引用本文： 胡玄, 易陽艷, 朱元正, 王朝慧, 吳舒, 張靜, 王江文, 聶佳瑩. 脂肪干細胞來源外泌體促進大鼠皮瓣移植后血管新生的研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(12): 1560-1565. doi: 10.7507/1002-1892.201904023 復制
皮瓣移植是臨床修復創傷、腫瘤切除、先天畸形等原因導致的組織缺損最經典且最重要的方法[1]。皮瓣遠端缺血性壞死是移植術后最常見并發癥，尤其是皮瓣長寬比較大時 [2]。發生缺血性壞死的主要原因是缺乏新生血管，因此需要尋找一種促進皮瓣移植后血管新生的方法，以提高皮瓣成活率。
脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是人體儲量豐富的 MSCs，因具有較強的增殖分化能力、免疫調節作用以及獲取便利、對受區損傷小等優勢，常用于組織再生與修復[3]。研究證明，ADSCs 在創面愈合過程中血管形成方面發揮了重要作用[4]。外泌體（exosomes，Exos）是 MSCs 和靶細胞之間重要的旁分泌介質[5-6]，MSCs 分泌的 Exos 可以有效減少心肌缺血-再灌注損傷[7-8]以及保護腎臟免受缺血-再灌注損傷[9]，提示 Exos 對缺血性疾病的治療具有積極作用。本課題組前期研究發現 ADSC-Exos 能促進人臍靜脈血管內皮細胞增殖、遷移及管樣分化，提示其可能促進血管新生[10]。為此，我們進行了本次研究，旨在通過建立大鼠隨意皮瓣模型，評估 ADSC-Exos 對皮瓣移植后成活的影響及能否促進血管新生。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2～3 月齡雄性 SPF 級 SD 大鼠 20 只，體質量 250～300 g，由南昌大學動物實驗中心提供，實驗前適應性喂養 1 周。實驗用脂肪組織由在南昌大學第二附屬醫院整形美容科接受腰腹部超聲吸脂術的健康女性自愿捐贈，年齡 25～40 歲。
L-DMEM 培養基、FBS、Ⅰ型膠原酶（GIBCO 公司，美國）；鼠抗人 CD90、CD105、CD49d、CD45、CD106、CD34 多克隆抗體（BD 公司，美國）；BCA 蛋白質定量試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］；CD63、TSG101、β-actin 多克隆抗體（Abcam 公司，美國）；HE 染液、兔抗鼠 CD31 多克隆抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司）。
CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；低溫超高速離心機（Beckman 公司，美國）；納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight（Malvern 公司，英國）；透射電鏡（ZEISS 公司，德國）。
1.2 ADSCs分離培養及鑒定
取 10 mL 無菌脂肪組織置于 50 mL 離心管中，PBS 沖洗后加入 10 mL 0.2% Ⅰ型膠原酶，置于 37 ℃ 恒溫水浴箱消化；加入等體積完全培養基終止消化，以 258×g 離心 5 min；棄上清，完全培養基重懸細胞沉淀后接種至培養瓶，于 37 ℃、5%CO2 培養箱中培養，待細胞融合至 80% 以上后傳代。
取第 3 代 ADSCs，光鏡下觀察細胞形態；流式細胞術鑒定細胞表面標志物 CD90、CD105、CD49d、CD45、CD106、CD34 表達；成脂誘導培養 14 d 后，油紅 O 染色觀察。
1.3 ADSC-Exos分離純化及鑒定
1.3.1 ADSC-Exos分離純化
4 ℃ 條件下，將 FBS 以 100 000×g 離心 8 h，取上清制備無 Exos 的完全培養基。取第 3 代 ADSCs，加入無 Exos 完全培養基溫育 48 h 后，收集上清，采用密度梯度離心法提取 ADSC-Exos。具體步驟：4 ℃、以 300×g 離心 10 min，取上清；以 3 000×g 離心 20 min，取上清；以 10 000×g 離心 30 min，取上清；以 100 000×g 離心 70 min，取沉淀，1 mL PBS 重懸；以 100 000×g 離心 70 min，取沉淀，100 μL PBS 重懸，0.22 μm 濾器過濾。將提取的 ADSC-Exos 懸濁液儲存于?80 ℃ 備用。
