引用本文： 朱元正, 易陽艷, 陽水發, 張靜, 吳舒, 王朝慧. 攜帶肝細胞生長因子基因慢病毒轉染人脂肪來源干細胞復合纖維蛋白膠支架構建可注射型組織工程脂肪的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(9): 1111-1118. doi: 10.7507/1002-1892.201704094 復制
臨床上軟組織缺損的修復，尤其是顏面部組織缺損的重塑是整形外科常見問題。目前，臨床采用的透明質酸注射不能長久維持外形，假體移植存在填充后外觀不自然、手感不柔和等缺點，自體脂肪移植存在因早期血管化不充分而保留率較低的缺陷[1]。因此，以液態支架材料構建可注射型組織工程脂肪，具有重要的臨床應用價值，可穩定存活、長期保留，達到結構和功能的雙重修復作用，而且不需開放式外科手術，可能為軟組織缺損修復提供優良的填充材料[2]。我們的前期研究通過將人脂肪來源干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）與不同濃度纖維蛋白膠支架進行體外三維培養，發現 hADSCs 可在纖維蛋白膠支架內穩定增殖，提示纖維蛋白膠有良好的生物相容性[3]。同時，還有相關研究表明纖維蛋白膠可通過促進移植區的血管新生，來提高脂肪移植的保留率[4]。
肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是目前已知的生物活性最廣泛的非特異性生長因子之一，具有強大的促進血管生成作用。我們前期研究以腺病毒為載體將 HGF 基因轉染至hADSCs，結果提示其在受染細胞內不發生整合，因此無致癌和致突變風險，而且 HGF 基因可在較長時期內過表達 HGF ，進而發揮生物學作用，加快移植脂肪的血管化進程，從而促進移植脂肪的存 活[5]。HGF 的強大促血管形成等功能聯合 hADSCs 的多重干細胞治療作用，對組織移植早期血管新生有重要意義。因此，我們將攜帶 HGF 基因的 hADSCs 復合纖維蛋白膠支架注入動物體內，采用組織學檢測等手段來判斷移植物的存活、保留及血管化情況，旨在為軟組織缺損修復提供一種新型的、可靠的組織工程修復方式。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 6 周齡單純 T 細胞缺陷 BALB/c 雌性裸鼠 10 只，體質量<20 g，由南昌大學實驗動物中心提供。
游離脂肪組織取自南昌大學第二附屬醫院整形美容科多名 20～45 歲健康女性腹部吸脂術后廢棄的脂肪組織。受術者術前均知情同意，本研究獲南昌大學醫學院倫理委員會批準。
DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、纖維蛋白原、凝血酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、油紅 O 染色劑（Sigma 公司，美國）；鼠抗人 CD34、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106 多克隆抗體（eBioscience 公司，美國）；慢病毒載體 HGF-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-LVs（上海漢恒生物科技有限公司）。倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；CO2 培養箱、多功能酶標儀（Thermo 公司，美國）。
1.2 hADSCs 的提取、擴增及鑒定
1.2.1 hADSCs 的提取、擴增 取捐獻的脂肪組織 10 mL 置于離心管中，與等體積 1.0 mg/mL Ⅰ型膠原酶溶液混勻后，置于 37℃ 恒溫水浴中消化 30 min，期間震蕩混勻 2～3 次。以離心半徑 20 cm、1 200 r/min 離心 5 min，去上層油脂及水分，保留沉淀，用完全培養基（含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基）重懸。200 μm 篩網過濾后，同上法離心，完全培養基重懸沉淀。用細胞計數板計數細胞懸液，取（1～2）×104個細胞接種至 25 cm2培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 孵箱中培養。48 h 后首次換液，之后 2～3 d 換液 1 次，待細胞融合達 80% 后傳代。取第 3 代細胞行 HE 染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.2.2 hADSCs 的鑒定 ① 流式細胞術檢測 hADSCs 表面抗原：取第 3 代 hADSCs，用 以 1∶1 比例混合的 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 消化后，以離心半徑 20 cm、800 r/min 離心 5 min；棄上清，加少量 PBS 吹打均勻，制備密度為 1×109個/L 的單細胞懸液。用 EP 管收集細胞懸液（100 μL/管），每管分別加入 5 μL 兩種不同熒光素標記的流式抗體，用同型藻紅蛋白標記的免疫球蛋白（PE-IgG）和異硫氰酸熒光標記的免疫球蛋白（FITC-IgG）作為對照，避光孵育 30 min；PBS 洗滌 2 次，去除多余抗體，同上法離心后棄上清，每管加入 500 μL PBS 重懸，上機行雙熒光標記檢測。
