引用本文： 張靜, 易陽艷, 陽水發, 朱元正, 胡玄. 脂肪干細胞來源外泌體對人臍靜脈血管內皮細胞增殖、遷移及管樣分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(10): 1351-1357. doi: 10.7507/1002-1892.201804016 復制
脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是人體儲量最為豐富的 MSCs，因具有獲取途徑方便、對供區損傷小、干細胞儲量大等優勢，常用于多種組織再生與修復治療中[1]。有研究證明，ADSCs 移植可促進血管新生[2]。進一步研究發現，移植的 ADSCs 主要通過旁分泌方式調控組織微環境，包括免疫調節、趨化宿主干細胞等[3]。
細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是細胞間溝通的關鍵工具，通過轉運蛋白質、生物活性磷脂和 RNA 等來參與細胞之間的通訊[4]。EV 共分為 3 種：凋亡小體、外泌體和微泡。其中外泌體是由體內多種細胞分泌的納米級囊泡，其表面和內部含多種生物活性物質，包括 microRNA 及多種蛋白質[5-6]。現已明確外泌體可參與細胞間的信息交流，主要通過識別細胞表面信號分子并結合或與靶細胞膜融合，將其攜帶的內容物導入受體細胞，進而影響受體細胞[7]。由此可見，外泌體可影響細胞間通訊，且外泌體攜帶來源于親代細胞的 microRNA、蛋白質和脂質等[3]，提示 ADSCs 來源外泌體（ADSCs released exosomes，ADSC-Exos）可能在促血管形成方面有重要作用。為此，我們用 ADSC-Exos 與人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）共培養，觀察 ADSC-Exos 處理后的 HUVECs 細胞增殖、遷移及管樣分化情況，以期為促進血管新生提供新思路及新方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 6 周齡雄性單純 T 細胞缺陷 BALB/c 裸鼠 12 只，體質量（20±5）g，由南昌大學實驗動物中心提供。
實驗用游離脂肪組織由在南昌大學第二附屬醫院整形美容科接受吸脂術的健康女性自愿捐贈，患者年齡 25～40 歲，本研究獲醫院倫理委員會批準。HUVECs 購自美國 Sciencell 公司。DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、油紅 O 染色劑、PKH26 細胞膜標記熒光染色劑（Sigma 公司，美國）；鼠抗人 CD34、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106 多克隆抗體（eBioscience 公司，美國）；Matrigel 基質膠、Transwell 小室（Corning 公司，美國）；BCA 蛋白質定量試劑盒、細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；表面標志物 Alix、CD63、β-actin 多克隆抗體（Abcam 公司，美國）。
倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；CO2 培養箱、多功能酶標儀（Thermo 公司，美國）；透射電鏡（ZEISS 公司，德國）；納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight（Malvern 公司，英國）；共聚焦熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；超高速離心機（Beckman 公司，美國）。
1.2 ADSCs 分離培養與鑒定
無菌條件下，采集吸脂術獲得的游離脂肪組織 10 mL，PBS 反復沖洗去除血液、結締組織后，加入等體積 0.2%Ⅰ型膠原酶，置于 37℃ 恒溫水浴箱消化，直至變為糊狀。200 μm 金屬篩網過濾后，以離心半徑 20 cm、1 200 r/min 離心 5 min，棄上清，保留最下層的沉淀。培養基重懸沉淀后接種于培養瓶內，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，2～3 d 后首次換液，之后每隔 1 d 換液 1 次，待細胞融合至 90% 后傳代。取第 3 代細胞行 HE 染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化；流式細胞術鑒定細胞表面標志性抗原 CD49d、CD90、CD105、CD34、CD45、CD106；采用成脂分化培養基誘導培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化，14 d 后油紅 O 染色觀察成脂分化情況。
1.3 ADSC-Exos 分離純化及鑒定
1.3.1 ADSC-Exos 分離純化
4℃ 條件下，FBS 經 100 000×g 超速離心 7 h 后，取上清液制備去除外泌體的完全培養基。取對數生長期的第 3 代 ADSCs，用去除外泌體的完全培養基培養 48 h 后，收集上清培養液，密度梯度離心法分離、提取外泌體。具體操作如下：4℃ 條件下， 300×g 離心 10 min，棄沉淀；3 000×g 離心 20 min，棄沉淀；10 000×g 離心 30 min，棄沉淀；100 000×g 離心 70 min，收集沉淀，PBS 重懸；再次 100 000×g 離心 70 min，去上清，以 PBS 重懸，0.22 μm 濾膜過濾。將獲取的 ADSC-Exos 于–80℃ 保存備用。
1.3.2 ADSC-Exos 鑒定