1.3.2 ADSC-Exos鑒定
① 透射電鏡下觀察 ADSC-Exos 形態：取 10 μL ADSC-Exos 懸濁液于 300 目載樣銅網上，1% 磷鎢酸溶液負染 5 min，晾干后于透射電鏡下觀察。②Western blot 檢測 ADSC-Exos 膜表面標志蛋白：取 ADSC-Exos 以 100 000×g 離心 70 min，棄上清，加入 RIPA 裂解液 80 μL，在冰上裂解充分后，于 4 ℃ 以 10 000×g 離心 30 min，取上清并轉移至新的 1.5 mL EP 管中，?80 ℃ 凍存。BCA 法測定 ADSC-Exos 蛋白濃度，加入 6×Loading Buffer，95 ℃ 變性 10 min。10%SDS-PAGE 膠每孔上樣量為 50 μg，80 V 電泳 30 min，100 V 電泳 1 h，200 mA 轉膜 80 min，5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，加入 CD63、TSG101、β-actin 一抗 4 ℃ 孵育過夜。用 TBST 將 PVDF 膜漂洗 3 次，每次 10 min，再加入二抗室溫孵育 1 h，最后顯影曝光。以 ADSCs 作為對照，檢測方法步驟同上。③ 納米顆粒跟蹤分析儀測量 ADSC-Exos 粒徑分布：用 1.5 mL PBS 將 100 μL 濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 重懸后，使用納米顆粒跟蹤分析儀進行檢測。
1.4 動物模型制備及分組
將 20 只大鼠隨機分為 ADSC-Exos 組和 PBS 組，每組 10 只。參考改良 McFarlanc 皮瓣模型制備方法[11-12]，于大鼠背部制備隨意皮瓣模型。兩組大鼠腹腔注射 2% 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后固定于操作臺，背部剃毛、消毒后，沿長軸方向設計制備 1 個面積為 9 cm×3 cm 的隨意皮瓣，深達筋膜層。根據血供及與蒂部距離，將皮瓣等分為 3 個區域，分別為近蒂部以成活為主的近端區域、可能存在壞死與成活并存的中間區域和以壞死為主的遠端區域，每個區域面積為 3 cm×3 cm。見圖1。皮瓣原位縫合后，ADSC-Exos 組在皮瓣近端、中間、遠端區域，分別選取左、右對稱 2 處，注射 100 μL 含 ADSC-Exos（100 μg/mL）的 PBS 混懸液，確保注射的 ADSC-Exos 在皮瓣各區分布均勻；對照組同部位注射等量 PBS。用敷料將兩組大鼠背部包裹后分籠飼養。
圖1
大鼠背部皮瓣設計示意圖
藍色線條示切口切緣，紅色線條示蒂部知名血管
Figure1. Schematic design of dorsal skin flaps in ratsThe blue line for the incision margin, and the red line for the well-known blood vessels of the pedicle
1.5 觀測指標
1.5.1 大體觀察
術后觀察大鼠成活及皮瓣愈合情況。術后第 7 天兩組大鼠同上法麻醉后，用透明紙描繪背部皮瓣成活區域[13]，拍照并標記標尺后導入計算機，使用 Image Pro Plus6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）測量面積，計算皮瓣成活率（成活皮瓣面積/皮瓣總面積×100%）。
1.5.2 組織學觀察
大體觀察后，兩組分別切取皮瓣 3 個區域中間部位皮膚組織，經固定、脫水、包埋后切片，片厚 3 μm。取部分切片常規 HE 染色，觀察皮膚各層次組織形態。
1.5.3 免疫組織化學染色觀察
取兩組部分切片，常規二甲苯脫蠟，經各級濃度乙醇水化，檸檬酸鹽緩沖液行抗原修復，3%H2O2 封閉后，滴加一抗 CD31（1∶100），4 ℃ 條件下過夜；滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，4 ℃ 孵育 30 min。每張切片滴加 DAB 液顯色 20 min，各級濃度乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。晾干后鏡下觀察管樣形狀，以棕色為陽性染色。每組取 10 張切片，100 倍鏡下每張切片隨機挑選 5 個視野，計數 CD31 陽性血管，取均值，作為皮瓣微血管密度（mean blood vessel density，MVD）。