② hADSCs 成脂誘導鑒定：取 1×105個第 3 代 hADSCs，接種于置有蓋玻片的 6 孔培養板上，待細胞貼壁融合至 80%，換液去上清，加入成脂誘導培養基（含 10%FBS、1 μmol/L 地塞米松、10 μmol/L 胰島素、0.5 mmol/L IBMX、200 μmol/L 吲哚美辛的 H-DMEM 培養基），每周換液 2～3 次。定期觀察細胞形態變化，陰性對照用完全培養基培養。培養 14 d 后取細胞爬片，PBS 洗滌后 4% 多聚甲醛固定 5 min，PBS 洗滌后加入油紅 O 染色 15 min，PBS 再次洗滌后置于倒置相差顯微鏡下，觀察有無呈紅染的脂滴。
1.3 慢病毒搭載 HGF 轉染 hADSCs
取 1×105個第 3 代 hADSCs，接種于 6 孔培養板，加入完全培養基培養直至細胞融合達 40%～50%，分別加入感染復數（multiplicity of infection，MOI）為 10、30、50、100 的 HGF-GFP-LVs，同時加入 Ploybrene 稀釋液，8 h 后更換完全培養基。轉染 72 h 后，熒光顯微鏡下觀察病毒轉染情況，不同 MOI 組隨機取 10 個高倍鏡視野，計數綠色熒光標記的細胞和總細胞，以二者比值作為 HGF-GFP-LVs 轉染效率。選擇轉染效率較高的對應 MOI 作為實驗最適 MOI。轉染后每 48 小時，采用 ELISA 法檢測經最適 MOI HGF-GFP-LVs 轉染后的 hADSCs 與未轉染的 hADSCs，其培養基上清液中HGF 蛋白表達量。 hADSCs 轉染后再次傳代，熒光顯微鏡觀察熒光是否衰減。
1.4 hADSCs 復合纖維蛋白膠支架移植
1.4.1 實驗分組及方法 取經最適 MOI HGF-GFP-LVs 轉染的第 3 代 hADSCs 以及未轉染的第 3 代 hADSCs，同1.2.2中方法行成脂誘導 14 d 后，用 0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化，以離心半徑 20 cm、800 r/min 離心 5 min；去上清，取離心管底部 hADSCs 用 500 U/mL 凝血酶溶液重懸，吹打后形成密度為 1×107個/mL 的細胞懸液。然后將纖維蛋白原在 PBS 溶液中溶解，稀釋為最適濃度 25 mg/mL[3]。
取裸鼠 10 只，以1.5% 戊巴比妥腹腔注射麻醉（40 mg/kg），通過雙聯注射器分別抽取 0.2 mL 含轉染 HGF-GFP-LVs 并成脂誘導 hADSCs 的凝血酶溶液和 0.2 mL 纖維蛋白原溶液，通過內徑為 0.5 mm 的 7 號針頭注入裸鼠背部右側皮下（轉染組）；通過雙聯注射器分別抽取0.2 mL 含單純成脂誘導的 hADSCs 凝血酶溶液以及0.2 mL 纖維蛋白原溶液，同法注入裸鼠背部左側皮下（未轉染組）；通過雙聯注射器分別抽取 0.2 mL 空白凝血酶溶液以及 0.2 mL 纖維蛋白原溶液器，同法注入裸鼠頸后正中皮下（空白對照組）。
1.4.2 觀測指標 ① 一般情況：注射后觀察實驗動物存活、活動、皮膚有無排斥反應等情況。② 大體觀察：移植后 12 周，腹腔注射過量戊巴比妥處死全部裸鼠，取出移植材料測定濕重。③ HE 染色觀察：取轉染組和未轉染組新生組織，經 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，脫水，石蠟包埋，切片，片厚 0.2 cm。兩組各隨機取 10 張切片，于200 倍鏡下每張切片取 15 個視野，計數新生脂肪細胞，取均值。④ 熒光顯微鏡觀察：取轉染組切片，熒光顯微鏡下觀察 GFP 熒光標記物在組織中的定位。⑤ 免疫熒光染色觀察：轉染組和未轉染組各隨機取10 張切片，于200 倍鏡下每張切片取 15 個視野，計數血管斷面，并計算血管密度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS11.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hADSCs 形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察見，原代細胞培養 7 d 左右即融合至 80%，傳代后生長迅速。HE 染色示，第 3 代 hADSCs 呈成纖維細胞樣形態，長梭形，倒置相差顯微鏡下可見密集的貼壁細胞呈漩渦狀分布。見圖 1。
流式細胞術檢測示，第 3 代 hADSCs 高表達 CD49d、CD90、CD105，不表達或極低表達 CD34、CD45、CD106。見圖 2。
成脂誘導培養 3 d，倒置相差顯微鏡下可見細胞中有透亮脂滴形成，之后脂滴逐漸增多變大；培養 14 d 后細胞形態飽滿，細胞內脂滴形成較多，可見融合而成的大脂滴，經油紅 O 染色呈紅色。見圖 3。
2.2 HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 效率檢測
HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 后 72 h，熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光。MOI 為 10、30、50、100 時，HGF-GFP-LVs 轉染效率分別為 41.8%±3.6%、64.5%±3.9%、81.9%±3.2%、82.3%±3.4%，MOI 為 50 和 100 時轉染效率較高，確定本實驗 HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 的最適 MOI 為 50。見圖 4。HGF-GFP-LVs 以最適 MOI 轉染 hADSCs 后，綠色熒光持續表達，且傳代后無明顯衰減。見圖 5。ELISA 法檢測示，未轉染的hADSCs 其 HGF 蛋白表達量較平穩；hADSCs 經 HGF-GFP-LVs 轉染后，其 HGF 蛋白表達量在前 6 d 呈上升趨勢，之后趨于穩定。見圖 6。