① 透射電鏡觀察 ADSC-Exos 形態：取 ADSC-Exos 10 μL 滴于透射電鏡專用的載樣銅網上，常溫靜置 2 min，濾紙吸去浮液，用 1%（W/V）磷鎢酸溶液染色 5 min 后，濾紙吸去多余染色液，晾干，透射電鏡觀察 ADSC-Exos 形態。② Western blot 檢測 ADSC-Exos 膜表面標志性蛋白：取 ADSC-Exos 以 100 000×g 離心 90 min 后，棄上清，加入 100 μL RIPA 裂解液，吹打使裂解液和 ADSC-Exos 充分混合，冰上裂解 30 min。4℃、12 000 ×g 離心 30 min，吸取上清液置于 1.5 mL EP 管中，–80℃ 凍存。BCA 法檢測蛋白濃度，加入 5×Loading Buffer，99℃ 變性 10 min。取 40 μg/孔上樣至 10%SDS-PAGE 膠，80 V 電泳 30 min，120 V 電泳 1 h，采用濕法轉膜，220 mA 轉膜 1 h，5%牛血清白蛋白室溫封閉 1 h，5%牛血清白蛋白稀釋一抗 Alix、CD63、β-actin，4℃ 孵育一抗過夜。TBST 漂洗 10 min，洗滌 3 次，加入二抗室溫孵育 1 h，加入顯影液，上機曝光。以 ADSCs 作為對照，方法步驟同上。③ ADSC-Exos 粒徑分布分析：取濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 100 μL 重懸于 1.5 mL PBS 內，經納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 進行檢測。
1.4 ADSC-Exos 與 HUVECs 共培養觀察
1.4.1 ADSC-Exos 能否進入 HUVECs 觀察
取濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 備用液 100 μL 重懸于 1 mL PBS 內，然后加入 4 μL PKH26 熒光染料溶液，37℃ 孵育 20 min 后，將混合物于 4℃ 條件下，以 100 000×g 離心 70 min，棄上清液，并將 ADSC-Exos 輕輕重懸于 10 mL PBS 中；于 4℃ 條件下，100 000×g 離心 70 min，以去除多余染料，棄上清液，將 ADSC-Exos 重懸于 100 μL PBS 中備用。
取第 5 代 HUVECs 重懸于無血清培養基中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中，待細胞貼壁后加入上述 PKH26 熒光標記的 ADSC-Exos，孵育 12 h 后采用 PBS 洗滌細胞 2 次，4% 多聚甲醛固定、DAPI 染色。共聚焦熒光顯微鏡下觀察 ADSC-Exos 是否進入細胞，鏡下 PKH26 熒光標記的 ADSC-Exos 呈紅色熒光。
1.4.2 ADSC-Exos 對 HUVECs 增殖的影響
取對數生長期的第 5 代 HUVECs，消化離心后用無血清培養基重懸，調整細胞密度為 1×104個/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL 細胞懸液。置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，24 h 后待細胞完全貼壁棄培養液，每孔加入無血清培養基 90 μL，然后將細胞分為兩組，其中實驗組添加濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 10 μL，對照組添加等量 PBS；每孔液體體積均為 100 μL。分別培養 1、2、3、4、5 d，每組取 5 孔，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，繼續孵育 2 h 后，采用多功能酶標儀檢測各孔在 450 nm 波長下的吸光度（A）值。
1.4.3 ADSC-Exos 對 HUVECs 遷移能力的影響
取對數期生長期的第 5 代 HUVECs，用無血清培養基重懸，調整細胞密度為 2×105個/mL。實驗分為兩組，Transwell 上室均接種 200 μL 細胞懸液；實驗組下室加入無血清培養基 500 μL 和 100 μg/mL ADSC-Exos 10 μL，對照組下室加入無血清培養基 500 μL 和 PBS 10 μL。24 h 后終止培養，用無菌棉簽輕輕拭去上室殘留細胞，4% 多聚甲醛固定 20 min，棄去固定液，蒸餾水漂洗 2 次，結晶紫染色 20 min，棄去染液，蒸餾水沖洗后于倒置相差顯微鏡下觀察，每組取 6 個隨機視野計數跨膜遷移細胞，取均值。實驗重復 3 次。
1.4.4 ADSC-Exos 體外促進 HUVECs 管樣結構形成實驗
將 Matrigel 基質膠置于 96 孔板中，37℃ 孵育 30 min 使其凝固。用無血清培養基重懸第 5 代 HUVECs 后接種至 96 孔板中，每孔 2×104個細胞。實驗分為兩組：實驗組加入含 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 10 μL，對照組添加等量 PBS。每組 5 個復孔。于 37℃ 處理 12 h 后，倒置相差顯微鏡下觀察管狀結構形成情況，計數每孔管樣結構數量。
1.4.5 ADSC-Exos 體內促進 HUVECs 成血管實驗
將 1×106個 HUVECs 與 0.5 mL Matrigel 基質膠混合。取 12 只 BALB/c 裸鼠，腹腔注射 1.5% 戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，將上述混合液聯合 100 μL 含 ADSC-Exos（100 μg/mL）的 PBS 混懸液，共 0.6 mL，注入右側背部皮下，作為實驗組；將以上混合液聯合 100 μL PBS 緩沖液，共 0.6 mL，注入左側背部皮下，作為對照組。2 周后裸鼠同上法麻醉后背部切開，大體觀察 Matrigel 基質膠凝固為膠栓，切取基質膠栓置于 4% 多聚甲醛固定 4 h，石蠟切片（片厚 5～8 μm），CD34 免疫組織化學染色，倒置相差顯微鏡下觀察膠栓內新生血管情況，隨機取 6 個視野高倍鏡下計數微血管，取均值即為平均血管密度（mean blood vessel density，MVD）。