1.6 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs細胞形態及鑒定
第 3 代 ADSCs 呈長梭形貼壁生長，生長密集后表現為旋渦狀分布。流式細胞術鑒定顯示 CD90、CD105、CD49d 表達為陽性，CD45、CD106、CD34 表達為陰性。成脂誘導培養 3 d 后光鏡下可見胞質中有透明脂滴形成；14 d ADSCs 胞質內脂滴融合增大，形態更飽滿，油紅 O 染色呈陽性。上述檢測結果提示培養細胞為 ADSCs。見圖2。
圖2
ADSCs形態觀察及鑒定
a. 第 3 代 ADSCs 形態（×200）；b～g. 流式細胞術鑒定；h. 成脂誘導 14 d 油紅 O 染色觀察（×200）
Figure2. Morphology and identify of ADSCsa. Morphology of the 3rd generation ADSCs (×200); b-g. Flow cytometry identification; h. Oil red O staining at 14 days after induction of adipogenesis (×200)
2.2 ADSC-Exos鑒定
透射電鏡下見 ADSC-Exos 為邊緣清晰、大小形態均勻的圓形或橢圓形膜性囊泡。Western blot 檢測示，ADSC-Exos 高表達標志蛋白 CD63 和 TSG101，未檢測到干細胞中表達的 β-actin，提示分離出的 ADSC-Exos 純度較高。納米顆粒跟蹤分析儀顯示 ADSC-Exos 粒徑分布在 30～200 nm，符合外泌體粒徑范圍。見圖3。
圖3
ADSC-Exos鑒定
a. 透射電鏡觀察（×49k）；b. Western blot 檢測 1: ADSCs 2: ADSC-Exos；c. 納米顆粒跟蹤分析儀檢測ADSC-Exos粒徑分布
Figure3. Identification of ADSC-Exosa. Transmission electron microscopic observation (×49k); b. Western blot 1: ADSCs 2: ADSC-Exos;c. ADSC-Exos particle size distribution detected by nanoparticle tracking analyzer
2.3 動物實驗結果
2.3.1 大體觀察
術后第 3 天兩組皮瓣遠端均出現不同程度皮膚紫紺，靠近近端區域的皮膚成活，且 ADSC-Exos 組成活范圍明顯大于 PBS 組。第 7 天兩組皮瓣遠端均出現不同程度壞死表現，有黑痂形成；ADSC-Exos 組皮瓣成活率為 64.2%±11.5%，顯著大于 PBS 組的 31.0%±6.6%，差異有統計學意義（t=7.945，P=0.000）。見圖4。
圖4
術后兩組皮瓣大體觀察
左側為 PBS 組，右側為 ADSC-Exos 組 a. 術后第 3 天；b. 術后第 7 天
Figure4. Gross observation of two groups after operationLeft for the PBS group and right for the ADSC-Exos group a. On the 3rd day after operation; b. On the 7th day after operation
2.3.2 組織學觀察
術后第 7 天兩組皮瓣遠端區域組織形態相似，皮膚結構表現出不同程度壞死現象，但 ADSC-Exos 組略好于 PBS 組；中間區域 ADSC-Exos 組皮膚附屬器官較 PBS 組更完整；近端區域兩組均可見少量炎性細胞浸潤，但 ADSC-Exos 組與 PBS 組相比，組織水腫程度輕、血管擴張更多。見圖5a。
圖5
術后第7天兩組皮瓣組織學及CD31免疫組織化學染色觀察
左側為 PBS 組，右側為 ADSC-Exos 組 a. HE 染色（×200）；b. CD31 免疫組織化學染色（×100）