2.3 動物實驗觀察
2.3.1 一般情況 實驗動物麻醉蘇醒后，均能自如活動、正常飲食。注射局部未見皮膚紅腫，無排斥反應發生。所有動物取材前均無死亡。
2.3.2 大體觀察 移植后 12 周處死動物取出移植材料，轉染組及未轉染組均可見外觀類似于脂肪組織的新生物，而空白對照組未見組織新生物。見圖 7。轉染組和未轉染組新生物濕重分別為（32.30±4.06）mg 和（25.27±3.94）mg，兩組比較差異有統計學意義（t=3.929，P=0.001）。
2.3.3 HE 染色觀察 轉染組新生物組織結構與正常脂肪組織相似，含少量纖維樣結構；未轉染組新生物脂肪樣組織較少，纖維樣結構較多。轉染組新生脂肪細胞數為（126.93±5.36）個/視野，顯著高于未轉染組的（71.36±4.52）個/視野，兩組比較差異有統計學意義（t=30.700，P=0.000）。見圖 8。
2.3.4 熒光顯微鏡觀察 熒光顯微鏡下可見轉染組組織新生物部分單房脂肪細胞發出網狀綠色熒光，說明組織內含有 GFP 標記的外源性 hADSCs。見圖 9。
2.3.5 免疫熒光染色觀察 熒光顯微鏡下觀察，轉染組新生血管顯著多于未轉染組。轉染組血管密度為（16.37±2.76）個/視野，顯著高于未轉染組的（9.13±1.68）個/視野，兩組比較差異有統計學意義（t=8.678，P=0.000）。見圖 10。
圖1
HE 染色觀察第 3 代 hADSCs 形態（倒置相差顯微 鏡×200）
Figure1.
Morphological observation of the 3rd generation hADSCs by HE staining (Inverted phase contrast microscope×200)
圖2
第 3 代 hADSCs 流式細胞術鑒定
a. CD34-CD105；b. CD45-CD106；c. CD90-CD49d
Figure2. Flow cytometry identification of the 3rd generation hADSCsa. CD34-CD105; b. CD45-CD106; c. CD90-CD49d
圖3
第 3 代 hADSCs 成脂誘導 14 d 油紅 O 染色觀察（倒 置相差顯微鏡×200）
Figure3.
Oil red O staining observation of the 3rd generation hADSCs after adipogenic induction for 14 days (Inverted phase contrast microscope×200)
圖4
各 MOI 值 HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 后 72 h 熒光顯微鏡觀察（×200）
a. MOI 為 10；b. MOI 為 30；c. MOI 為 50；d. MOI 為 100
Figure4. Fluorescence microscope observation of hADSCs transfected by HGF-GFP-LVs of different MOI for 72 hours (×200)a. MOI of 10; b. MOI of 30; c. MOI of 50; d. MOI of 100
圖5
MOI 為 50 的 HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 傳代后熒 光表達無衰減（熒光顯微鏡×200）
Figure5.
hADSCs transfected by HGF-GFP-LVs with MOI of 50 showed no attenuation after passaged (Fluore- scence microscope×200)
圖6
ELISA 法檢測細胞 HGF 蛋白表達量
Figure6.
HGF protein expression of hADSCs detected by ELISA assay
圖7
移植后 12 周轉染組及未轉染組組織新生物大體觀察
Figure7.
General observation of new-born tissue in transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection
圖8
移植后 12 周轉染組及未轉染組新生物 HE 染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. 轉染組；b. 未轉染組
Figure8. HE staining observation of new-born tissue in transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection (Inverted phase contrast microscope×200)a. Transfected group; b. Untransfected group
圖9
移植 12 周轉染組熒光顯微鏡觀察新生物脂肪細胞 攜帶綠色熒光情況（×200）
Figure9.