1.4.6 ELISA 法檢測細胞上清液 VEGF 蛋白表達
取第 5 代 HUVECs 用無血清培養基重懸后，按 5×104個/孔密度接種至 24 孔板，實驗組加入濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 10 μL，對照組加入等量 PBS。每組 5 個復孔。37℃ 培養 12 h 后，取兩組細胞上清液，采用 ELISA 試劑盒檢測 VEGF 蛋白表達。同時采用 ELISA 法檢測 10 μL 濃度為 100 μg/mL ADSC-Exos 中 VEGF 蛋白的表達。
1.5 統計學方法
采用 Graphpad Prism 6 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs 的細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代細胞培養 2～3 d 后貼壁生長，7 d 左右可融合至 80%。HE 染色示，第 3 代 ADSCs 形態為均一長梭形，細胞生長密集后呈漩渦狀排列，可見密集的貼壁細胞。流式細胞術結果顯示，第 3 代 ADSCs 陽性表達 CD49d、CD90、CD105，陰性表達 CD34、CD45、CD106。成脂誘導培養 3 d，倒置相差顯微鏡下可見細胞質中有折光度高的透亮脂滴形成；培養 14 d 后脂滴逐漸增多變大，細胞形態飽滿，細胞質內脂滴形成較多，并融合形成大脂滴，油紅 O 染色呈陽性。見圖 1。
圖1
ADSCs 培養觀察
a. 第 3 代 ADSCs HE 染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b. 第 3 代 ADSCs 誘導 14 d 油紅 O 染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）；c～e. 第 3 代 ADSCs 流式細胞術鑒定
Figure1. Identification of ADSCsa. Morphological observation of the 3rd generation ADSCs by HE staining (Inverted phase contrast microscope×100); b. Oil red O staining observation of the 3rd generation ADSCs after adipogenic induction for 14 days (Inverted phase contrast microscope×200); c-e. Flow cytometry identification of the 3rd generation ADSCs
2.2 ADSC-Exos 鑒定
透射電鏡觀察示，ADSC-Exos 為大小均勻、形態一致的圓形或橢圓形膜性囊泡，邊緣清晰。Western blot 檢測示，ADSC-Exos 高表達標志蛋白 Alix 和 CD63，而未檢測到干細胞中表達的 β-actin，表明分離出的 ADSC-Exos 未受干細胞成分污染。納米顆粒蹤跟分析儀 NanoSight 檢測示，ADSC-Exos 粒徑范圍為 30～200 nm，符合外泌體粒徑范圍。見圖 2。
圖2
ADSC-Exos 鑒定
a. 透射電鏡觀察 ADSC-Exos 形態（×49 k）；b. Western blot 檢測 ADSC-Exos 膜表面標志性蛋白 Alix 和 CD63 的表達 Mr：相對分子質量 1：ADSC-Exos 2：ADSCs；c. 納米顆粒蹤跟分析儀檢測 ADSC-Exos 粒徑分布
Figure2. Identification of ADSC-Exosa. Morphology observation of ADSC-Exos by transmission electron microscopy (×49 k); b. Expressions of surface signature proteins Alix and CD63 by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: ADSC-Exos 2: ADSCs; c. Detection of ADSC-Exos particle size distribution by nanoparticle tracking analyzer
2.3 ADSC-Exos 與 HUVECs 共培養觀察
2.3.1 ADSC-Exos 能否進入 HUVECs 觀察
共聚焦顯微鏡下可見 ADSC-Exos 被 HUVECs 攝取并分布在細胞核周圍，表明 ADSC-Exos 可進入 HUVECs。見圖 3。
圖3
共聚焦顯微鏡觀察 ADSC-Exos 能否進入 HUVECs（×630）
從左至右分別為 DAPI、PKH26 及二者重疊
Figure3. Confocal microscopy to observe whether ADSC-Exos could absorbed by HUVECs (×630)From left to right for DAPI, PKH26, and merge
2.3.2 ADSC-Exos 對 HUVECs 增殖及遷移能力的影響
CCK-8 法檢測示，實驗組各時間點 A 值均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。Transwell 遷移實驗結果示，實驗組跨膜遷移細胞數為（216.7±23.6）個，較對照組（85.1±4.1）個顯著增多，比較差異有統計學意義（t=9.534，P=0.000）。見圖 5。
圖4
CCK-8 法檢測兩組不同時間點 A 值
Figure4.