Figure5. Histological and CD31 immunohistochemical staining observations of two groups on the 7th dayLeft for the PBS group and right for the ADSC-Exos group a. HE staining (×200); b. CD31 immunohistochemical staining (×100)
2.3.3 免疫組織化學染色觀察
鏡下見 ADSC-Exos 組皮瓣中間部位組織中出現大量成熟新生血管，伴有新生血管側支形成，新生血管基本擴張；PBS 組新生血管形成較少或處于內皮細胞萌發階段，血管擴張不明顯。ADSC-Exos 組 MVD 為（103.3±27.0）個/視野，顯著多于 PBS 組（45.3±16.2）個/視野，差異有統計學意義（t=3.190，P=0.011）。見圖5b。
3 討論
皮瓣移植是臨床上修復創傷、重建功能、恢復外觀的常用治療方法，但由于皮瓣長寬比過大等因素，容易發生微循環和血運障礙等不良后果[14]。皮瓣移植后及早建立與周圍組織的血管聯系是減少早期壞死的關鍵。血管生成是一個復雜的調控過程，包括內皮細胞增殖和活化、內皮細胞遷移和侵襲、內皮細胞萌發、基底膜形成和新生血管成熟等多個步驟[15]。多項實驗表明干細胞療法在缺血組織新生血管形成中發揮重要作用[16-17]。但相比 MSCs，使用 MSCs-Exos 可以降低免疫排斥反應、異位組織形成等潛在風險[18]。并且納米級 Exos 易透過血腦屏障，到達干細胞無法到達的微環境，而且易保存，?20 ℃ 條件下 6 個月內不會喪失生物學活性[19-20]。這些特征均顯示 Exos 治療優于干細胞療法，為無細胞治療的開發提供了思路 [21]。
本課題組前期將 ADSC-Exos 與人臍靜脈血管內皮細胞復合培養，經 CCK-8 實驗、Transwell 遷移實驗、Matrigel 基質膠成血管實驗檢測，發現 ADSC-Exos 能促進人臍靜脈血管內皮細胞增殖、遷移以及管樣分化，而血管內皮細胞參與血管內壁形成，因此我們分析 ADSC-Exos 可能具有促進血管形成作用[10]。為進一步驗證該結論，探討其用于治療皮瓣移植的可行性，我們進行了本次動物實驗。
因隨意皮瓣切取應用方便、靈活，在組織缺損修復重建領域應用廣泛，所以本研究選擇制備該皮瓣模型。為了方便實驗觀察，保證注射均勻性，我們將皮瓣分為 3 個區左、右側分別注射，參考既往相關研究[22-23]確定 Exos 濃度及注射量。皮膚組織、血管及其他附屬結構一般在皮瓣移植術后 7 d 基本形成，因此我們選擇在該時間點進行觀察。本次研究發現，術后第 7 天兩組大鼠皮瓣遠端均出現不同程度壞死，但 ADSC-Exos 組皮瓣壞死面積明顯小于 PBS 組。HE 染色顯示，ADSC-Exos 組皮膚附屬器官比 PBS 組更完整，皮膚組織愈合更佳，這可能與 ADSC-Exos 作用于皮膚各層，進而減輕氧化應激有關[24]。CD31 免疫組織化學染色顯示 ADSC-Exos 組皮瓣中間部位出現大量成熟新生血管，并伴有血管側支形成，MVD 明顯高于 PBS 組。上述研究結果提示，ADSC-Exos 組各區域皮瓣愈合程度均優于 PBS 組，結合文獻報道的增加移植皮瓣早期新生血管可以有效促進缺血皮瓣成活[12, 25-26]，我們認為皮瓣移植術后注射的 ADSC-Exos 可以通過增加新生血管，進而減少皮瓣壞死情況的發生。
但本研究也存在一定局限性，ADSCs-Exos 對皮瓣移植后血管新生具體作用機制尚未涉及。文獻報道，Exos 在細胞間信息交流中扮演著重要角色，通過將 DNA、microRNA、蛋白質和脂質等傳遞至受體細胞，進而調控受體細胞的生物發生過程[27]。Kang 等[28]研究發現，ADSC-Exos 通過其攜帶的 miRNA-31 誘導血管新生。并且，Todorova 等[29]總結了細胞外囊泡中刺激血管生成的主要 micro-RNA 有 miR-126、miR-214、miR-296、miR-125a、miR-31、miR-150。因此，后續我們將探索 Exos 中包含的 microRNA 和蛋白等，進而深入研究 ADSC-Exos 促進皮瓣愈合的具體機制。另外，ADSC-Exos 用于臨床皮瓣移植的劑量、給藥途徑及時間等也需要進一步研究。
作者貢獻：胡玄負責動物實驗和文章撰寫，朱元正、張靜負責數據收集整理及統計分析，王朝慧負責細胞實驗，王江文、聶佳瑩負責動物飼養，吳舒負責臨床標本收集，易陽艷負責科研設計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經南昌大學第二附屬醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準，批號：研臨審[2018]第（024）號；動物使用許可證號：SYXK（贛）2015-0001。
