引用本文： 趙亞紅, 牛長梅, 龔佳歡, 王鴻博, 楊宇民. 靜電紡絲石墨烯/絲素蛋白納米膜的構建及體外生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(9): 1119-1126. doi: 10.7507/1002-1892.201703046 復制
周圍神經損傷是臨床常見問題，在創傷患者中發病率約 2.8%[1-2]。周圍神經一定程度上能夠再生[3]，但較長周圍神經缺損的修復仍存在許多障礙[4-5]。組織工程神經有望解決這一難題，目前已進行了大量研究[6-7]。但組織工程神經通常不具備活性，修復較長神經缺損的效果仍遠不及自體神經。因此，制備理想的支架材料是一個具有挑戰性的任務。考慮到神經組織本身的結構和電生理特性，合適的支架材料不僅需具有獨特表面形貌，以改善神經細胞和支架之間的相互作用、調控細胞生長，同時也需要與在體神經形成良好的電生理整合[8-9]。
伴隨著生物材料研究的快速發展，新型導電納米材料已應用于組織工程神經研究領域，其中碳基材料，如石墨、富勒烯、納米管和納米帶等，因具有良好的機械性能和導電性，受到了研究人員的關注[10]。石墨烯（graphene，Gr）是碳基材料的重要成員，是具有蜂窩晶格結構的 sp2雜化碳原子的二維單層片材，其特殊的分子構型使其具有優越的物化性質，如高電導率和熱導率、高機械強度以及強光電性[11-12]；但因存在高疏水性、難以均勻分散、化學穩定難以與化學試劑反應以及缺乏生物相容性等缺點，應用大大受限[13]。為克服這些缺點，有研究將天然生物大分子結合至 Gr 表面[14]。絲素蛋白（silk fibroin，SF）具有優越的理化性能，越來越多應用于組織工程支架的制備[15-16]。靜電紡絲技術環節少、設備簡單、操作方便，是制備納米/微米纖維膜的簡便方法，采用靜電紡絲制備的納米纖維支架材料已廣泛應用于骨、血管、神經、軟骨、皮膚等組織工程研究領域[17-19]。
本研究利用靜電紡絲技術制備 Gr-SF 納米膜并檢測其理化性能，探討不同濃度 Gr 對 Gr-SF 納米膜理化性能的影響；同時通過 L929 細胞毒性和雪旺細胞共培養實驗，探討細胞相容性好、促進神經細胞生長的 Gr 最佳濃度，為神經組織工程研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM 培養基、FBS、青鏈霉素、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；多聚賴氨酸（Sigma 公司，美國）；天然蠶絲（南通海安鑫緣蠶絲有限公司）；Gr 納米片層粉末[型號 G0441；梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]；EdU 劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）。DSA20 測角器（Gmbh Hambur 公司，德國）；激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國）；酶標儀（Bio-Tek 公司，美國）。
1.2 Gr-SF 靜電紡絲溶液的配制及檢測
1.2.1 不同質量分數Gr-SF靜電紡絲溶液的配制 取天然蠶絲，經 0.5% Na2CO3 水溶液 100℃ 煮沸 30 min，重復 3 次，獲得 SF 纖維。根據 Yang 等[20]方法制備 SF 溶液：將 SF 纖維溶于 CaCl2/H2O/EtOH（1∶8∶2）三元體系中，80℃、1 h；隨后于透析袋（截留分子量 12 000～14 000）中室溫透析 3 d。然后將 SF 溶液置于不銹鋼皿中風干成膜，再溶解至 98% 甲酸中獲得 SF 質量分數為 13% 的靜電紡絲溶液。將 Gr 納米片層粉末溶于 13% 靜電紡絲溶液中，分別制備 Gr 質量分數為 0、5%、10%、15%、20% 的 Gr-SF 靜電紡絲溶液，磁力攪拌器室溫攪拌，然后用超聲波發生器進行超聲處理 60 min，720 W 進行聲波降解，頻率 20 kHz。
1.2.2 靜態接觸角測定 用 DSA20 測角器，采用滴液法[21]測量不同質量分數（0、5%、10%、15%、20%）Gr-SF 靜電紡絲溶液的靜態接觸角，測量前 1 h 制備溶液。各 Gr-SF 靜電紡絲溶液設 3 個平行樣，每個樣品測量 3 次，取均值。
1.3 Gr-SF 納米膜制備及化學處理
自制靜電紡絲接收裝置，由一高電壓供應裝置組成，包括用 1 個毛細管針（內徑 0.9 mm，針尖內裝有靜電紡絲溶液的液滴）制成的陽極發生器和 1 個絕緣收集板制成的陰極收集器；發生器針尖和收集器間距離為 7～13 cm，通過注射泵維持恒定體積流速為 0.3 mL/h，使靜電紡絲溶液維持于針管內。使用針尖對陽極發生器施加 20 kV 高壓，最終在絕緣不銹鋼負載的載玻片上形成靜電紡絲膜。取靜電紡絲膜置于無水乙醇中 10 min 以誘導構象轉變，隨后用蒸餾水 37℃ 洗滌 72 h，去除殘余甲酸。采用上述方法制備 0、5%、10%、15%、20%Gr-SF 納米膜（分別設為 A、B、C、D、E 組）。