The A value at different time points in 2 groups by CCK-8 assay
圖5
Transwell 遷移實驗（倒置相差顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure5. Transwell migration experiment results (Inverted phase contrast microscope×200)a. Control group; b. Experimental group
2.3.3 ADSC-Exos 體外促進 HUVECs 管樣結構形成實驗
倒置相差顯微鏡觀察示，對照組僅形成未封閉的多邊形樣結構，實驗組有更多的管樣結構；實驗組形成管樣結構比對照組更快速、結構更復雜。見圖 6。實驗組管樣結構數為（76.0±5.0）個/孔，明顯多于對照組的（36.0±2.6）個/孔，比較差異有統計學意義（t=15.910，P=0.000）。
圖6
Matrigel 基質膠內管樣結構形成觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. Observation of tube-like structures formation in Matrigel (Inverted phase contrast microscope×200)a. Control group; b. Experimental group
2.3.4 ADSC-Exos 體內促進 HUVECs 成血管實驗
皮下移植 Matrigel 基質膠 2 周后，Matrigel 基質膠凝固為膠栓，實驗組有血管長入膠栓，而對照組無血管或較少血管長入。免疫組織化學染色示，實驗組 MVD 為（33.4±3.6）個，顯著高于對照組的（12.8±2.2）個，比較差異有統計學意義（t=16.710，P=0.000）。見圖 7。
圖7
免疫組織化學染色觀察 Matrigel 基質膠內新生血管（倒置相差顯微鏡×400）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Immunohistochemical staining for neovascularization in Matrigel (Inverted phase contrast microscope×400)a. Control group; b. Experimental group
2.4 ELISA 法檢測細胞上清液 VEGF 蛋白表達
培養 12 h，實驗組細胞上清液 VEGF 蛋白表達量為（164.1±10.2）pg/mL，明顯高于對照組的（49.2±6.2）pg/mL，比較差異有統計學意義（t=21.470，P=0.000）。10 μL 濃度為 100 μg/mL ADSC-Exos 中 VEGF 蛋白表達量為（5.2±2.6） pg/mL。
3 討論
近年來，Deveza 等[8]發現 ADSCs 上清液有促進 HUVECs 增殖和遷移作用，說明在促進血管新生方面其旁分泌作用可能扮演了重要角色，而旁分泌的外泌體可能就是其中的關鍵。外泌體最早是由 Johnstone 等[9]在體外培養的綿羊網織紅細胞上清液中發現，研究表明幾乎所有細胞均可分泌，并廣泛存在于母乳、尿液、羊水等體液中[10]。外泌體參與了免疫監視、炎性反應以及腫瘤發生發展多種生理病理過程[11]，在細胞間信息交流中起到重要作用[12]。鑒于外泌體特性與其來源的細胞有關，我們推測 ADSC-Exos 可促進血管新生。
目前研究顯示，缺血組織的血管修復主要機制為血管發生和血管新生。血管發生是指在胚胎形成過程中，內皮祖細胞遷移到血管化部位，分化成內皮細胞，并聚結形成初始血管叢[13]。來自現有血管的新毛細血管分支的萌芽被稱為血管新生[14]。研究發現，循環血液中存在內皮祖細胞，當機體發生創傷、缺血等病理變化時，內皮祖細胞遷移并定植在損傷缺血部位，分泌促血管生成因子，促進側支血管生長至缺血組織，參與組織的血管新生，促進組織修復[15]。
我們通過建立 ADSC-Exos 與 HUVECs 共培養體系，發現 ADSC-Exos 可以進入 HUVECs 細胞質，并促進 HUVECs 增殖、遷移及管樣分化。同時，我們將 HUVECs 與 Matrigel 基質膠混合后聯合 ADSC-Exos 注入裸鼠皮下，觀察到 14 d 后血管數量顯著高于對照組。由此可見，ADSC-Exos 具有體內促血管新生作用，可用于組織工程血管的構建。相比于干細胞移植，采用干細胞外泌體促進血管新生具有更大的優勢。首先，外泌體體積更微小，不會堵塞微血管，可以穿過血腦屏障，在干細胞無法到達的微環境發揮作用[16]；其次，外泌體更易于保存，–20℃ 保存 6 個月不會喪失其生物活性[17]，同時也避免了干細胞移植可能出現的過度增殖和致瘤性；最后，在疾病治療中，外泌體的用量可以根據治療進程隨時更改，具有充分的可調控性和安全性[18]，還可以開發攜帶 microRNA 或蛋白的外泌體，以克服親本干細胞的過度增殖和致瘤風險[19]。這些特征都顯示出外泌體優于細胞療法，為無細胞治療的開發提供了思路[18]。但是目前外泌體的作用機制尚不明確，相關文獻報道，外泌體內攜帶多種 microRNA 和蛋白，移植后可進入宿主細胞并向該宿主細胞靶向傳遞 microRNA，從而影響其生物活性[7]。因此，結合 ELISA 檢測結果，我們推測 ADSC-Exos 在被 HUVECs 攝取的同時，可能將這些物質導入 HUVECs 內，調控其生物學功能，促進 VEGF 的分泌，而不是 ADSC-Exos 中 VEGF 單純疊加，進而促進 HUVECs 的增殖、遷移和管樣分化。