皮瓣移植是臨床修復創傷、腫瘤切除、先天畸形等原因導致的組織缺損最經典且最重要的方法[1]。皮瓣遠端缺血性壞死是移植術后最常見并發癥，尤其是皮瓣長寬比較大時 [2]。發生缺血性壞死的主要原因是缺乏新生血管，因此需要尋找一種促進皮瓣移植后血管新生的方法，以提高皮瓣成活率。
脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是人體儲量豐富的 MSCs，因具有較強的增殖分化能力、免疫調節作用以及獲取便利、對受區損傷小等優勢，常用于組織再生與修復[3]。研究證明，ADSCs 在創面愈合過程中血管形成方面發揮了重要作用[4]。外泌體（exosomes，Exos）是 MSCs 和靶細胞之間重要的旁分泌介質[5-6]，MSCs 分泌的 Exos 可以有效減少心肌缺血-再灌注損傷[7-8]以及保護腎臟免受缺血-再灌注損傷[9]，提示 Exos 對缺血性疾病的治療具有積極作用。本課題組前期研究發現 ADSC-Exos 能促進人臍靜脈血管內皮細胞增殖、遷移及管樣分化，提示其可能促進血管新生[10]。為此，我們進行了本次研究，旨在通過建立大鼠隨意皮瓣模型，評估 ADSC-Exos 對皮瓣移植后成活的影響及能否促進血管新生。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2～3 月齡雄性 SPF 級 SD 大鼠 20 只，體質量 250～300 g，由南昌大學動物實驗中心提供，實驗前適應性喂養 1 周。實驗用脂肪組織由在南昌大學第二附屬醫院整形美容科接受腰腹部超聲吸脂術的健康女性自愿捐贈，年齡 25～40 歲。
L-DMEM 培養基、FBS、Ⅰ型膠原酶（GIBCO 公司，美國）；鼠抗人 CD90、CD105、CD49d、CD45、CD106、CD34 多克隆抗體（BD 公司，美國）；BCA 蛋白質定量試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］；CD63、TSG101、β-actin 多克隆抗體（Abcam 公司，美國）；HE 染液、兔抗鼠 CD31 多克隆抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司）。
CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；低溫超高速離心機（Beckman 公司，美國）；納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight（Malvern 公司，英國）；透射電鏡（ZEISS 公司，德國）。
1.2 ADSCs分離培養及鑒定
取 10 mL 無菌脂肪組織置于 50 mL 離心管中，PBS 沖洗后加入 10 mL 0.2% Ⅰ型膠原酶，置于 37 ℃ 恒溫水浴箱消化；加入等體積完全培養基終止消化，以 258×g 離心 5 min；棄上清，完全培養基重懸細胞沉淀后接種至培養瓶，于 37 ℃、5%CO2 培養箱中培養，待細胞融合至 80% 以上后傳代。
取第 3 代 ADSCs，光鏡下觀察細胞形態；流式細胞術鑒定細胞表面標志物 CD90、CD105、CD49d、CD45、CD106、CD34 表達；成脂誘導培養 14 d 后，油紅 O 染色觀察。
1.3 ADSC-Exos分離純化及鑒定
1.3.1 ADSC-Exos分離純化
4 ℃ 條件下，將 FBS 以 100 000×g 離心 8 h，取上清制備無 Exos 的完全培養基。取第 3 代 ADSCs，加入無 Exos 完全培養基溫育 48 h 后，收集上清，采用密度梯度離心法提取 ADSC-Exos。具體步驟：4 ℃、以 300×g 離心 10 min，取上清；以 3 000×g 離心 20 min，取上清；以 10 000×g 離心 30 min，取上清；以 100 000×g 離心 70 min，取沉淀，1 mL PBS 重懸；以 100 000×g 離心 70 min，取沉淀，100 μL PBS 重懸，0.22 μm 濾器過濾。將提取的 ADSC-Exos 懸濁液儲存于?80 ℃ 備用。
1.3.2 ADSC-Exos鑒定