1.4 Gr-SF 納米膜觀測指標
1.4.1 Gr-SF納米膜表面性狀觀察 大體觀察各組 Gr-SF 納米膜顏色，光鏡及掃描電鏡下觀察 Gr-SF 納米膜表面、纖維排列以及 Gr 顆粒分散情況。
1.4.2 電導率檢測 采用電化學工作站循環伏安法，于室溫下檢測各組 Gr-SF 納米膜電導率。實驗采用典型的三電極系統[包括鉑網電極、Ag/AgCl 電極（飽和 KCl）參考電極和玻碳工作電極]，在含 5.0 mmol/L Fe（CN）64–/3–的 0.1 mol/L KCl 中測量膜表面電化學性能（100～600 mV），掃描速率 100 mV/s，探針間距 10 mm。各組取 3 個樣品，每個樣品測 3 次，取均值。
1.4.3 孔隙率檢測 采用溶液置換法[22]檢測各組 Gr-SF 納米膜孔隙率。以正己烷溶液作為置換液，將 Gr-SF 納米膜浸于已知體積（V1）的正己烷溶液中 5 min，記錄總體積（V2）；將膜取出，記錄剩余體積（V3）。按以下公式計算 Gr-SF 納米膜孔隙率：（V1–V3）/（V2–V3）×100%。
1.4.4 體外細胞毒性檢測 ① Gr-SF 納米膜浸提液的制備：將滅菌后的各組 Gr-SF 納米膜分別置于離心管中，按 GB/T16886-ISO10993 標準以表面積 6 cm2Gr-SF 納米膜加 1 mL 培養基的比例加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，（37.0±0.5）℃ 浸泡（72.0±0.5）h，制備的浸提液必須在 12 h 內使用。② 體外細胞毒性檢測：根據 ISO-10993 標準采用 MTT 法檢測 Gr-SF 納米膜體外細胞毒性。取 L929 細胞（中國科學院上海生命科學研究院），然后按照 5 000 個/孔密度接種于 96 孔板中，分別與 100 μL 各組 Gr-SF 納米膜浸提液于 37℃ 下孵育 1、4、7 d，每組設 6 個復孔，完全培養基為對照組，無細胞孔為調零孔，實驗重復 3 次。孵育后各時間點去除培養基，PBS 洗滌細胞 3 次；每孔加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，繼續培養 4 h；棄上清液，每孔加入 100 μL DMSO；用 EIX-800 Microelisa 讀數器，在 570 nm 波長下測量吸光度（A）值，以每孔與調零孔 A 值的差值作為最終 A 值，取均值。
1.5 Gr-SF 納米膜對雪旺細胞形態及增殖的影響
1.5.1 雪旺細胞分離培養 參照文獻[23]方法分離培養雪旺細胞：新生 1～3 d SD 大鼠 6 只，雌雄不限，由南通大學實驗動物中心提供。無菌條件下取出大鼠兩側坐骨神經，剝膜后置于 1 mg/mL 膠原酶和 0.125% 胰蛋白酶消化 30 min，以 1×106個/mL 密度接種于多聚賴氨酸包被的培養皿中；置于 37℃、5%CO2 培養箱中，24 h 后更換為含 10 μmol/L β-阿糖胞苷的 DMEM 培養基，培養 24 h 后更換為含 2 mmol/L Forskolin、10 ng/mL Heregulin 及 10%FBS 的 DMEM 培養基，每 3 天換液 1 次；3～5 d 待細胞生長至融合后，消化收集細胞懸液，加成纖維細胞特異性抗體 Thy 1.1（按照 1∶1 000 比例稀釋于含 10%FBS 的 DMEM 培養基）；冰上孵育 2 h，離心半徑15 cm，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，加補體（按照 1∶3 比例稀釋于 DMEM 培養基）重懸，37℃ 孵育 1 h；DMEM 培養基清洗 2 次，接種于多聚賴氨酸包被的培養皿中。將純化后的雪旺細胞培養 1～2 d，0.125% 胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液后計數，備用。
1.5.2 甲苯胺藍染色觀察 取各組 Gr-SF 納米膜用 75% 乙醇處理 30 min，PBS 洗滌 2 次，轉移至 24 孔板中；每孔按 5×104 個/mL 密度接種 1 mL 雪旺細胞懸液。培養 3 d，PBS 洗滌細胞 2 次，4% 多聚甲醛固定，甲苯胺藍染色觀察雪旺細胞形態及分布。
1.5.3 CCK-8 法檢測細胞活力 取各組 Gr-SF 納米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×104個/mL 密度接種 1 mL 雪旺細胞懸液。培養 3 d 后棄培養基，PBS 洗滌 1 次，加入 500 μL CCK-8 試劑（按 1∶10 比例與 PBS 配置），37℃ 孵育 4 h，取 150 μL 上清加入 96 孔板中，用酶標儀在 450 nm 處測定各孔 A 值，設無細胞孔為調零孔。以各孔與調零孔 A 值差值作為最終 A 值，取均值。