但是，外泌體中的 microRNA 及蛋白成分極其復雜，本研究并未涉及其促血管生成的 microRNA 或蛋白，有關其成分及具體機制將在后續研究中繼續探索。此外，近年學者們通過動物實驗發現多種細胞和組織來源的外泌體具有促進創面修復的生物學功能，但其具體作用機制還有待研究 [20]。下一步我們會將 ADSC-Exos 運用于更貼近臨床病例的動物模型中，如糖尿病創面或皮瓣移植等動物模型，觀察 ADSC-Exos 對創面愈合或組織移植后的作用，更有利于探索 ADSC-Exos 的臨床應用前景。
脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是人體儲量最為豐富的 MSCs，因具有獲取途徑方便、對供區損傷小、干細胞儲量大等優勢，常用于多種組織再生與修復治療中[1]。有研究證明，ADSCs 移植可促進血管新生[2]。進一步研究發現，移植的 ADSCs 主要通過旁分泌方式調控組織微環境，包括免疫調節、趨化宿主干細胞等[3]。
細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是細胞間溝通的關鍵工具，通過轉運蛋白質、生物活性磷脂和 RNA 等來參與細胞之間的通訊[4]。EV 共分為 3 種：凋亡小體、外泌體和微泡。其中外泌體是由體內多種細胞分泌的納米級囊泡，其表面和內部含多種生物活性物質，包括 microRNA 及多種蛋白質[5-6]。現已明確外泌體可參與細胞間的信息交流，主要通過識別細胞表面信號分子并結合或與靶細胞膜融合，將其攜帶的內容物導入受體細胞，進而影響受體細胞[7]。由此可見，外泌體可影響細胞間通訊，且外泌體攜帶來源于親代細胞的 microRNA、蛋白質和脂質等[3]，提示 ADSCs 來源外泌體（ADSCs released exosomes，ADSC-Exos）可能在促血管形成方面有重要作用。為此，我們用 ADSC-Exos 與人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）共培養，觀察 ADSC-Exos 處理后的 HUVECs 細胞增殖、遷移及管樣分化情況，以期為促進血管新生提供新思路及新方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 6 周齡雄性單純 T 細胞缺陷 BALB/c 裸鼠 12 只，體質量（20±5）g，由南昌大學實驗動物中心提供。
實驗用游離脂肪組織由在南昌大學第二附屬醫院整形美容科接受吸脂術的健康女性自愿捐贈，患者年齡 25～40 歲，本研究獲醫院倫理委員會批準。HUVECs 購自美國 Sciencell 公司。DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、油紅 O 染色劑、PKH26 細胞膜標記熒光染色劑（Sigma 公司，美國）；鼠抗人 CD34、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106 多克隆抗體（eBioscience 公司，美國）；Matrigel 基質膠、Transwell 小室（Corning 公司，美國）；BCA 蛋白質定量試劑盒、細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；表面標志物 Alix、CD63、β-actin 多克隆抗體（Abcam 公司，美國）。
倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；CO2 培養箱、多功能酶標儀（Thermo 公司，美國）；透射電鏡（ZEISS 公司，德國）；納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight（Malvern 公司，英國）；共聚焦熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；超高速離心機（Beckman 公司，美國）。
1.2 ADSCs 分離培養與鑒定
無菌條件下，采集吸脂術獲得的游離脂肪組織 10 mL，PBS 反復沖洗去除血液、結締組織后，加入等體積 0.2%Ⅰ型膠原酶，置于 37℃ 恒溫水浴箱消化，直至變為糊狀。200 μm 金屬篩網過濾后，以離心半徑 20 cm、1 200 r/min 離心 5 min，棄上清，保留最下層的沉淀。培養基重懸沉淀后接種于培養瓶內，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，2～3 d 后首次換液，之后每隔 1 d 換液 1 次，待細胞融合至 90% 后傳代。取第 3 代細胞行 HE 染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化；流式細胞術鑒定細胞表面標志性抗原 CD49d、CD90、CD105、CD34、CD45、CD106；采用成脂分化培養基誘導培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化，14 d 后油紅 O 染色觀察成脂分化情況。
1.3 ADSC-Exos 分離純化及鑒定
1.3.1 ADSC-Exos 分離純化
4℃ 條件下，FBS 經 100 000×g 超速離心 7 h 后，取上清液制備去除外泌體的完全培養基。取對數生長期的第 3 代 ADSCs，用去除外泌體的完全培養基培養 48 h 后，收集上清培養液，密度梯度離心法分離、提取外泌體。具體操作如下：4℃ 條件下， 300×g 離心 10 min，棄沉淀；3 000×g 離心 20 min，棄沉淀；10 000×g 離心 30 min，棄沉淀；100 000×g 離心 70 min，收集沉淀，PBS 重懸；再次 100 000×g 離心 70 min，去上清，以 PBS 重懸，0.22 μm 濾膜過濾。將獲取的 ADSC-Exos 于–80℃ 保存備用。
1.3.2 ADSC-Exos 鑒定
