染液染色 5 min 后脫水封片。每組隨機取 10 張切片，于 400 倍視野下每張切片隨機選取 15 個視野，Photoshop CS6 軟件測量脂肪細胞直徑，取均值。
② CD31-圍脂滴蛋白熒光染色：切片經抗原修復、硼氫化鈉固定 10 min、蘇丹黑封閉 5 min、流水沖洗 10 min、血清封閉后一抗 4℃ 過夜，PBS 沖洗 5 min、共 3 次；二抗常溫孵育 50 min，PBS 沖洗 5 min、共 3 次；甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光為 CD31 陽性表達，綠色熒光為圍脂滴蛋白陽性表達。每組隨機取 10 張切片，于 400 倍視野下每張切片隨機選取 15 個視野，PhotoshopCS6 軟件計數血管，以每個視野血管數作為血管密度，取均值。
③ UCP1 免疫組織化學染色：切片經抗原修復、3%H2O2 孵育 10 min、流水沖洗 10 min、血清封閉，UCP1 一抗室溫孵育 20 min，PBS 沖洗 5 min、共 3 次；二抗常溫孵育 30 min，PBS 沖洗 5 min、共 3 次；每張切片加 1 滴新配制的二氨基聯苯胺；蘇木素復染，0.1%HCl 分化；脫水、透明，甘油封片，鏡下觀察。
④ 雌激素受體 α 免疫熒光染色：切片經抗原修復、硼氫化鈉固定 10 min、蘇丹黑封閉 5 min、流水沖洗 10 min、血清封閉，添加小鼠抗人雌激素受體 α 一抗、4℃ 孵育 36 h，二抗室溫孵育 1 h；用鏈霉素相連的 Cy3 室溫避光孵育 30 min，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光為雌激素受體 α 陽性表達。每組隨機抽取 10 張切片，于 400 倍視野下每張切片隨機選取 15 個視野，PhotoshopCS6 軟件計數雌激素受體 α 陽性細胞，取均值。
1.3.3 實時熒光定量 PCR 檢測
取移植物加入 1 mL Trizol 剪碎，震蕩 30 s。加 0.2 mL 氯仿，劇烈搖動 30 s，室溫靜置 3 min。4℃ 以 12 000×g、離心 15 min，吸取上層無色水相，移入另一 EP 管中。加入等體積異丙醇，?20℃ 靜置 30 min。4℃ 以 12 000×g、離心 10 min，管底部可見微量 RNA 沉淀。棄上清，加 75% 乙醇 1 mL，振蕩 5 min。4℃ 以 7 500×g、離心 10 min 后棄上清，用濾紙吸取殘留液體，室溫干燥 5～10 min。沉淀溶于 20 μL DEPC 水，然后取 1 μL 加入 79 μL DEPC 水，測量吸光度（A）260/280 值，?80℃ 保存。以 GAPDH 作為內參，測量各組研磨液中 UCP1 和雌激素受體 α mRNA 相對表達量。引物設計：UCP1：上游 AAACAGAAGGATTGCCGAAACT；下游 CTCTGTAGGCTGCCCAATGAA。雌激素受體 α：上游 CAGCAGTAACGAGAAAGGAAACA；下游 TCGGCGGTCTTTCCGTATG。GAPDH：上游 GAGTCCACTGGCGTCTTCAC；下游 TTCACACCCATGACGAACAT。
1.4 統計學方法
采用 SPSS11.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 雌激素水平檢測
ELISA 檢測顯示去勢組、正常雌激素組、高雌激素組雌二醇濃度分別為（2.10±0.63）、（4.51±1.95）、（7.82±2.20）pg/mL。與正常雌激素組相比，去勢組雌二醇濃度明顯降低，高雌激素組明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2 大體觀察
實驗期間 3 組裸鼠無死亡。脂肪移植后 8 周，大體觀察移植物體積從大到小依次為去勢組、正常雌激素組、高雌激素組（圖 1）。去勢組移植物濕重為（0.18±0.05）g，高于正常雌激素組（0.13±0.06）g 和高雌激素組（0.09±0.04）g；其中，去勢組與高雌激素組間差異有統計學意義（P<0.05）。
圖1
大體觀察各組脂肪移植物