① 透射電鏡下觀察 ADSC-Exos 形態：取 10 μL ADSC-Exos 懸濁液于 300 目載樣銅網上，1% 磷鎢酸溶液負染 5 min，晾干后于透射電鏡下觀察。②Western blot 檢測 ADSC-Exos 膜表面標志蛋白：取 ADSC-Exos 以 100 000×g 離心 70 min，棄上清，加入 RIPA 裂解液 80 μL，在冰上裂解充分后，于 4 ℃ 以 10 000×g 離心 30 min，取上清并轉移至新的 1.5 mL EP 管中，?80 ℃ 凍存。BCA 法測定 ADSC-Exos 蛋白濃度，加入 6×Loading Buffer，95 ℃ 變性 10 min。10%SDS-PAGE 膠每孔上樣量為 50 μg，80 V 電泳 30 min，100 V 電泳 1 h，200 mA 轉膜 80 min，5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，加入 CD63、TSG101、β-actin 一抗 4 ℃ 孵育過夜。用 TBST 將 PVDF 膜漂洗 3 次，每次 10 min，再加入二抗室溫孵育 1 h，最后顯影曝光。以 ADSCs 作為對照，檢測方法步驟同上。③ 納米顆粒跟蹤分析儀測量 ADSC-Exos 粒徑分布：用 1.5 mL PBS 將 100 μL 濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 重懸后，使用納米顆粒跟蹤分析儀進行檢測。
1.4 動物模型制備及分組
將 20 只大鼠隨機分為 ADSC-Exos 組和 PBS 組，每組 10 只。參考改良 McFarlanc 皮瓣模型制備方法[11-12]，于大鼠背部制備隨意皮瓣模型。兩組大鼠腹腔注射 2% 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后固定于操作臺，背部剃毛、消毒后，沿長軸方向設計制備 1 個面積為 9 cm×3 cm 的隨意皮瓣，深達筋膜層。根據血供及與蒂部距離，將皮瓣等分為 3 個區域，分別為近蒂部以成活為主的近端區域、可能存在壞死與成活并存的中間區域和以壞死為主的遠端區域，每個區域面積為 3 cm×3 cm。見圖1。皮瓣原位縫合后，ADSC-Exos 組在皮瓣近端、中間、遠端區域，分別選取左、右對稱 2 處，注射 100 μL 含 ADSC-Exos（100 μg/mL）的 PBS 混懸液，確保注射的 ADSC-Exos 在皮瓣各區分布均勻；對照組同部位注射等量 PBS。用敷料將兩組大鼠背部包裹后分籠飼養。
圖1
大鼠背部皮瓣設計示意圖
藍色線條示切口切緣，紅色線條示蒂部知名血管
Figure1. Schematic design of dorsal skin flaps in ratsThe blue line for the incision margin, and the red line for the well-known blood vessels of the pedicle
1.5 觀測指標
1.5.1 大體觀察
術后觀察大鼠成活及皮瓣愈合情況。術后第 7 天兩組大鼠同上法麻醉后，用透明紙描繪背部皮瓣成活區域[13]，拍照并標記標尺后導入計算機，使用 Image Pro Plus6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）測量面積，計算皮瓣成活率（成活皮瓣面積/皮瓣總面積×100%）。
1.5.2 組織學觀察
大體觀察后，兩組分別切取皮瓣 3 個區域中間部位皮膚組織，經固定、脫水、包埋后切片，片厚 3 μm。取部分切片常規 HE 染色，觀察皮膚各層次組織形態。
1.5.3 免疫組織化學染色觀察
取兩組部分切片，常規二甲苯脫蠟，經各級濃度乙醇水化，檸檬酸鹽緩沖液行抗原修復，3%H2O2 封閉后，滴加一抗 CD31（1∶100），4 ℃ 條件下過夜；滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，4 ℃ 孵育 30 min。每張切片滴加 DAB 液顯色 20 min，各級濃度乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。晾干后鏡下觀察管樣形狀，以棕色為陽性染色。每組取 10 張切片，100 倍鏡下每張切片隨機挑選 5 個視野，計數 CD31 陽性血管，取均值，作為皮瓣微血管密度（mean blood vessel density，MVD）。