1.5.4 EdU/Hoechst33342 染色觀測細胞增殖情況 取各組 Gr-SF 納米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×104 個/mL 密度接種 1 mL 雪旺細胞懸液。培養 3 d 后棄去培養基，50 mmol/L EdU 標記試劑（按 1∶1 000 比例與培養基配置）孵育 12 h。之后細胞用 4% 多聚甲醛處理 30 min，甘氨酸孵育 5 min，PBS 洗滌，抗-EdU 工作液室溫處理 30 min，含 0.5%Triton X-100 的 PBS 溶液洗滌，5 mg/mL Hoechst33342 染液室溫孵育 30 min。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，各組取 3 孔，隨機取 10 個區域計算 EdU 陽性細胞染色百分比。
1.6 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Gr-SF 靜電紡絲溶液靜態接觸角測定
0、5%、10%、15%、20% Gr-SF 靜電紡絲溶液的靜態接觸角分別為（64.78±4.06）、（78.84±2.70）、（82.90±0.57）、（98.7±1.41）、（117.51±7.49）°，其中 15%、20%Gr-SF 靜電紡絲溶液的靜態接觸角顯著大于純 SF（0）靜電紡絲溶液，差異有統計學意義（P<0.05）。其余 Gr-SF 靜電紡絲溶液間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2 Gr-SF 納米膜相關檢測
2.2.1 表面性狀觀察 光鏡觀察示：A 組纖維具有圓形橫截面和光滑表面，由大量隨機取向的纖維組成；B 組可見納米膜顏色加深，纖維結構中均勻分布少量 Gr 顆粒；C 組納米膜顏色進一步加深，纖維中鑲嵌大量 Gr 顆粒；D 組 Gr 顆粒呈小團塊狀聚集；E 組團塊狀聚集更明顯。見圖 1。
圖1
Gr-SF 納米膜光鏡觀察（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure1. Light microscope observation of Gr-SF nanofilms (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
掃描電鏡觀察示：A 組納米膜表面呈納米纖維結構，纖維連續、均一；B 組纖維連續，表面規則，并可見少量 Gr 顆粒均勻鑲嵌其中；C 組纖維交錯規則，Gr 顆粒鑲嵌其中；D 組納米膜中可見大量 Gr 顆粒鑲嵌其中，部分 Gr 顆粒成簇分布；E 組納米膜中大量 Gr 顆粒聚集成簇。見圖 2。
圖2
Gr-SF 納米膜掃描電鏡觀察
a. A 組（×5 000）；b. B 組（×2 000）；c. C 組（×500）；d. D 組（×2 000）；e. E 組（×5 000）
Figure2. Scanning electron microscope observation of Gr-SF nanofilmsa. Group A（×5 000）; b. Group B（×2 000）; c. Group C（×500）; d. Group D（×2 000）; e. Group E（×5 000）
2.2.2 電導率檢測 A、B、C、D、E 組 Gr-SF 納米膜的電導率分別為（1.02±0.14）、（2.25±0.09）、（2.82±0.35）、（3.23±0.19）、（3.65±0.12）×10–4/Ω，B、C、D、E 組電導率顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C、D、E 組電導率逐漸上升，但差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2.3 孔隙率檢測 A、B、C、D、E 組 Gr-SF 納米膜的孔隙率分別為 70.24%±2.17%、72.46%±1.39%、75.89%±1.44%、82.33%±2.06、85.76%±1.92%，各納米膜孔隙率均>65%。B、C、D、E 組孔隙率顯著高于 A 組，除 B 組外，其余各組與 A 組比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、D、E 組間比較差異無統計學差異（P>0.05）。
2.2.4 體外細胞毒性檢測 培養 1、4、7 d，各組 A 值均呈逐漸增加趨勢。1、4 d 時各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；7 d 時 D、E 組 A 值低于其余各組，但各組間 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
MTT法檢測各組細胞生長曲線
Figure3.