1：正常雌激素組；2：去勢組；3：高雌激素組
Figure1. Gross observation of fat graft in each group1: Normal estrogen group; 2: Ovariectomized group; 3: High estrogen group
2.3 HE 染色觀察
與正常雌激素組相比，去勢組脂肪細胞增大、血管密度減小；而高雌激素組脂肪細胞減小，并伴隨血管密度升高（圖 2a）。去勢組、正常雌激素組、高雌激素組脂肪細胞直徑分別為（125.85±15.88）、（75.64±23.72）、（24.11±8.26）μm，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖2
各組脂肪移植物染色觀察（×400）
從左至右分別為正常雌激素組、去勢組、高雌激素組 a. HE 染色；b. 熒光顯微鏡下 CD31-圍脂滴蛋白熒光染色觀察；c. UCP1 免疫組織化學染色；d. 熒光顯微鏡下雌激素受體 α 免疫熒光染色觀察
Figure2. Histology staining observation of fat graft in each group (×400)From left to right for normal estrogen group, ovariectomized group, and high estrogen group, respectively a. HE staining; b. CD31-perilipin fluorescence staining observation under fluorescence microscopy; c. UCP1 immunohistochemical staining; d. Immunofluorescence staining of estrogen receptor α under fluorescence microscopy
2.4 CD31-圍脂滴蛋白熒光染色觀察
與正常雌激素組相比，高雌激素組移植物脂肪細胞的圍脂滴蛋白表達較強，血管密度增大；去勢組脂肪細胞圍脂滴蛋白表達較弱，血管密度較小（圖 2b）。正常雌激素組、高雌激素組、去勢組血管密度分別為（39.56±13.22）、（51.94±10.08）、（18.19±7.04）個/視野，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.5 UCP1 免疫組織化學染色觀察
與正常雌激素組相比，高雌激素組移植物脂肪細胞高表達棕色脂肪標記物 UCP1，而去勢組脂肪細胞幾乎不表達 UCP1（圖 2c）。
2.6 雌激素受體 α 免疫熒光染色觀察
與正常雌激素組相比，高雌激素組移植物雌激素受體 α 陽性細胞增多，而去勢組減少（圖 2d）。正常雌激素組、高雌激素組、去勢組分別為（76.62±17.51）、（113.47±19.82）、（46.93±9.21）個/視野，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.7 實時熒光定量 PCR 檢測
正常雌激素組、高雌激素組、去勢組 UCP1 mRNA 相對表達量分別為 1.36±0.21、2.24±0.35、0.92±0.15，雌激素受體 α mRNA 相對表達量分別為 0.84±0.16、1.81±0.39、0.44±0.13；組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
雌激素通過與雌激素受體 α 結合廣泛影響機體代謝功能，如中樞神經系統、骨組織、脂肪組織及心血管系統等[6]，作用機制可能為雌激素與其受體（雌激素受體 α 或 β）結合后，通過改變受體結構構象并在細胞核內與 DNA 結合，影響轉錄因子并活化特定基因，從而發揮生物學效應及調節作用。在機體的能量合成、代謝及對脂質沉積、分解的調節中，雌激素通過結合中樞神經系統及外周器官中的雌激素受體來調控細胞多種生理活動，發揮重要作用[7-8]。