1.6 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs細胞形態及鑒定
第 3 代 ADSCs 呈長梭形貼壁生長，生長密集后表現為旋渦狀分布。流式細胞術鑒定顯示 CD90、CD105、CD49d 表達為陽性，CD45、CD106、CD34 表達為陰性。成脂誘導培養 3 d 后光鏡下可見胞質中有透明脂滴形成；14 d ADSCs 胞質內脂滴融合增大，形態更飽滿，油紅 O 染色呈陽性。上述檢測結果提示培養細胞為 ADSCs。見圖2。
圖2
ADSCs形態觀察及鑒定
a. 第 3 代 ADSCs 形態（×200）；b～g. 流式細胞術鑒定；h. 成脂誘導 14 d 油紅 O 染色觀察（×200）
Figure2. Morphology and identify of ADSCsa. Morphology of the 3rd generation ADSCs (×200); b-g. Flow cytometry identification; h. Oil red O staining at 14 days after induction of adipogenesis (×200)
2.2 ADSC-Exos鑒定
透射電鏡下見 ADSC-Exos 為邊緣清晰、大小形態均勻的圓形或橢圓形膜性囊泡。Western blot 檢測示，ADSC-Exos 高表達標志蛋白 CD63 和 TSG101，未檢測到干細胞中表達的 β-actin，提示分離出的 ADSC-Exos 純度較高。納米顆粒跟蹤分析儀顯示 ADSC-Exos 粒徑分布在 30～200 nm，符合外泌體粒徑范圍。見圖3。
圖3
ADSC-Exos鑒定
a. 透射電鏡觀察（×49k）；b. Western blot 檢測 1: ADSCs 2: ADSC-Exos；c. 納米顆粒跟蹤分析儀檢測ADSC-Exos粒徑分布
Figure3. Identification of ADSC-Exosa. Transmission electron microscopic observation (×49k); b. Western blot 1: ADSCs 2: ADSC-Exos;c. ADSC-Exos particle size distribution detected by nanoparticle tracking analyzer
2.3 動物實驗結果
2.3.1 大體觀察
術后第 3 天兩組皮瓣遠端均出現不同程度皮膚紫紺，靠近近端區域的皮膚成活，且 ADSC-Exos 組成活范圍明顯大于 PBS 組。第 7 天兩組皮瓣遠端均出現不同程度壞死表現，有黑痂形成；ADSC-Exos 組皮瓣成活率為 64.2%±11.5%，顯著大于 PBS 組的 31.0%±6.6%，差異有統計學意義（t=7.945，P=0.000）。見圖4。
圖4
術后兩組皮瓣大體觀察
左側為 PBS 組，右側為 ADSC-Exos 組 a. 術后第 3 天；b. 術后第 7 天
Figure4. Gross observation of two groups after operationLeft for the PBS group and right for the ADSC-Exos group a. On the 3rd day after operation; b. On the 7th day after operation
2.3.2 組織學觀察
術后第 7 天兩組皮瓣遠端區域組織形態相似，皮膚結構表現出不同程度壞死現象，但 ADSC-Exos 組略好于 PBS 組；中間區域 ADSC-Exos 組皮膚附屬器官較 PBS 組更完整；近端區域兩組均可見少量炎性細胞浸潤，但 ADSC-Exos 組與 PBS 組相比，組織水腫程度輕、血管擴張更多。見圖5a。
圖5
術后第7天兩組皮瓣組織學及CD31免疫組織化學染色觀察
左側為 PBS 組，右側為 ADSC-Exos 組 a. HE 染色（×200）；b. CD31 免疫組織化學染色（×100）
Figure5. Histological and CD31 immunohistochemical staining observations of two groups on the 7th dayLeft for the PBS group and right for the ADSC-Exos group a. HE staining (×200); b. CD31 immunohistochemical staining (×100)