① 透射電鏡觀察 ADSC-Exos 形態：取 ADSC-Exos 10 μL 滴于透射電鏡專用的載樣銅網上，常溫靜置 2 min，濾紙吸去浮液，用 1%（W/V）磷鎢酸溶液染色 5 min 后，濾紙吸去多余染色液，晾干，透射電鏡觀察 ADSC-Exos 形態。② Western blot 檢測 ADSC-Exos 膜表面標志性蛋白：取 ADSC-Exos 以 100 000×g 離心 90 min 后，棄上清，加入 100 μL RIPA 裂解液，吹打使裂解液和 ADSC-Exos 充分混合，冰上裂解 30 min。4℃、12 000 ×g 離心 30 min，吸取上清液置于 1.5 mL EP 管中，–80℃ 凍存。BCA 法檢測蛋白濃度，加入 5×Loading Buffer，99℃ 變性 10 min。取 40 μg/孔上樣至 10%SDS-PAGE 膠，80 V 電泳 30 min，120 V 電泳 1 h，采用濕法轉膜，220 mA 轉膜 1 h，5%牛血清白蛋白室溫封閉 1 h，5%牛血清白蛋白稀釋一抗 Alix、CD63、β-actin，4℃ 孵育一抗過夜。TBST 漂洗 10 min，洗滌 3 次，加入二抗室溫孵育 1 h，加入顯影液，上機曝光。以 ADSCs 作為對照，方法步驟同上。③ ADSC-Exos 粒徑分布分析：取濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 100 μL 重懸于 1.5 mL PBS 內，經納米顆粒跟蹤分析儀 NanoSight 進行檢測。
1.4 ADSC-Exos 與 HUVECs 共培養觀察
1.4.1 ADSC-Exos 能否進入 HUVECs 觀察
取濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 備用液 100 μL 重懸于 1 mL PBS 內，然后加入 4 μL PKH26 熒光染料溶液，37℃ 孵育 20 min 后，將混合物于 4℃ 條件下，以 100 000×g 離心 70 min，棄上清液，并將 ADSC-Exos 輕輕重懸于 10 mL PBS 中；于 4℃ 條件下，100 000×g 離心 70 min，以去除多余染料，棄上清液，將 ADSC-Exos 重懸于 100 μL PBS 中備用。
取第 5 代 HUVECs 重懸于無血清培養基中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中，待細胞貼壁后加入上述 PKH26 熒光標記的 ADSC-Exos，孵育 12 h 后采用 PBS 洗滌細胞 2 次，4% 多聚甲醛固定、DAPI 染色。共聚焦熒光顯微鏡下觀察 ADSC-Exos 是否進入細胞，鏡下 PKH26 熒光標記的 ADSC-Exos 呈紅色熒光。
1.4.2 ADSC-Exos 對 HUVECs 增殖的影響
取對數生長期的第 5 代 HUVECs，消化離心后用無血清培養基重懸，調整細胞密度為 1×104個/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL 細胞懸液。置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，24 h 后待細胞完全貼壁棄培養液，每孔加入無血清培養基 90 μL，然后將細胞分為兩組，其中實驗組添加濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 10 μL，對照組添加等量 PBS；每孔液體體積均為 100 μL。分別培養 1、2、3、4、5 d，每組取 5 孔，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，繼續孵育 2 h 后，采用多功能酶標儀檢測各孔在 450 nm 波長下的吸光度（A）值。
1.4.3 ADSC-Exos 對 HUVECs 遷移能力的影響
取對數期生長期的第 5 代 HUVECs，用無血清培養基重懸，調整細胞密度為 2×105個/mL。實驗分為兩組，Transwell 上室均接種 200 μL 細胞懸液；實驗組下室加入無血清培養基 500 μL 和 100 μg/mL ADSC-Exos 10 μL，對照組下室加入無血清培養基 500 μL 和 PBS 10 μL。24 h 后終止培養，用無菌棉簽輕輕拭去上室殘留細胞，4% 多聚甲醛固定 20 min，棄去固定液，蒸餾水漂洗 2 次，結晶紫染色 20 min，棄去染液，蒸餾水沖洗后于倒置相差顯微鏡下觀察，每組取 6 個隨機視野計數跨膜遷移細胞，取均值。實驗重復 3 次。
1.4.4 ADSC-Exos 體外促進 HUVECs 管樣結構形成實驗
將 Matrigel 基質膠置于 96 孔板中，37℃ 孵育 30 min 使其凝固。用無血清培養基重懸第 5 代 HUVECs 后接種至 96 孔板中，每孔 2×104個細胞。實驗分為兩組：實驗組加入含 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 10 μL，對照組添加等量 PBS。每組 5 個復孔。于 37℃ 處理 12 h 后，倒置相差顯微鏡下觀察管狀結構形成情況，計數每孔管樣結構數量。
1.4.5 ADSC-Exos 體內促進 HUVECs 成血管實驗
將 1×106個 HUVECs 與 0.5 mL Matrigel 基質膠混合。取 12 只 BALB/c 裸鼠，腹腔注射 1.5% 戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，將上述混合液聯合 100 μL 含 ADSC-Exos（100 μg/mL）的 PBS 混懸液，共 0.6 mL，注入右側背部皮下，作為實驗組；將以上混合液聯合 100 μL PBS 緩沖液，共 0.6 mL，注入左側背部皮下，作為對照組。2 周后裸鼠同上法麻醉后背部切開，大體觀察 Matrigel 基質膠凝固為膠栓，切取基質膠栓置于 4% 多聚甲醛固定 4 h，石蠟切片（片厚 5～8 μm），CD34 免疫組織化學染色，倒置相差顯微鏡下觀察膠栓內新生血管情況，隨機取 6 個視野高倍鏡下計數微血管，取均值即為平均血管密度（mean blood vessel density，MVD）。