Cell growth curve of different groups by MTT assay
2.3 Gr-SF 納米膜對雪旺細胞形態及增殖的影響
2.3.1 甲苯胺藍染色觀察 培養 3 d，A、B、C 組雪旺細胞呈長梭形，胞體形狀正常、表面透亮光潔，貼附于納米纖維生長態勢良好，且能穿過纖維之間的孔隙增殖生長；D、E 組細胞成團生長，細胞胞體逐漸減小，折光性降低，細胞數量少于 A、B、C 組。見圖 4。
圖4
培養 3 d 各組甲苯胺藍染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure4. Toluidine blue staining observation of each group at 3 days after culture (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3.2 CCK-8 法檢測細胞活力 培養 3 d，A、B、C、D、E 組 A 值分別為 1.12±0.17、1.24±0.39、1.33±0.15、1.09±0.06、0.86±0.12，E 組與 A、B、C 組比較差異有統計學意義（P<0.05）。其余各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3.3 EdU/Hoechst33342 染色檢測細胞增殖 培養 3 d，EdU/Hoechst33342 染色示，A、B、C 組細胞致密且 EdU 陽性細胞逐漸增多；D、E 組細胞減少，且 EdU 陽性細胞亦減少。見圖 5。定量檢測示，A、B、C、D、E 組 EdU 陽性細胞染色百分比分別為 25.52%±1.23%、25.38%±1.81%、29.50%±1.87%、17.65%±2.35%、14.28%±1.09%。A、B、C 組 EdU 陽性細胞染色百分比逐漸增大，D、E 組低于其余各組，其中 E 組與 A、B、C 組比較，D 組與 C 組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。其余組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
圖5
培養 3 d 各組 EdU/Hoechst33342 染色觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure5. EdU/Hoechst33342 staining observation of each group at 3 days after culture (Confocal laser scanning microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
3 討論
神經再生研究的關鍵是尋找理想的組織工程神經支架材料，伴隨著生物材料研究的快速發展，新型導電材料已逐漸應用到組織工程研究領域。Gr 具有優異的電化學性能、力學性能，但存在生物相容性差、不可降解、缺少活性基團等缺點[24-25]。通過引入生物相容性優良及降解可控的分子等方式對 Gr 進行修飾可以彌補上述不足。SF 是一種源于蠶絲的天然高分子纖維蛋白質，有良好的生物相容性和力學性能，已被廣泛應用于生物醫學領域[26]。理想的組織工程支架材料需兼顧材料與結構兩方面[27]。Gr-SF 納米膜能否作為周圍神經再生支架材料，促進神經再生，需要進一步研究其對周圍神經細胞相容性的影響。
材料表面親疏水性可通過接觸角進行評價。一般情況下，親水性表面更利于細胞黏附，親水性越強、接觸角越小，反之接觸角越大。本實驗通過靜電紡絲技術制備 Gr-SF 納米膜，由于 Gr 的疏水性[28]，其加入后會降低 Gr-SF 納米膜表面的親水性。當 Gr 質量分數達 15%、20% 時其靜態接觸角>90°，親水性下降。因此，為了保證 Gr-SF 納米膜的細胞親和性，建議 Gr 質量分數不超過 10%。
對于神經組織再生，高密度細胞接種需要高孔隙度基質，也需要足夠的氧氣和營養供給細胞[29]。相比低孔隙率支架材料，高孔隙率支架材料可為細胞和組織提供更多的空間和營養。我們采用靜電紡絲技術構建的 Gr-SF 納米膜具有大量無規則縱橫纖維，類似細胞外基質中的大分子膠原纖維和彈性蛋白，有良好貫通的孔隙，具有較高的孔隙率（均達 65% 以上），使該支架比表面積高，符合組織工程支架對高孔隙率的要求。但是支架孔隙率過高也會削弱機械強度[30]，因此構建支架時也需要權衡孔隙率和機械強度。
根據 ISO-10993 標準，小鼠成纖維細胞 L929 細胞是一種常用的細胞毒性評價細胞系。本研究也采用 L929 細胞評價 Gr-SF 納米膜細胞毒性。體外培養 1、4、7 d 結果顯示，各時間點各納米膜組和對照組間差異無統計學意義，但培養 7 d 時，D、E 組 A 值較其他組有所下降，說明其細胞毒性有所增加。研究表明 Gr 的濃度和分散效果差異對細胞活性有影響[31]，團聚的 Gr 可能使細胞不能進行代謝活動，進而導致其活性受損，而分散較好的 Gr 則對細胞活性無影響。因此，為了保證細胞活性，Gr 質量分數不宜超過 10%。