雌激素不僅影響機體中樞及外周組織的代謝功能，在局部脂肪組織中還能促進血管網形成。游離脂肪移植早期處于缺血狀態，可導致組織中缺氧逐漸加劇，進而造成大量脂肪組織及其他周圍細胞凋亡壞死。如果能在移植早期建立良好血供，減少組織缺氧程度，即可提高脂肪組織的存活率。動物實驗發現，雌激素環境可以促進移植物生成更豐富、密集的微血管網[9]。本實驗結果顯示高雌激素環境可誘導脂肪移植物產生更多微血管，但脂肪細胞體積卻顯著減小，從而導致移植物濕重減小；相反，低雌激素環境（去勢組）移植物血管密度較低，但由于脂肪細胞肥大，從而獲得高濕重移植物。由此可見，體循環雌激素影響脂肪移植物轉歸的作用機制不僅僅通過調控移植后微血管的再生，對移植物脂肪細胞脂質的代謝也有一定干預作用。
棕色/米色脂肪細胞是人體內代謝活躍的細胞，其含量與體質量指數成負相關[10-14]。與儲存能量的白色脂肪細胞相比，棕色/米色脂肪細胞除細胞體積小及多房結構以外，還具有截然不同的功能差異。棕色/米色脂肪通過 UCP1 蛋白產生熱量，從而有效調節機體代謝平衡。充分利用棕色/米色脂肪細胞這種特點，在人體內誘導白色脂肪棕色化可以治療多種代謝性疾病[10-19]。近年來，學者們發現雌激素受體 α 的活化可通過升高脂肪甘油三酯脂酶和激素敏感性脂酶，增強脂肪細胞的脂解作用，從而誘導白色脂肪細胞棕色化[20]。本實驗中，我們通過 UCP1 免疫組織化學染色和雌激素受體 α 免疫熒光染色發現，高雌激素環境可活化脂肪移植物中更多的雌激素受體 α，并生成大量米色脂肪（UCP1 陽性）。由此可見，脂肪移植物的存活及生長受宿主循環雌激素水平的調控，但移植物中的米色脂肪是外源性脂肪細胞分化而來還是宿主細胞分化后形成，根據本實驗結果尚無法明確，需要進一步研究。
綜上述，本實驗結果表明體內循環雌激素水平對脂肪移植轉歸有顯著影響。低雌激素水平導致脂肪移植物中脂肪細胞增大，從而提高移植物濕重；而高雌激素水平則誘導脂肪移植物中白色脂肪細胞向米色脂肪細胞轉化，其機制可能與脂肪細胞上雌激素受體 α 激活相關，但雌激素受體 α 激活誘導脂肪細胞轉分化的分子機制還有待研究發現。然而，雌激素對脂肪移植后的脂肪再生機制、移植物結局及轉歸目前尚未明確，需要進一步研究。
作者貢獻：吳舒負責文章撰寫及臨床標本收集，朱元正負責數據收集整理及統計分析，張靜負責動物飼養，胡玄負責動物實驗，易陽艷負責科研設計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經南昌大學第二附屬醫學/動物實驗倫理委員會批準［研臨審［2018］第（008）號］；實驗動物使用證許可號：SYXK（贛）2015-0001。
近年來，自體脂肪移植是臨床軟組織填充首選方案[1-3]。然而，盡管自體脂肪移植操作程序越來越標準化，但脂肪移植物存活率僅達 30%～90%，表明患者自身特征可能對脂肪細胞和脂肪來源干細胞的活性和生物學功能產生影響[4]。研究發現，體內循環雌激素可通過活化細胞上的雌激素受體參與血管新生、炎癥調控和脂肪細胞的轉分化[5]，但循環雌激素水平的差異對脂肪移植物的轉歸是否有顯著影響尚不明確。因此，本研究將建立不同循環雌激素水平的小鼠模型并進行顆粒脂肪移植，探討不同循環雌激素水平對脂肪移植物轉歸的影響及其作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡雌性裸鼠 18 只，體質量 20～25 g，購自南昌大學實驗動物中心。脂肪組織由南昌大學第二附屬醫院整形美容科行腹部抽脂術的健康女性自愿捐贈，年齡 18～35 歲；將脂肪抽吸物通過低速離心（800×g，離心 5 min）去除油脂和水分，獲取純化顆粒脂肪。
17β-雌二醇溶液（Sigma 公司，美國）；4% 多聚甲醛（廣州齊云生物科技有限公司）；圍脂滴蛋白一抗、CD3 一抗、解耦聯蛋白 1（uncoupling protein 1，UCP1）一抗、雌激素受體 α 一抗（Abcam 公司，英國）；小鼠雌二醇 ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。