Observation of the mature adipose cells in transfected group carried green fluorescence by fluorescence microscope after 12 weeks of injection (×200)
圖10
移植 12 周轉染組與未轉染組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
a. 轉染組；b. 未轉染組
Figure10. Immunofluorescence staining observation of transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection (Fluorescence microscope×200)a. Transfected group; b. Untransfected group
3 討論
相關研究顯示[6]，HGF 可與多能干細胞細胞膜上的特異性受體 c-Met 結合，通過 HGF/c-Met 通路產生生物學效應，引起一系列信號轉導的酶促級聯放大效應，由此激活下游生長因子受體結合蛋白 2 和接頭蛋白 1，以及該信號通路與其他信號通路間交叉對話而發揮其生物活性作用。HGF 不僅具有強大的促血管新生作用，還具有調節膠原合成和炎性反應、誘導細胞有絲分裂、抑制細胞凋亡等生物學效應，已廣泛應用于病理型瘢痕、心肌缺血等的治療研究[7]。還有研究表明[8]，HGF 可提供一個關鍵的趨化信號誘導干細胞遷移至 HGF 濃度較高的區域，在組織工程中可趨化宿主循環血中的干細胞遷移至移植區。此外，有研究發現 HGF 可誘導干細胞分化為血管內皮細胞，直接參與新生血管的生成[9]。本實驗采用慢病毒搭載 HGF 基因轉染 hADSCs，經 ELISA 檢測培養基上清液中的 HGF 蛋白表達量在轉染后前 6 d 呈遞增趨勢，之后趨于穩定，且均高于未轉染 hADSCs。轉染 HGF 的種子細胞可提高移植區 HGF 的濃度，有利于移植早期快速建立血運，提高移植物的保留率[10-12]。
纖維蛋白膠是從血漿中提取的纖維蛋白原和凝血酶混合后聚合而成的纖維蛋白凝膠[13-14]。本課題組前期研究發現[3]，纖維蛋白膠的濃度可直接影響種子細胞的活性，在體外三維培養模式下，高濃度的纖維蛋白膠（>50 mg/mL）對 hADSCs 的生長具有明顯抑制作用，而纖維蛋白原濃度低于 25 mg/mL 時hADSCs 存活良好，因此以 25 mg/mL 作為本實驗最適纖維蛋白原濃度。本實驗分別將轉染及未轉染 HGF 的 hADSCs 行成脂誘導 14 d 后懸于凝血酶溶液中，與最適濃度的纖維蛋白原溶液混合，通過雙聯注射器注入裸鼠背部皮下形成凝膠。實驗發現，轉染組和未轉染組移植 12 周后均可見外觀類似脂肪組織的新生物。經組織學檢測發現，轉染組可見大量單房脂肪細胞和少量纖維結締組織，未轉染組可見少量單房脂肪細胞和大量纖維結締組織；轉染組的新生物濕重和血管密度均高于未轉染組。而空白對照組在移植 12 周取材時未見新生組織，說明纖維蛋白膠支架在 3 個月內已被宿主吸收。在轉染組移植物中可見發出綠色熒光的脂肪細胞，說明部分 GFP 標記的 hADSCs 在組織中保留 12 周并分化為脂肪細胞。本研究結果表明，慢病毒搭載 HGF 基因轉染 hADSCs 復合纖維蛋白膠支架構建可注射型組織工程脂肪是可行的，且攜帶 HGF 基因的種子細胞具有更強的生物活性，通過促進移植物的血管新生，從而提高移植物的保留率。
本研究中轉染組還有部分脂肪細胞未見綠色熒光，這部分脂肪細胞可能是由宿主干細胞分化而來。根據國內外研究提示[15-18]，這部分宿主干細胞的來源可能為 BMSCs 通過循環血來到移植區，也可能是移植區周邊的干細胞直接遷移并分化為脂肪細胞。由此可見，本研究中獲取的脂肪組織新生物可能由外源性種子細胞和宿主干細胞共同參與形成。
綜上述，慢病毒攜帶 HGF基因轉染 hADSCs 復合纖維蛋白膠支架構建可注射型組織工程脂肪具有以下優點：① 導入 HGF 基因的 hADSCs 作為種子細胞具有更強的生物活性，可通過釋放 HGF 促進移植后的血管新生，從而提高移植物最終的保留率；② 纖維蛋白膠作為支架材料，具有良好的生物相容性，可促進種子細胞增殖分化，在移植后 12 周內完全降解；③ 可注射型組織工程脂肪植入體內不遺留瘢痕，可用于多種軟組織缺損修復及美容填充，具有廣闊的臨床應用前景。但本研究觀察到的新生物體積較小，且存在一定纖維化現象，尚不能滿足臨床要求。有研究指出[19-21]，通過人工調整細胞支架材料的剛度，可誘導ADSCs的成脂分化，增加移植物保留率。如何降低移植后的纖維化，提高種子細胞的增殖、分化能力，則是本課題組后續研究方向。
臨床上軟組織缺損的修復，尤其是顏面部組織缺損的重塑是整形外科常見問題。目前，臨床采用的透明質酸注射不能長久維持外形，假體移植存在填充后外觀不自然、手感不柔和等缺點，自體脂肪移植存在因早期血管化不充分而保留率較低的缺陷[1]。因此，以液態支架材料構建可注射型組織工程脂肪，具有重要的臨床應用價值，可穩定存活、長期保留，達到結構和功能的雙重修復作用，而且不需開放式外科手術，可能為軟組織缺損修復提供優良的填充材料[2]。我們的前期研究通過將人脂肪來源干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）與不同濃度纖維蛋白膠支架進行體外三維培養，發現 hADSCs 可在纖維蛋白膠支架內穩定增殖，提示纖維蛋白膠有良好的生物相容性[3]。同時，還有相關研究表明纖維蛋白膠可通過促進移植區的血管新生，來提高脂肪移植的保留率[4]。
肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是目前已知的生物活性最廣泛的非特異性生長因子之一，具有強大的促進血管生成作用。我們前期研究以腺病毒為載體將 HGF 基因轉染至hADSCs，結果提示其在受染細胞內不發生整合，因此無致癌和致突變風險，而且 HGF 基因可在較長時期內過表達 HGF ，進而發揮生物學作用，加快移植脂肪的血管化進程，從而促進移植脂肪的存 活[5]。HGF 的強大促血管形成等功能聯合 hADSCs 的多重干細胞治療作用，對組織移植早期血管新生有重要意義。因此，我們將攜帶 HGF 基因的 hADSCs 復合纖維蛋白膠支架注入動物體內，采用組織學檢測等手段來判斷移植物的存活、保留及血管化情況，旨在為軟組織缺損修復提供一種新型的、可靠的組織工程修復方式。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 6 周齡單純 T 細胞缺陷 BALB/c 雌性裸鼠 10 只，體質量<20 g，由南昌大學實驗動物中心提供。
游離脂肪組織取自南昌大學第二附屬醫院整形美容科多名 20～45 歲健康女性腹部吸脂術后廢棄的脂肪組織。受術者術前均知情同意，本研究獲南昌大學醫學院倫理委員會批準。
DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、纖維蛋白原、凝血酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、油紅 O 染色劑（Sigma 公司，美國）；鼠抗人 CD34、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106 多克隆抗體（eBioscience 公司，美國）；慢病毒載體 HGF-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-LVs（上海漢恒生物科技有限公司）。倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；CO2 培養箱、多功能酶標儀（Thermo 公司，美國）。
1.2 hADSCs 的提取、擴增及鑒定
1.2.1 hADSCs 的提取、擴增 取捐獻的脂肪組織 10 mL 置于離心管中，與等體積 1.0 mg/mL Ⅰ型膠原酶溶液混勻后，置于 37℃ 恒溫水浴中消化 30 min，期間震蕩混勻 2～3 次。以離心半徑 20 cm、1 200 r/min 離心 5 min，去上層油脂及水分，保留沉淀，用完全培養基（含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基）重懸。200 μm 篩網過濾后，同上法離心，完全培養基重懸沉淀。用細胞計數板計數細胞懸液，取（1～2）×104個細胞接種至 25 cm2培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 孵箱中培養。48 h 后首次換液，之后 2～3 d 換液 1 次，待細胞融合達 80% 后傳代。取第 3 代細胞行 HE 染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.2.2 hADSCs 的鑒定 ① 流式細胞術檢測 hADSCs 表面抗原：取第 3 代 hADSCs，用 以 1∶1 比例混合的 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 消化后，以離心半徑 20 cm、800 r/min 離心 5 min；棄上清，加少量 PBS 吹打均勻，制備密度為 1×109個/L 的單細胞懸液。用 EP 管收集細胞懸液（100 μL/管），每管分別加入 5 μL 兩種不同熒光素標記的流式抗體，用同型藻紅蛋白標記的免疫球蛋白（PE-IgG）和異硫氰酸熒光標記的免疫球蛋白（FITC-IgG）作為對照，避光孵育 30 min；PBS 洗滌 2 次，去除多余抗體，同上法離心后棄上清，每管加入 500 μL PBS 重懸，上機行雙熒光標記檢測。
② hADSCs 成脂誘導鑒定：取 1×105個第 3 代 hADSCs，接種于置有蓋玻片的 6 孔培養板上，待細胞貼壁融合至 80%，換液去上清，加入成脂誘導培養基（含 10%FBS、1 μmol/L 地塞米松、10 μmol/L 胰島素、0.5 mmol/L IBMX、200 μmol/L 吲哚美辛的 H-DMEM 培養基），每周換液 2～3 次。定期觀察細胞形態變化，陰性對照用完全培養基培養。培養 14 d 后取細胞爬片，PBS 洗滌后 4% 多聚甲醛固定 5 min，PBS 洗滌后加入油紅 O 染色 15 min，PBS 再次洗滌后置于倒置相差顯微鏡下，觀察有無呈紅染的脂滴。