1.4.6 ELISA 法檢測細胞上清液 VEGF 蛋白表達
取第 5 代 HUVECs 用無血清培養基重懸后，按 5×104個/孔密度接種至 24 孔板，實驗組加入濃度為 100 μg/mL 的 ADSC-Exos 10 μL，對照組加入等量 PBS。每組 5 個復孔。37℃ 培養 12 h 后，取兩組細胞上清液，采用 ELISA 試劑盒檢測 VEGF 蛋白表達。同時采用 ELISA 法檢測 10 μL 濃度為 100 μg/mL ADSC-Exos 中 VEGF 蛋白的表達。
1.5 統計學方法
采用 Graphpad Prism 6 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs 的細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代細胞培養 2～3 d 后貼壁生長，7 d 左右可融合至 80%。HE 染色示，第 3 代 ADSCs 形態為均一長梭形，細胞生長密集后呈漩渦狀排列，可見密集的貼壁細胞。流式細胞術結果顯示，第 3 代 ADSCs 陽性表達 CD49d、CD90、CD105，陰性表達 CD34、CD45、CD106。成脂誘導培養 3 d，倒置相差顯微鏡下可見細胞質中有折光度高的透亮脂滴形成；培養 14 d 后脂滴逐漸增多變大，細胞形態飽滿，細胞質內脂滴形成較多，并融合形成大脂滴，油紅 O 染色呈陽性。見圖 1。
圖1
ADSCs 培養觀察
a. 第 3 代 ADSCs HE 染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b. 第 3 代 ADSCs 誘導 14 d 油紅 O 染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）；c～e. 第 3 代 ADSCs 流式細胞術鑒定
Figure1. Identification of ADSCsa. Morphological observation of the 3rd generation ADSCs by HE staining (Inverted phase contrast microscope×100); b. Oil red O staining observation of the 3rd generation ADSCs after adipogenic induction for 14 days (Inverted phase contrast microscope×200); c-e. Flow cytometry identification of the 3rd generation ADSCs
2.2 ADSC-Exos 鑒定
透射電鏡觀察示，ADSC-Exos 為大小均勻、形態一致的圓形或橢圓形膜性囊泡，邊緣清晰。Western blot 檢測示，ADSC-Exos 高表達標志蛋白 Alix 和 CD63，而未檢測到干細胞中表達的 β-actin，表明分離出的 ADSC-Exos 未受干細胞成分污染。納米顆粒蹤跟分析儀 NanoSight 檢測示，ADSC-Exos 粒徑范圍為 30～200 nm，符合外泌體粒徑范圍。見圖 2。
圖2
ADSC-Exos 鑒定
a. 透射電鏡觀察 ADSC-Exos 形態（×49 k）；b. Western blot 檢測 ADSC-Exos 膜表面標志性蛋白 Alix 和 CD63 的表達 Mr：相對分子質量 1：ADSC-Exos 2：ADSCs；c. 納米顆粒蹤跟分析儀檢測 ADSC-Exos 粒徑分布
Figure2. Identification of ADSC-Exosa. Morphology observation of ADSC-Exos by transmission electron microscopy (×49 k); b. Expressions of surface signature proteins Alix and CD63 by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: ADSC-Exos 2: ADSCs; c. Detection of ADSC-Exos particle size distribution by nanoparticle tracking analyzer
2.3 ADSC-Exos 與 HUVECs 共培養觀察
2.3.1 ADSC-Exos 能否進入 HUVECs 觀察
共聚焦顯微鏡下可見 ADSC-Exos 被 HUVECs 攝取并分布在細胞核周圍，表明 ADSC-Exos 可進入 HUVECs。見圖 3。
圖3
共聚焦顯微鏡觀察 ADSC-Exos 能否進入 HUVECs（×630）
從左至右分別為 DAPI、PKH26 及二者重疊
Figure3. Confocal microscopy to observe whether ADSC-Exos could absorbed by HUVECs (×630)From left to right for DAPI, PKH26, and merge
2.3.2 ADSC-Exos 對 HUVECs 增殖及遷移能力的影響
CCK-8 法檢測示，實驗組各時間點 A 值均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。Transwell 遷移實驗結果示，實驗組跨膜遷移細胞數為（216.7±23.6）個，較對照組（85.1±4.1）個顯著增多，比較差異有統計學意義（t=9.534，P=0.000）。見圖 5。
圖4
CCK-8 法檢測兩組不同時間點 A 值
Figure4.