神經損傷發生時，雪旺細胞發生一系列形態及行為改變，同時發生增殖和表型變化，為軸突再生提供了理想的微環境。因而 Gr-SF 納米膜能否作為支架材料運用到外周神經修復的實驗中，需觀察其對雪旺細胞生長、增殖的影響。本研究發現共培養后，0、5%、10%Gr-SF 納米膜中的雪旺細胞不僅形態未發生改變，細胞生長活力和增殖能力也未受影響。
綜上述，Gr 質量分數為 10% 的 Gr-SF 納米膜具有較好的親水性，有較高的孔隙率和電活性，Gr 顆粒可均勻分散在納米膜中；同時也具有良好生物相容性，可促進雪旺細胞存活和增殖。下一步我們將優化 Gr-SF 納米膜的設計并應用于周圍神經再生研究。
周圍神經損傷是臨床常見問題，在創傷患者中發病率約 2.8%[1-2]。周圍神經一定程度上能夠再生[3]，但較長周圍神經缺損的修復仍存在許多障礙[4-5]。組織工程神經有望解決這一難題，目前已進行了大量研究[6-7]。但組織工程神經通常不具備活性，修復較長神經缺損的效果仍遠不及自體神經。因此，制備理想的支架材料是一個具有挑戰性的任務。考慮到神經組織本身的結構和電生理特性，合適的支架材料不僅需具有獨特表面形貌，以改善神經細胞和支架之間的相互作用、調控細胞生長，同時也需要與在體神經形成良好的電生理整合[8-9]。
伴隨著生物材料研究的快速發展，新型導電納米材料已應用于組織工程神經研究領域，其中碳基材料，如石墨、富勒烯、納米管和納米帶等，因具有良好的機械性能和導電性，受到了研究人員的關注[10]。石墨烯（graphene，Gr）是碳基材料的重要成員，是具有蜂窩晶格結構的 sp2雜化碳原子的二維單層片材，其特殊的分子構型使其具有優越的物化性質，如高電導率和熱導率、高機械強度以及強光電性[11-12]；但因存在高疏水性、難以均勻分散、化學穩定難以與化學試劑反應以及缺乏生物相容性等缺點，應用大大受限[13]。為克服這些缺點，有研究將天然生物大分子結合至 Gr 表面[14]。絲素蛋白（silk fibroin，SF）具有優越的理化性能，越來越多應用于組織工程支架的制備[15-16]。靜電紡絲技術環節少、設備簡單、操作方便，是制備納米/微米纖維膜的簡便方法，采用靜電紡絲制備的納米纖維支架材料已廣泛應用于骨、血管、神經、軟骨、皮膚等組織工程研究領域[17-19]。
本研究利用靜電紡絲技術制備 Gr-SF 納米膜并檢測其理化性能，探討不同濃度 Gr 對 Gr-SF 納米膜理化性能的影響；同時通過 L929 細胞毒性和雪旺細胞共培養實驗，探討細胞相容性好、促進神經細胞生長的 Gr 最佳濃度，為神經組織工程研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM 培養基、FBS、青鏈霉素、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；多聚賴氨酸（Sigma 公司，美國）；天然蠶絲（南通海安鑫緣蠶絲有限公司）；Gr 納米片層粉末[型號 G0441；梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]；EdU 劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）。DSA20 測角器（Gmbh Hambur 公司，德國）；激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國）；酶標儀（Bio-Tek 公司，美國）。
1.2 Gr-SF 靜電紡絲溶液的配制及檢測
1.2.1 不同質量分數Gr-SF靜電紡絲溶液的配制 取天然蠶絲，經 0.5% Na2CO3 水溶液 100℃ 煮沸 30 min，重復 3 次，獲得 SF 纖維。根據 Yang 等[20]方法制備 SF 溶液：將 SF 纖維溶于 CaCl2/H2O/EtOH（1∶8∶2）三元體系中，80℃、1 h；隨后于透析袋（截留分子量 12 000～14 000）中室溫透析 3 d。然后將 SF 溶液置于不銹鋼皿中風干成膜，再溶解至 98% 甲酸中獲得 SF 質量分數為 13% 的靜電紡絲溶液。將 Gr 納米片層粉末溶于 13% 靜電紡絲溶液中，分別制備 Gr 質量分數為 0、5%、10%、15%、20% 的 Gr-SF 靜電紡絲溶液，磁力攪拌器室溫攪拌，然后用超聲波發生器進行超聲處理 60 min，720 W 進行聲波降解，頻率 20 kHz。
1.2.2 靜態接觸角測定 用 DSA20 測角器，采用滴液法[21]測量不同質量分數（0、5%、10%、15%、20%）Gr-SF 靜電紡絲溶液的靜態接觸角，測量前 1 h 制備溶液。各 Gr-SF 靜電紡絲溶液設 3 個平行樣，每個樣品測量 3 次，取均值。
1.3 Gr-SF 納米膜制備及化學處理