1.3 慢病毒搭載 HGF 轉染 hADSCs
取 1×105個第 3 代 hADSCs，接種于 6 孔培養板，加入完全培養基培養直至細胞融合達 40%～50%，分別加入感染復數（multiplicity of infection，MOI）為 10、30、50、100 的 HGF-GFP-LVs，同時加入 Ploybrene 稀釋液，8 h 后更換完全培養基。轉染 72 h 后，熒光顯微鏡下觀察病毒轉染情況，不同 MOI 組隨機取 10 個高倍鏡視野，計數綠色熒光標記的細胞和總細胞，以二者比值作為 HGF-GFP-LVs 轉染效率。選擇轉染效率較高的對應 MOI 作為實驗最適 MOI。轉染后每 48 小時，采用 ELISA 法檢測經最適 MOI HGF-GFP-LVs 轉染后的 hADSCs 與未轉染的 hADSCs，其培養基上清液中HGF 蛋白表達量。 hADSCs 轉染后再次傳代，熒光顯微鏡觀察熒光是否衰減。
1.4 hADSCs 復合纖維蛋白膠支架移植
1.4.1 實驗分組及方法 取經最適 MOI HGF-GFP-LVs 轉染的第 3 代 hADSCs 以及未轉染的第 3 代 hADSCs，同1.2.2中方法行成脂誘導 14 d 后，用 0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化，以離心半徑 20 cm、800 r/min 離心 5 min；去上清，取離心管底部 hADSCs 用 500 U/mL 凝血酶溶液重懸，吹打后形成密度為 1×107個/mL 的細胞懸液。然后將纖維蛋白原在 PBS 溶液中溶解，稀釋為最適濃度 25 mg/mL[3]。
取裸鼠 10 只，以1.5% 戊巴比妥腹腔注射麻醉（40 mg/kg），通過雙聯注射器分別抽取 0.2 mL 含轉染 HGF-GFP-LVs 并成脂誘導 hADSCs 的凝血酶溶液和 0.2 mL 纖維蛋白原溶液，通過內徑為 0.5 mm 的 7 號針頭注入裸鼠背部右側皮下（轉染組）；通過雙聯注射器分別抽取0.2 mL 含單純成脂誘導的 hADSCs 凝血酶溶液以及0.2 mL 纖維蛋白原溶液，同法注入裸鼠背部左側皮下（未轉染組）；通過雙聯注射器分別抽取 0.2 mL 空白凝血酶溶液以及 0.2 mL 纖維蛋白原溶液器，同法注入裸鼠頸后正中皮下（空白對照組）。
1.4.2 觀測指標 ① 一般情況：注射后觀察實驗動物存活、活動、皮膚有無排斥反應等情況。② 大體觀察：移植后 12 周，腹腔注射過量戊巴比妥處死全部裸鼠，取出移植材料測定濕重。③ HE 染色觀察：取轉染組和未轉染組新生組織，經 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，脫水，石蠟包埋，切片，片厚 0.2 cm。兩組各隨機取 10 張切片，于200 倍鏡下每張切片取 15 個視野，計數新生脂肪細胞，取均值。④ 熒光顯微鏡觀察：取轉染組切片，熒光顯微鏡下觀察 GFP 熒光標記物在組織中的定位。⑤ 免疫熒光染色觀察：轉染組和未轉染組各隨機取10 張切片，于200 倍鏡下每張切片取 15 個視野，計數血管斷面，并計算血管密度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS11.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hADSCs 形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察見，原代細胞培養 7 d 左右即融合至 80%，傳代后生長迅速。HE 染色示，第 3 代 hADSCs 呈成纖維細胞樣形態，長梭形，倒置相差顯微鏡下可見密集的貼壁細胞呈漩渦狀分布。見圖 1。
流式細胞術檢測示，第 3 代 hADSCs 高表達 CD49d、CD90、CD105，不表達或極低表達 CD34、CD45、CD106。見圖 2。
成脂誘導培養 3 d，倒置相差顯微鏡下可見細胞中有透亮脂滴形成，之后脂滴逐漸增多變大；培養 14 d 后細胞形態飽滿，細胞內脂滴形成較多，可見融合而成的大脂滴，經油紅 O 染色呈紅色。見圖 3。
2.2 HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 效率檢測
HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 后 72 h，熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光。MOI 為 10、30、50、100 時，HGF-GFP-LVs 轉染效率分別為 41.8%±3.6%、64.5%±3.9%、81.9%±3.2%、82.3%±3.4%，MOI 為 50 和 100 時轉染效率較高，確定本實驗 HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 的最適 MOI 為 50。見圖 4。HGF-GFP-LVs 以最適 MOI 轉染 hADSCs 后，綠色熒光持續表達，且傳代后無明顯衰減。見圖 5。ELISA 法檢測示，未轉染的hADSCs 其 HGF 蛋白表達量較平穩；hADSCs 經 HGF-GFP-LVs 轉染后，其 HGF 蛋白表達量在前 6 d 呈上升趨勢，之后趨于穩定。見圖 6。