The A value at different time points in 2 groups by CCK-8 assay
圖5
Transwell 遷移實驗（倒置相差顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure5. Transwell migration experiment results (Inverted phase contrast microscope×200)a. Control group; b. Experimental group
2.3.3 ADSC-Exos 體外促進 HUVECs 管樣結構形成實驗
倒置相差顯微鏡觀察示，對照組僅形成未封閉的多邊形樣結構，實驗組有更多的管樣結構；實驗組形成管樣結構比對照組更快速、結構更復雜。見圖 6。實驗組管樣結構數為（76.0±5.0）個/孔，明顯多于對照組的（36.0±2.6）個/孔，比較差異有統計學意義（t=15.910，P=0.000）。
圖6
Matrigel 基質膠內管樣結構形成觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. Observation of tube-like structures formation in Matrigel (Inverted phase contrast microscope×200)a. Control group; b. Experimental group
2.3.4 ADSC-Exos 體內促進 HUVECs 成血管實驗
皮下移植 Matrigel 基質膠 2 周后，Matrigel 基質膠凝固為膠栓，實驗組有血管長入膠栓，而對照組無血管或較少血管長入。免疫組織化學染色示，實驗組 MVD 為（33.4±3.6）個，顯著高于對照組的（12.8±2.2）個，比較差異有統計學意義（t=16.710，P=0.000）。見圖 7。
圖7
免疫組織化學染色觀察 Matrigel 基質膠內新生血管（倒置相差顯微鏡×400）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Immunohistochemical staining for neovascularization in Matrigel (Inverted phase contrast microscope×400)a. Control group; b. Experimental group
2.4 ELISA 法檢測細胞上清液 VEGF 蛋白表達
培養 12 h，實驗組細胞上清液 VEGF 蛋白表達量為（164.1±10.2）pg/mL，明顯高于對照組的（49.2±6.2）pg/mL，比較差異有統計學意義（t=21.470，P=0.000）。10 μL 濃度為 100 μg/mL ADSC-Exos 中 VEGF 蛋白表達量為（5.2±2.6） pg/mL。
3 討論
近年來，Deveza 等[8]發現 ADSCs 上清液有促進 HUVECs 增殖和遷移作用，說明在促進血管新生方面其旁分泌作用可能扮演了重要角色，而旁分泌的外泌體可能就是其中的關鍵。外泌體最早是由 Johnstone 等[9]在體外培養的綿羊網織紅細胞上清液中發現，研究表明幾乎所有細胞均可分泌，并廣泛存在于母乳、尿液、羊水等體液中[10]。外泌體參與了免疫監視、炎性反應以及腫瘤發生發展多種生理病理過程[11]，在細胞間信息交流中起到重要作用[12]。鑒于外泌體特性與其來源的細胞有關，我們推測 ADSC-Exos 可促進血管新生。
目前研究顯示，缺血組織的血管修復主要機制為血管發生和血管新生。血管發生是指在胚胎形成過程中，內皮祖細胞遷移到血管化部位，分化成內皮細胞，并聚結形成初始血管叢[13]。來自現有血管的新毛細血管分支的萌芽被稱為血管新生[14]。研究發現，循環血液中存在內皮祖細胞，當機體發生創傷、缺血等病理變化時，內皮祖細胞遷移并定植在損傷缺血部位，分泌促血管生成因子，促進側支血管生長至缺血組織，參與組織的血管新生，促進組織修復[15]。
我們通過建立 ADSC-Exos 與 HUVECs 共培養體系，發現 ADSC-Exos 可以進入 HUVECs 細胞質，并促進 HUVECs 增殖、遷移及管樣分化。同時，我們將 HUVECs 與 Matrigel 基質膠混合后聯合 ADSC-Exos 注入裸鼠皮下，觀察到 14 d 后血管數量顯著高于對照組。由此可見，ADSC-Exos 具有體內促血管新生作用，可用于組織工程血管的構建。相比于干細胞移植，采用干細胞外泌體促進血管新生具有更大的優勢。首先，外泌體體積更微小，不會堵塞微血管，可以穿過血腦屏障，在干細胞無法到達的微環境發揮作用[16]；其次，外泌體更易于保存，–20℃ 保存 6 個月不會喪失其生物活性[17]，同時也避免了干細胞移植可能出現的過度增殖和致瘤性；最后，在疾病治療中，外泌體的用量可以根據治療進程隨時更改，具有充分的可調控性和安全性[18]，還可以開發攜帶 microRNA 或蛋白的外泌體，以克服親本干細胞的過度增殖和致瘤風險[19]。這些特征都顯示出外泌體優于細胞療法，為無細胞治療的開發提供了思路[18]。但是目前外泌體的作用機制尚不明確，相關文獻報道，外泌體內攜帶多種 microRNA 和蛋白，移植后可進入宿主細胞并向該宿主細胞靶向傳遞 microRNA，從而影響其生物活性[7]。因此，結合 ELISA 檢測結果，我們推測 ADSC-Exos 在被 HUVECs 攝取的同時，可能將這些物質導入 HUVECs 內，調控其生物學功能，促進 VEGF 的分泌，而不是 ADSC-Exos 中 VEGF 單純疊加，進而促進 HUVECs 的增殖、遷移和管樣分化。
但是，外泌體中的 microRNA 及蛋白成分極其復雜，本研究并未涉及其促血管生成的 microRNA 或蛋白，有關其成分及具體機制將在后續研究中繼續探索。此外，近年學者們通過動物實驗發現多種細胞和組織來源的外泌體具有促進創面修復的生物學功能，但其具體作用機制還有待研究 [20]。下一步我們會將 ADSC-Exos 運用于更貼近臨床病例的動物模型中，如糖尿病創面或皮瓣移植等動物模型，觀察 ADSC-Exos 對創面愈合或組織移植后的作用，更有利于探索 ADSC-Exos 的臨床應用前景。