自制靜電紡絲接收裝置，由一高電壓供應裝置組成，包括用 1 個毛細管針（內徑 0.9 mm，針尖內裝有靜電紡絲溶液的液滴）制成的陽極發生器和 1 個絕緣收集板制成的陰極收集器；發生器針尖和收集器間距離為 7～13 cm，通過注射泵維持恒定體積流速為 0.3 mL/h，使靜電紡絲溶液維持于針管內。使用針尖對陽極發生器施加 20 kV 高壓，最終在絕緣不銹鋼負載的載玻片上形成靜電紡絲膜。取靜電紡絲膜置于無水乙醇中 10 min 以誘導構象轉變，隨后用蒸餾水 37℃ 洗滌 72 h，去除殘余甲酸。采用上述方法制備 0、5%、10%、15%、20%Gr-SF 納米膜（分別設為 A、B、C、D、E 組）。
1.4 Gr-SF 納米膜觀測指標
1.4.1 Gr-SF納米膜表面性狀觀察 大體觀察各組 Gr-SF 納米膜顏色，光鏡及掃描電鏡下觀察 Gr-SF 納米膜表面、纖維排列以及 Gr 顆粒分散情況。
1.4.2 電導率檢測 采用電化學工作站循環伏安法，于室溫下檢測各組 Gr-SF 納米膜電導率。實驗采用典型的三電極系統[包括鉑網電極、Ag/AgCl 電極（飽和 KCl）參考電極和玻碳工作電極]，在含 5.0 mmol/L Fe（CN）64–/3–的 0.1 mol/L KCl 中測量膜表面電化學性能（100～600 mV），掃描速率 100 mV/s，探針間距 10 mm。各組取 3 個樣品，每個樣品測 3 次，取均值。
1.4.3 孔隙率檢測 采用溶液置換法[22]檢測各組 Gr-SF 納米膜孔隙率。以正己烷溶液作為置換液，將 Gr-SF 納米膜浸于已知體積（V1）的正己烷溶液中 5 min，記錄總體積（V2）；將膜取出，記錄剩余體積（V3）。按以下公式計算 Gr-SF 納米膜孔隙率：（V1–V3）/（V2–V3）×100%。
1.4.4 體外細胞毒性檢測 ① Gr-SF 納米膜浸提液的制備：將滅菌后的各組 Gr-SF 納米膜分別置于離心管中，按 GB/T16886-ISO10993 標準以表面積 6 cm2Gr-SF 納米膜加 1 mL 培養基的比例加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，（37.0±0.5）℃ 浸泡（72.0±0.5）h，制備的浸提液必須在 12 h 內使用。② 體外細胞毒性檢測：根據 ISO-10993 標準采用 MTT 法檢測 Gr-SF 納米膜體外細胞毒性。取 L929 細胞（中國科學院上海生命科學研究院），然后按照 5 000 個/孔密度接種于 96 孔板中，分別與 100 μL 各組 Gr-SF 納米膜浸提液于 37℃ 下孵育 1、4、7 d，每組設 6 個復孔，完全培養基為對照組，無細胞孔為調零孔，實驗重復 3 次。孵育后各時間點去除培養基，PBS 洗滌細胞 3 次；每孔加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，繼續培養 4 h；棄上清液，每孔加入 100 μL DMSO；用 EIX-800 Microelisa 讀數器，在 570 nm 波長下測量吸光度（A）值，以每孔與調零孔 A 值的差值作為最終 A 值，取均值。
1.5 Gr-SF 納米膜對雪旺細胞形態及增殖的影響
1.5.1 雪旺細胞分離培養 參照文獻[23]方法分離培養雪旺細胞：新生 1～3 d SD 大鼠 6 只，雌雄不限，由南通大學實驗動物中心提供。無菌條件下取出大鼠兩側坐骨神經，剝膜后置于 1 mg/mL 膠原酶和 0.125% 胰蛋白酶消化 30 min，以 1×106個/mL 密度接種于多聚賴氨酸包被的培養皿中；置于 37℃、5%CO2 培養箱中，24 h 后更換為含 10 μmol/L β-阿糖胞苷的 DMEM 培養基，培養 24 h 后更換為含 2 mmol/L Forskolin、10 ng/mL Heregulin 及 10%FBS 的 DMEM 培養基，每 3 天換液 1 次；3～5 d 待細胞生長至融合后，消化收集細胞懸液，加成纖維細胞特異性抗體 Thy 1.1（按照 1∶1 000 比例稀釋于含 10%FBS 的 DMEM 培養基）；冰上孵育 2 h，離心半徑15 cm，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，加補體（按照 1∶3 比例稀釋于 DMEM 培養基）重懸，37℃ 孵育 1 h；DMEM 培養基清洗 2 次，接種于多聚賴氨酸包被的培養皿中。將純化后的雪旺細胞培養 1～2 d，0.125% 胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液后計數，備用。
1.5.2 甲苯胺藍染色觀察 取各組 Gr-SF 納米膜用 75% 乙醇處理 30 min，PBS 洗滌 2 次，轉移至 24 孔板中；每孔按 5×104 個/mL 密度接種 1 mL 雪旺細胞懸液。培養 3 d，PBS 洗滌細胞 2 次，4% 多聚甲醛固定，甲苯胺藍染色觀察雪旺細胞形態及分布。
1.5.3 CCK-8 法檢測細胞活力 取各組 Gr-SF 納米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×104個/mL 密度接種 1 mL 雪旺細胞懸液。培養 3 d 后棄培養基，PBS 洗滌 1 次，加入 500 μL CCK-8 試劑（按 1∶10 比例與 PBS 配置），37℃ 孵育 4 h，取 150 μL 上清加入 96 孔板中，用酶標儀在 450 nm 處測定各孔 A 值，設無細胞孔為調零孔。以各孔與調零孔 A 值差值作為最終 A 值，取均值。