2.3 動物實驗觀察
2.3.1 一般情況 實驗動物麻醉蘇醒后，均能自如活動、正常飲食。注射局部未見皮膚紅腫，無排斥反應發生。所有動物取材前均無死亡。
2.3.2 大體觀察 移植后 12 周處死動物取出移植材料，轉染組及未轉染組均可見外觀類似于脂肪組織的新生物，而空白對照組未見組織新生物。見圖 7。轉染組和未轉染組新生物濕重分別為（32.30±4.06）mg 和（25.27±3.94）mg，兩組比較差異有統計學意義（t=3.929，P=0.001）。
2.3.3 HE 染色觀察 轉染組新生物組織結構與正常脂肪組織相似，含少量纖維樣結構；未轉染組新生物脂肪樣組織較少，纖維樣結構較多。轉染組新生脂肪細胞數為（126.93±5.36）個/視野，顯著高于未轉染組的（71.36±4.52）個/視野，兩組比較差異有統計學意義（t=30.700，P=0.000）。見圖 8。
2.3.4 熒光顯微鏡觀察 熒光顯微鏡下可見轉染組組織新生物部分單房脂肪細胞發出網狀綠色熒光，說明組織內含有 GFP 標記的外源性 hADSCs。見圖 9。
2.3.5 免疫熒光染色觀察 熒光顯微鏡下觀察，轉染組新生血管顯著多于未轉染組。轉染組血管密度為（16.37±2.76）個/視野，顯著高于未轉染組的（9.13±1.68）個/視野，兩組比較差異有統計學意義（t=8.678，P=0.000）。見圖 10。
圖1
HE 染色觀察第 3 代 hADSCs 形態（倒置相差顯微 鏡×200）
Figure1.
Morphological observation of the 3rd generation hADSCs by HE staining (Inverted phase contrast microscope×200)
圖2
第 3 代 hADSCs 流式細胞術鑒定
a. CD34-CD105；b. CD45-CD106；c. CD90-CD49d
Figure2. Flow cytometry identification of the 3rd generation hADSCsa. CD34-CD105; b. CD45-CD106; c. CD90-CD49d
圖3
第 3 代 hADSCs 成脂誘導 14 d 油紅 O 染色觀察（倒 置相差顯微鏡×200）
Figure3.
Oil red O staining observation of the 3rd generation hADSCs after adipogenic induction for 14 days (Inverted phase contrast microscope×200)
圖4
各 MOI 值 HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 后 72 h 熒光顯微鏡觀察（×200）
a. MOI 為 10；b. MOI 為 30；c. MOI 為 50；d. MOI 為 100
Figure4. Fluorescence microscope observation of hADSCs transfected by HGF-GFP-LVs of different MOI for 72 hours (×200)a. MOI of 10; b. MOI of 30; c. MOI of 50; d. MOI of 100
圖5
MOI 為 50 的 HGF-GFP-LVs 轉染 hADSCs 傳代后熒 光表達無衰減（熒光顯微鏡×200）
Figure5.
hADSCs transfected by HGF-GFP-LVs with MOI of 50 showed no attenuation after passaged (Fluore- scence microscope×200)
圖6
ELISA 法檢測細胞 HGF 蛋白表達量
Figure6.
HGF protein expression of hADSCs detected by ELISA assay
圖7
移植后 12 周轉染組及未轉染組組織新生物大體觀察
Figure7.
General observation of new-born tissue in transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection
圖8
移植后 12 周轉染組及未轉染組新生物 HE 染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. 轉染組；b. 未轉染組
Figure8. HE staining observation of new-born tissue in transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection (Inverted phase contrast microscope×200)a. Transfected group; b. Untransfected group
圖9
移植 12 周轉染組熒光顯微鏡觀察新生物脂肪細胞 攜帶綠色熒光情況（×200）
Figure9.