高速冷凍離心機（Eppendorf 公司，德國）；熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；CO2 細胞孵箱（Thermo Fisher 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將 18 只裸鼠隨機分為去勢組、高雌激素組及正常雌激素組，每組 6 只。去勢組通過卵巢切除術制備去勢裸鼠模型。具體步驟：裸鼠以腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉麻醉后，為避免損傷子宮、輸卵管及子宮旁脂肪組織，通過雙側背部皮膚并平行于脊柱作寬 0.5 cm 切口，進入腹膜后完全結扎輸卵管上端并切除卵巢組織；5-0 可吸收線縫合腹膜并完整閉合，6-0 尼龍線縫合皮膚切口。高雌激素組及正常雌激素組裸鼠同法麻醉后，僅作相同切口進入腹膜后關閉切口，不結扎輸卵管及切除卵巢組織。術后，高雌激素組裸鼠每 3 天進行 1 次雌二醇（0.2 mg/g）灌胃，共 30 d；其他兩組同時間點進行等量 PBS 灌胃。
術后 30 d 時體循環激素水平穩定，取 3 組裸鼠尾靜脈血，以小鼠雌二醇 ELISA 試劑盒檢測雌二醇濃度。同上法麻醉后，通過 19 G 鈍針將制備的顆粒脂肪注入裸鼠頭皮下，每只移植 0.3 mL，切口涂抹紅霉素眼膏防止感染。脂肪移植后 8 周取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
記錄各組裸鼠存活情況。脂肪移植 8 周后取出移植物，肉眼觀察其大小、顏色，電子天平稱重（濕重）。
1.3.2 組織學、免疫熒光及免疫組織化學染色觀察
大體觀察后，將移植物置于 4% 多聚甲醛固定、乙醇梯度脫水、石蠟包埋，制成厚度為 0.5 μm 的切片。
① HE 染色：切片經蘇木素染液染色 3～5 min、伊紅染液染色 5 min 后脫水封片。每組隨機取 10 張切片，于 400 倍視野下每張切片隨機選取 15 個視野，Photoshop CS6 軟件測量脂肪細胞直徑，取均值。
② CD31-圍脂滴蛋白熒光染色：切片經抗原修復、硼氫化鈉固定 10 min、蘇丹黑封閉 5 min、流水沖洗 10 min、血清封閉后一抗 4℃ 過夜，PBS 沖洗 5 min、共 3 次；二抗常溫孵育 50 min，PBS 沖洗 5 min、共 3 次；甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光為 CD31 陽性表達，綠色熒光為圍脂滴蛋白陽性表達。每組隨機取 10 張切片，于 400 倍視野下每張切片隨機選取 15 個視野，PhotoshopCS6 軟件計數血管，以每個視野血管數作為血管密度，取均值。
③ UCP1 免疫組織化學染色：切片經抗原修復、3%H2O2 孵育 10 min、流水沖洗 10 min、血清封閉，UCP1 一抗室溫孵育 20 min，PBS 沖洗 5 min、共 3 次；二抗常溫孵育 30 min，PBS 沖洗 5 min、共 3 次；每張切片加 1 滴新配制的二氨基聯苯胺；蘇木素復染，0.1%HCl 分化；脫水、透明，甘油封片，鏡下觀察。
④ 雌激素受體 α 免疫熒光染色：切片經抗原修復、硼氫化鈉固定 10 min、蘇丹黑封閉 5 min、流水沖洗 10 min、血清封閉，添加小鼠抗人雌激素受體 α 一抗、4℃ 孵育 36 h，二抗室溫孵育 1 h；用鏈霉素相連的 Cy3 室溫避光孵育 30 min，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光為雌激素受體 α 陽性表達。每組隨機抽取 10 張切片，于 400 倍視野下每張切片隨機選取 15 個視野，PhotoshopCS6 軟件計數雌激素受體 α 陽性細胞，取均值。
1.3.3 實時熒光定量 PCR 檢測