1.5.4 EdU/Hoechst33342 染色觀測細胞增殖情況 取各組 Gr-SF 納米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×104 個/mL 密度接種 1 mL 雪旺細胞懸液。培養 3 d 后棄去培養基，50 mmol/L EdU 標記試劑（按 1∶1 000 比例與培養基配置）孵育 12 h。之后細胞用 4% 多聚甲醛處理 30 min，甘氨酸孵育 5 min，PBS 洗滌，抗-EdU 工作液室溫處理 30 min，含 0.5%Triton X-100 的 PBS 溶液洗滌，5 mg/mL Hoechst33342 染液室溫孵育 30 min。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，各組取 3 孔，隨機取 10 個區域計算 EdU 陽性細胞染色百分比。
1.6 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Gr-SF 靜電紡絲溶液靜態接觸角測定
0、5%、10%、15%、20% Gr-SF 靜電紡絲溶液的靜態接觸角分別為（64.78±4.06）、（78.84±2.70）、（82.90±0.57）、（98.7±1.41）、（117.51±7.49）°，其中 15%、20%Gr-SF 靜電紡絲溶液的靜態接觸角顯著大于純 SF（0）靜電紡絲溶液，差異有統計學意義（P<0.05）。其余 Gr-SF 靜電紡絲溶液間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2 Gr-SF 納米膜相關檢測
2.2.1 表面性狀觀察 光鏡觀察示：A 組纖維具有圓形橫截面和光滑表面，由大量隨機取向的纖維組成；B 組可見納米膜顏色加深，纖維結構中均勻分布少量 Gr 顆粒；C 組納米膜顏色進一步加深，纖維中鑲嵌大量 Gr 顆粒；D 組 Gr 顆粒呈小團塊狀聚集；E 組團塊狀聚集更明顯。見圖 1。
圖1
Gr-SF 納米膜光鏡觀察（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure1. Light microscope observation of Gr-SF nanofilms (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
掃描電鏡觀察示：A 組納米膜表面呈納米纖維結構，纖維連續、均一；B 組纖維連續，表面規則，并可見少量 Gr 顆粒均勻鑲嵌其中；C 組纖維交錯規則，Gr 顆粒鑲嵌其中；D 組納米膜中可見大量 Gr 顆粒鑲嵌其中，部分 Gr 顆粒成簇分布；E 組納米膜中大量 Gr 顆粒聚集成簇。見圖 2。
圖2
Gr-SF 納米膜掃描電鏡觀察
a. A 組（×5 000）；b. B 組（×2 000）；c. C 組（×500）；d. D 組（×2 000）；e. E 組（×5 000）
Figure2. Scanning electron microscope observation of Gr-SF nanofilmsa. Group A（×5 000）; b. Group B（×2 000）; c. Group C（×500）; d. Group D（×2 000）; e. Group E（×5 000）
2.2.2 電導率檢測 A、B、C、D、E 組 Gr-SF 納米膜的電導率分別為（1.02±0.14）、（2.25±0.09）、（2.82±0.35）、（3.23±0.19）、（3.65±0.12）×10–4/Ω，B、C、D、E 組電導率顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C、D、E 組電導率逐漸上升，但差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.2.3 孔隙率檢測 A、B、C、D、E 組 Gr-SF 納米膜的孔隙率分別為 70.24%±2.17%、72.46%±1.39%、75.89%±1.44%、82.33%±2.06、85.76%±1.92%，各納米膜孔隙率均>65%。B、C、D、E 組孔隙率顯著高于 A 組，除 B 組外，其余各組與 A 組比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、D、E 組間比較差異無統計學差異（P>0.05）。
2.2.4 體外細胞毒性檢測 培養 1、4、7 d，各組 A 值均呈逐漸增加趨勢。1、4 d 時各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；7 d 時 D、E 組 A 值低于其余各組，但各組間 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
MTT法檢測各組細胞生長曲線
Figure3.