2.3.3 免疫組織化學染色觀察
鏡下見 ADSC-Exos 組皮瓣中間部位組織中出現大量成熟新生血管，伴有新生血管側支形成，新生血管基本擴張；PBS 組新生血管形成較少或處于內皮細胞萌發階段，血管擴張不明顯。ADSC-Exos 組 MVD 為（103.3±27.0）個/視野，顯著多于 PBS 組（45.3±16.2）個/視野，差異有統計學意義（t=3.190，P=0.011）。見圖5b。
3 討論
皮瓣移植是臨床上修復創傷、重建功能、恢復外觀的常用治療方法，但由于皮瓣長寬比過大等因素，容易發生微循環和血運障礙等不良后果[14]。皮瓣移植后及早建立與周圍組織的血管聯系是減少早期壞死的關鍵。血管生成是一個復雜的調控過程，包括內皮細胞增殖和活化、內皮細胞遷移和侵襲、內皮細胞萌發、基底膜形成和新生血管成熟等多個步驟[15]。多項實驗表明干細胞療法在缺血組織新生血管形成中發揮重要作用[16-17]。但相比 MSCs，使用 MSCs-Exos 可以降低免疫排斥反應、異位組織形成等潛在風險[18]。并且納米級 Exos 易透過血腦屏障，到達干細胞無法到達的微環境，而且易保存，?20 ℃ 條件下 6 個月內不會喪失生物學活性[19-20]。這些特征均顯示 Exos 治療優于干細胞療法，為無細胞治療的開發提供了思路 [21]。
本課題組前期將 ADSC-Exos 與人臍靜脈血管內皮細胞復合培養，經 CCK-8 實驗、Transwell 遷移實驗、Matrigel 基質膠成血管實驗檢測，發現 ADSC-Exos 能促進人臍靜脈血管內皮細胞增殖、遷移以及管樣分化，而血管內皮細胞參與血管內壁形成，因此我們分析 ADSC-Exos 可能具有促進血管形成作用[10]。為進一步驗證該結論，探討其用于治療皮瓣移植的可行性，我們進行了本次動物實驗。
因隨意皮瓣切取應用方便、靈活，在組織缺損修復重建領域應用廣泛，所以本研究選擇制備該皮瓣模型。為了方便實驗觀察，保證注射均勻性，我們將皮瓣分為 3 個區左、右側分別注射，參考既往相關研究[22-23]確定 Exos 濃度及注射量。皮膚組織、血管及其他附屬結構一般在皮瓣移植術后 7 d 基本形成，因此我們選擇在該時間點進行觀察。本次研究發現，術后第 7 天兩組大鼠皮瓣遠端均出現不同程度壞死，但 ADSC-Exos 組皮瓣壞死面積明顯小于 PBS 組。HE 染色顯示，ADSC-Exos 組皮膚附屬器官比 PBS 組更完整，皮膚組織愈合更佳，這可能與 ADSC-Exos 作用于皮膚各層，進而減輕氧化應激有關[24]。CD31 免疫組織化學染色顯示 ADSC-Exos 組皮瓣中間部位出現大量成熟新生血管，并伴有血管側支形成，MVD 明顯高于 PBS 組。上述研究結果提示，ADSC-Exos 組各區域皮瓣愈合程度均優于 PBS 組，結合文獻報道的增加移植皮瓣早期新生血管可以有效促進缺血皮瓣成活[12, 25-26]，我們認為皮瓣移植術后注射的 ADSC-Exos 可以通過增加新生血管，進而減少皮瓣壞死情況的發生。
但本研究也存在一定局限性，ADSCs-Exos 對皮瓣移植后血管新生具體作用機制尚未涉及。文獻報道，Exos 在細胞間信息交流中扮演著重要角色，通過將 DNA、microRNA、蛋白質和脂質等傳遞至受體細胞，進而調控受體細胞的生物發生過程[27]。Kang 等[28]研究發現，ADSC-Exos 通過其攜帶的 miRNA-31 誘導血管新生。并且，Todorova 等[29]總結了細胞外囊泡中刺激血管生成的主要 micro-RNA 有 miR-126、miR-214、miR-296、miR-125a、miR-31、miR-150。因此，后續我們將探索 Exos 中包含的 microRNA 和蛋白等，進而深入研究 ADSC-Exos 促進皮瓣愈合的具體機制。另外，ADSC-Exos 用于臨床皮瓣移植的劑量、給藥途徑及時間等也需要進一步研究。
作者貢獻：胡玄負責動物實驗和文章撰寫，朱元正、張靜負責數據收集整理及統計分析，王朝慧負責細胞實驗，王江文、聶佳瑩負責動物飼養，吳舒負責臨床標本收集，易陽艷負責科研設計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經南昌大學第二附屬醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準，批號：研臨審[2018]第（024）號；動物使用許可證號：SYXK（贛）2015-0001。