取移植物加入 1 mL Trizol 剪碎，震蕩 30 s。加 0.2 mL 氯仿，劇烈搖動 30 s，室溫靜置 3 min。4℃ 以 12 000×g、離心 15 min，吸取上層無色水相，移入另一 EP 管中。加入等體積異丙醇，?20℃ 靜置 30 min。4℃ 以 12 000×g、離心 10 min，管底部可見微量 RNA 沉淀。棄上清，加 75% 乙醇 1 mL，振蕩 5 min。4℃ 以 7 500×g、離心 10 min 后棄上清，用濾紙吸取殘留液體，室溫干燥 5～10 min。沉淀溶于 20 μL DEPC 水，然后取 1 μL 加入 79 μL DEPC 水，測量吸光度（A）260/280 值，?80℃ 保存。以 GAPDH 作為內參，測量各組研磨液中 UCP1 和雌激素受體 α mRNA 相對表達量。引物設計：UCP1：上游 AAACAGAAGGATTGCCGAAACT；下游 CTCTGTAGGCTGCCCAATGAA。雌激素受體 α：上游 CAGCAGTAACGAGAAAGGAAACA；下游 TCGGCGGTCTTTCCGTATG。GAPDH：上游 GAGTCCACTGGCGTCTTCAC；下游 TTCACACCCATGACGAACAT。
1.4 統計學方法
采用 SPSS11.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 雌激素水平檢測
ELISA 檢測顯示去勢組、正常雌激素組、高雌激素組雌二醇濃度分別為（2.10±0.63）、（4.51±1.95）、（7.82±2.20）pg/mL。與正常雌激素組相比，去勢組雌二醇濃度明顯降低，高雌激素組明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2 大體觀察
實驗期間 3 組裸鼠無死亡。脂肪移植后 8 周，大體觀察移植物體積從大到小依次為去勢組、正常雌激素組、高雌激素組（圖 1）。去勢組移植物濕重為（0.18±0.05）g，高于正常雌激素組（0.13±0.06）g 和高雌激素組（0.09±0.04）g；其中，去勢組與高雌激素組間差異有統計學意義（P<0.05）。
圖1
大體觀察各組脂肪移植物
1：正常雌激素組；2：去勢組；3：高雌激素組
Figure1. Gross observation of fat graft in each group1: Normal estrogen group; 2: Ovariectomized group; 3: High estrogen group
2.3 HE 染色觀察
與正常雌激素組相比，去勢組脂肪細胞增大、血管密度減小；而高雌激素組脂肪細胞減小，并伴隨血管密度升高（圖 2a）。去勢組、正常雌激素組、高雌激素組脂肪細胞直徑分別為（125.85±15.88）、（75.64±23.72）、（24.11±8.26）μm，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖2
各組脂肪移植物染色觀察（×400）
從左至右分別為正常雌激素組、去勢組、高雌激素組 a. HE 染色；b. 熒光顯微鏡下 CD31-圍脂滴蛋白熒光染色觀察；c. UCP1 免疫組織化學染色；d. 熒光顯微鏡下雌激素受體 α 免疫熒光染色觀察
Figure2. Histology staining observation of fat graft in each group (×400)From left to right for normal estrogen group, ovariectomized group, and high estrogen group, respectively a. HE staining; b. CD31-perilipin fluorescence staining observation under fluorescence microscopy; c. UCP1 immunohistochemical staining; d. Immunofluorescence staining of estrogen receptor α under fluorescence microscopy
2.4 CD31-圍脂滴蛋白熒光染色觀察
與正常雌激素組相比，高雌激素組移植物脂肪細胞的圍脂滴蛋白表達較強，血管密度增大；去勢組脂肪細胞圍脂滴蛋白表達較弱，血管密度較小（圖 2b）。正常雌激素組、高雌激素組、去勢組血管密度分別為（39.56±13.22）、（51.94±10.08）、（18.19±7.04）個/視野，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.5 UCP1 免疫組織化學染色觀察