Cell growth curve of different groups by MTT assay
2.3 Gr-SF 納米膜對雪旺細胞形態及增殖的影響
2.3.1 甲苯胺藍染色觀察 培養 3 d，A、B、C 組雪旺細胞呈長梭形，胞體形狀正常、表面透亮光潔，貼附于納米纖維生長態勢良好，且能穿過纖維之間的孔隙增殖生長；D、E 組細胞成團生長，細胞胞體逐漸減小，折光性降低，細胞數量少于 A、B、C 組。見圖 4。
圖4
培養 3 d 各組甲苯胺藍染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure4. Toluidine blue staining observation of each group at 3 days after culture (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3.2 CCK-8 法檢測細胞活力 培養 3 d，A、B、C、D、E 組 A 值分別為 1.12±0.17、1.24±0.39、1.33±0.15、1.09±0.06、0.86±0.12，E 組與 A、B、C 組比較差異有統計學意義（P<0.05）。其余各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3.3 EdU/Hoechst33342 染色檢測細胞增殖 培養 3 d，EdU/Hoechst33342 染色示，A、B、C 組細胞致密且 EdU 陽性細胞逐漸增多；D、E 組細胞減少，且 EdU 陽性細胞亦減少。見圖 5。定量檢測示，A、B、C、D、E 組 EdU 陽性細胞染色百分比分別為 25.52%±1.23%、25.38%±1.81%、29.50%±1.87%、17.65%±2.35%、14.28%±1.09%。A、B、C 組 EdU 陽性細胞染色百分比逐漸增大，D、E 組低于其余各組，其中 E 組與 A、B、C 組比較，D 組與 C 組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。其余組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
圖5
培養 3 d 各組 EdU/Hoechst33342 染色觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure5. EdU/Hoechst33342 staining observation of each group at 3 days after culture (Confocal laser scanning microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
3 討論
神經再生研究的關鍵是尋找理想的組織工程神經支架材料，伴隨著生物材料研究的快速發展，新型導電材料已逐漸應用到組織工程研究領域。Gr 具有優異的電化學性能、力學性能，但存在生物相容性差、不可降解、缺少活性基團等缺點[24-25]。通過引入生物相容性優良及降解可控的分子等方式對 Gr 進行修飾可以彌補上述不足。SF 是一種源于蠶絲的天然高分子纖維蛋白質，有良好的生物相容性和力學性能，已被廣泛應用于生物醫學領域[26]。理想的組織工程支架材料需兼顧材料與結構兩方面[27]。Gr-SF 納米膜能否作為周圍神經再生支架材料，促進神經再生，需要進一步研究其對周圍神經細胞相容性的影響。
材料表面親疏水性可通過接觸角進行評價。一般情況下，親水性表面更利于細胞黏附，親水性越強、接觸角越小，反之接觸角越大。本實驗通過靜電紡絲技術制備 Gr-SF 納米膜，由于 Gr 的疏水性[28]，其加入后會降低 Gr-SF 納米膜表面的親水性。當 Gr 質量分數達 15%、20% 時其靜態接觸角>90°，親水性下降。因此，為了保證 Gr-SF 納米膜的細胞親和性，建議 Gr 質量分數不超過 10%。
對于神經組織再生，高密度細胞接種需要高孔隙度基質，也需要足夠的氧氣和營養供給細胞[29]。相比低孔隙率支架材料，高孔隙率支架材料可為細胞和組織提供更多的空間和營養。我們采用靜電紡絲技術構建的 Gr-SF 納米膜具有大量無規則縱橫纖維，類似細胞外基質中的大分子膠原纖維和彈性蛋白，有良好貫通的孔隙，具有較高的孔隙率（均達 65% 以上），使該支架比表面積高，符合組織工程支架對高孔隙率的要求。但是支架孔隙率過高也會削弱機械強度[30]，因此構建支架時也需要權衡孔隙率和機械強度。
根據 ISO-10993 標準，小鼠成纖維細胞 L929 細胞是一種常用的細胞毒性評價細胞系。本研究也采用 L929 細胞評價 Gr-SF 納米膜細胞毒性。體外培養 1、4、7 d 結果顯示，各時間點各納米膜組和對照組間差異無統計學意義，但培養 7 d 時，D、E 組 A 值較其他組有所下降，說明其細胞毒性有所增加。研究表明 Gr 的濃度和分散效果差異對細胞活性有影響[31]，團聚的 Gr 可能使細胞不能進行代謝活動，進而導致其活性受損，而分散較好的 Gr 則對細胞活性無影響。因此，為了保證細胞活性，Gr 質量分數不宜超過 10%。
神經損傷發生時，雪旺細胞發生一系列形態及行為改變，同時發生增殖和表型變化，為軸突再生提供了理想的微環境。因而 Gr-SF 納米膜能否作為支架材料運用到外周神經修復的實驗中，需觀察其對雪旺細胞生長、增殖的影響。本研究發現共培養后，0、5%、10%Gr-SF 納米膜中的雪旺細胞不僅形態未發生改變，細胞生長活力和增殖能力也未受影響。
綜上述，Gr 質量分數為 10% 的 Gr-SF 納米膜具有較好的親水性，有較高的孔隙率和電活性，Gr 顆粒可均勻分散在納米膜中；同時也具有良好生物相容性，可促進雪旺細胞存活和增殖。下一步我們將優化 Gr-SF 納米膜的設計并應用于周圍神經再生研究。