Observation of the mature adipose cells in transfected group carried green fluorescence by fluorescence microscope after 12 weeks of injection (×200)
圖10
移植 12 周轉染組與未轉染組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
a. 轉染組；b. 未轉染組
Figure10. Immunofluorescence staining observation of transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection (Fluorescence microscope×200)a. Transfected group; b. Untransfected group
3 討論
相關研究顯示[6]，HGF 可與多能干細胞細胞膜上的特異性受體 c-Met 結合，通過 HGF/c-Met 通路產生生物學效應，引起一系列信號轉導的酶促級聯放大效應，由此激活下游生長因子受體結合蛋白 2 和接頭蛋白 1，以及該信號通路與其他信號通路間交叉對話而發揮其生物活性作用。HGF 不僅具有強大的促血管新生作用，還具有調節膠原合成和炎性反應、誘導細胞有絲分裂、抑制細胞凋亡等生物學效應，已廣泛應用于病理型瘢痕、心肌缺血等的治療研究[7]。還有研究表明[8]，HGF 可提供一個關鍵的趨化信號誘導干細胞遷移至 HGF 濃度較高的區域，在組織工程中可趨化宿主循環血中的干細胞遷移至移植區。此外，有研究發現 HGF 可誘導干細胞分化為血管內皮細胞，直接參與新生血管的生成[9]。本實驗采用慢病毒搭載 HGF 基因轉染 hADSCs，經 ELISA 檢測培養基上清液中的 HGF 蛋白表達量在轉染后前 6 d 呈遞增趨勢，之后趨于穩定，且均高于未轉染 hADSCs。轉染 HGF 的種子細胞可提高移植區 HGF 的濃度，有利于移植早期快速建立血運，提高移植物的保留率[10-12]。
纖維蛋白膠是從血漿中提取的纖維蛋白原和凝血酶混合后聚合而成的纖維蛋白凝膠[13-14]。本課題組前期研究發現[3]，纖維蛋白膠的濃度可直接影響種子細胞的活性，在體外三維培養模式下，高濃度的纖維蛋白膠（>50 mg/mL）對 hADSCs 的生長具有明顯抑制作用，而纖維蛋白原濃度低于 25 mg/mL 時hADSCs 存活良好，因此以 25 mg/mL 作為本實驗最適纖維蛋白原濃度。本實驗分別將轉染及未轉染 HGF 的 hADSCs 行成脂誘導 14 d 后懸于凝血酶溶液中，與最適濃度的纖維蛋白原溶液混合，通過雙聯注射器注入裸鼠背部皮下形成凝膠。實驗發現，轉染組和未轉染組移植 12 周后均可見外觀類似脂肪組織的新生物。經組織學檢測發現，轉染組可見大量單房脂肪細胞和少量纖維結締組織，未轉染組可見少量單房脂肪細胞和大量纖維結締組織；轉染組的新生物濕重和血管密度均高于未轉染組。而空白對照組在移植 12 周取材時未見新生組織，說明纖維蛋白膠支架在 3 個月內已被宿主吸收。在轉染組移植物中可見發出綠色熒光的脂肪細胞，說明部分 GFP 標記的 hADSCs 在組織中保留 12 周并分化為脂肪細胞。本研究結果表明，慢病毒搭載 HGF 基因轉染 hADSCs 復合纖維蛋白膠支架構建可注射型組織工程脂肪是可行的，且攜帶 HGF 基因的種子細胞具有更強的生物活性，通過促進移植物的血管新生，從而提高移植物的保留率。
本研究中轉染組還有部分脂肪細胞未見綠色熒光，這部分脂肪細胞可能是由宿主干細胞分化而來。根據國內外研究提示[15-18]，這部分宿主干細胞的來源可能為 BMSCs 通過循環血來到移植區，也可能是移植區周邊的干細胞直接遷移并分化為脂肪細胞。由此可見，本研究中獲取的脂肪組織新生物可能由外源性種子細胞和宿主干細胞共同參與形成。
綜上述，慢病毒攜帶 HGF基因轉染 hADSCs 復合纖維蛋白膠支架構建可注射型組織工程脂肪具有以下優點：① 導入 HGF 基因的 hADSCs 作為種子細胞具有更強的生物活性，可通過釋放 HGF 促進移植后的血管新生，從而提高移植物最終的保留率；② 纖維蛋白膠作為支架材料，具有良好的生物相容性，可促進種子細胞增殖分化，在移植后 12 周內完全降解；③ 可注射型組織工程脂肪植入體內不遺留瘢痕，可用于多種軟組織缺損修復及美容填充，具有廣闊的臨床應用前景。但本研究觀察到的新生物體積較小，且存在一定纖維化現象，尚不能滿足臨床要求。有研究指出[19-21]，通過人工調整細胞支架材料的剛度，可誘導ADSCs的成脂分化，增加移植物保留率。如何降低移植后的纖維化，提高種子細胞的增殖、分化能力，則是本課題組后續研究方向。