與正常雌激素組相比，高雌激素組移植物脂肪細胞高表達棕色脂肪標記物 UCP1，而去勢組脂肪細胞幾乎不表達 UCP1（圖 2c）。
2.6 雌激素受體 α 免疫熒光染色觀察
與正常雌激素組相比，高雌激素組移植物雌激素受體 α 陽性細胞增多，而去勢組減少（圖 2d）。正常雌激素組、高雌激素組、去勢組分別為（76.62±17.51）、（113.47±19.82）、（46.93±9.21）個/視野，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.7 實時熒光定量 PCR 檢測
正常雌激素組、高雌激素組、去勢組 UCP1 mRNA 相對表達量分別為 1.36±0.21、2.24±0.35、0.92±0.15，雌激素受體 α mRNA 相對表達量分別為 0.84±0.16、1.81±0.39、0.44±0.13；組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
雌激素通過與雌激素受體 α 結合廣泛影響機體代謝功能，如中樞神經系統、骨組織、脂肪組織及心血管系統等[6]，作用機制可能為雌激素與其受體（雌激素受體 α 或 β）結合后，通過改變受體結構構象并在細胞核內與 DNA 結合，影響轉錄因子并活化特定基因，從而發揮生物學效應及調節作用。在機體的能量合成、代謝及對脂質沉積、分解的調節中，雌激素通過結合中樞神經系統及外周器官中的雌激素受體來調控細胞多種生理活動，發揮重要作用[7-8]。
雌激素不僅影響機體中樞及外周組織的代謝功能，在局部脂肪組織中還能促進血管網形成。游離脂肪移植早期處于缺血狀態，可導致組織中缺氧逐漸加劇，進而造成大量脂肪組織及其他周圍細胞凋亡壞死。如果能在移植早期建立良好血供，減少組織缺氧程度，即可提高脂肪組織的存活率。動物實驗發現，雌激素環境可以促進移植物生成更豐富、密集的微血管網[9]。本實驗結果顯示高雌激素環境可誘導脂肪移植物產生更多微血管，但脂肪細胞體積卻顯著減小，從而導致移植物濕重減小；相反，低雌激素環境（去勢組）移植物血管密度較低，但由于脂肪細胞肥大，從而獲得高濕重移植物。由此可見，體循環雌激素影響脂肪移植物轉歸的作用機制不僅僅通過調控移植后微血管的再生，對移植物脂肪細胞脂質的代謝也有一定干預作用。
棕色/米色脂肪細胞是人體內代謝活躍的細胞，其含量與體質量指數成負相關[10-14]。與儲存能量的白色脂肪細胞相比，棕色/米色脂肪細胞除細胞體積小及多房結構以外，還具有截然不同的功能差異。棕色/米色脂肪通過 UCP1 蛋白產生熱量，從而有效調節機體代謝平衡。充分利用棕色/米色脂肪細胞這種特點，在人體內誘導白色脂肪棕色化可以治療多種代謝性疾病[10-19]。近年來，學者們發現雌激素受體 α 的活化可通過升高脂肪甘油三酯脂酶和激素敏感性脂酶，增強脂肪細胞的脂解作用，從而誘導白色脂肪細胞棕色化[20]。本實驗中，我們通過 UCP1 免疫組織化學染色和雌激素受體 α 免疫熒光染色發現，高雌激素環境可活化脂肪移植物中更多的雌激素受體 α，并生成大量米色脂肪（UCP1 陽性）。由此可見，脂肪移植物的存活及生長受宿主循環雌激素水平的調控，但移植物中的米色脂肪是外源性脂肪細胞分化而來還是宿主細胞分化后形成，根據本實驗結果尚無法明確，需要進一步研究。
綜上述，本實驗結果表明體內循環雌激素水平對脂肪移植轉歸有顯著影響。低雌激素水平導致脂肪移植物中脂肪細胞增大，從而提高移植物濕重；而高雌激素水平則誘導脂肪移植物中白色脂肪細胞向米色脂肪細胞轉化，其機制可能與脂肪細胞上雌激素受體 α 激活相關，但雌激素受體 α 激活誘導脂肪細胞轉分化的分子機制還有待研究發現。然而，雌激素對脂肪移植后的脂肪再生機制、移植物結局及轉歸目前尚未明確，需要進一步研究。
作者貢獻：吳舒負責文章撰寫及臨床標本收集，朱元正負責數據收集整理及統計分析，張靜負責動物飼養，胡玄負責動物實驗，易陽艷負責科研設計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經南昌大學第二附屬醫學/動物實驗倫理委員會批準［研臨審［2018］第（008）號］；實驗動物使用證許可號：SYXK（贛）2015-0001。
