引用本文： 王江文, 易陽艷, 朱元正. MSCs來源外泌體在創面修復中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(5): 634-639. doi: 10.7507/1002-1892.201901051 復制
皮膚是保護機體免受外界環境侵襲和病原體入侵的屏障。然而，皮膚經常因創傷或各種疾病而受損，比如在患有糖尿病的情況下，創面愈合非常困難[1]。如何快速有效地加速創面愈合，對于機體健康是至關重要的。干細胞療法曾一度成為促進和改善創面愈合的熱門研究領域之一，但有文獻報道干細胞修復創面時可能發生急性心肌梗死、急性腎損傷、嚴重肢體缺血、中風和腫瘤等一系列并發癥[2-4]。所以，干細胞治療創面的療效一直備受爭議。細胞因子療法也一度成為促進創面愈合的熱門研究領域，但由于細胞因子半衰期短、不穩定、靶細胞的吸收率低等一系列因素，使得細胞因子修復創面愈合的療效一直不樂觀[5]。近期研究發現，MSCs 的療效主要來自于其旁分泌方式分泌的產物——外泌體（exosomes，EXOs）[6]。MSCs-EXOs 治療創面由于避免了干細胞治療的免疫排斥、致瘤、栓塞等缺點，且具有高穩定性、易于儲存、無需增殖、便于定量使用等優勢，與單一細胞因子治療比較，具有較高的安全性和更大的組織再生潛能，從而成為近年研究的熱點領域[6]。本文就 MSCs-EXOs 的生物學特性以及促進創面愈合的研究進展綜述如下。
1 EXOs的生物學特性
EXOs 是一種由細胞經過“內吞-融合-外排”等一系列調控過程形成的直徑 40～100 nm 的膜性脂質小囊泡[7]。EXOs 首先由 Harding 等[8]于 1983 年在大鼠的網織紅細胞中發現。1985 年，Pan 等[9]用電鏡同樣發現了這種由細胞分泌的小囊泡。1987 年，Johnstone 等[10]將這種小囊泡正式定義為“exosomes”。而 EXOs 是細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的一種亞型。EVs 是脂質雙層膜封閉的亞細胞結構，通常為球形，尺寸范圍為幾納米至幾微米。它們幾乎是由體內的每種細胞類型產生的，并且已從大多數體液（從母乳到尿液樣品）及分離的組織和細胞培養上清液中分離出來[7, 11]。EVs 根據其生物合成模式被分為 3 個主要亞型——EXOs、微泡和凋亡小體[7]。
EXOs 的合成始于細胞膜的內向出芽和初級核內體的產生，這些初級核內體進一步內向出芽形成次級核內體，次級核內體繼續向內逆向出芽，形成含有多囊泡的次級核內體，稱為多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）。MVBs 部分進入溶酶體被降解；剩余部分與質膜融合，再次向內凹陷出芽為顆粒狀小囊泡，并釋放到細胞外，這種囊泡結構就稱為 EXOs[12]。微泡起源于質膜的小突起向外出芽和酶促裂變，其生成需要通過調節肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，而使細胞骨架蛋白收縮[13]。當細胞進行程序性死亡時，凋亡細胞經核碎裂形成核碎片，然后整個細胞通過發芽、起泡等方式形成一個球形的突起，并在其根部脫落形成一些大小不等，內含細胞質、細胞器及核碎片的小體稱為凋亡小體，凋亡小體在細胞間通訊過程中也具有功能效應[14]。
EXOs 囊泡膜具有脂質雙分子層結構，其大小較均一，直徑為 40～100 nm，膜表面標記物主要有 CD9、CD63、CD81、CD82、HSP70 等。囊泡內富含多種蛋白質和核酸如 mRNA、微小 RNA（micro RNA，miRNA） 等，其中 Alix 蛋白和 TSG101 蛋白為其囊內標記物[15]。微泡直徑較 EXOs 大，為 100～1 000 nm。微泡內除了富含蛋白質、mRNA 及 miRNA 外，還有大量細胞因子、趨化因子、金屬蛋白酶和磷脂酰絲氨酸等，其標記物主要有整合素、基質金屬蛋白酶和組織因子等[16]。凋亡小體大小為 50～5 000 nm，內含組蛋白質、RNA、DNA 等，其磷脂酰絲氨酸含量也很高[14]。
2 創面愈合的生理過程
創面愈合是一個動態又復雜的生理過程，已被細分為 4 個階段：止血期、炎癥期、增殖期和重塑期[17]。
在止血期，創面形成的血凝塊保護傷口部位免受環境污染，并提供基質和可溶性因子如 TGF-β、PDGF、FGF 和 EGF 促進黏附，并成為創面愈合過程中各種細胞譜系分化的誘導劑[18-20]。
隨后的炎癥期以骨髓來源免疫細胞浸潤為特征，通過清除創面部位的病原體、凋亡細胞、細胞碎片和受損基質，為愈合做準備[17]。微生物病原體被中性粒細胞除去，巨噬細胞接下來就開始吞噬凋亡的細胞和細胞碎片[21]。當然，淋巴細胞也參與傷口愈合，文獻表明 CD4+ T 細胞與促愈合作用有關，而 CD8+ T 細胞則對創面修復有負面影響[22]。其中更發現一種在皮膚駐留的 γ-δT 細胞亞群，其可通過調節組織結構和炎癥以及防止感染，從而在創面愈合中發揮重要作用。這些炎癥變化最終促進 M1 型巨噬細胞向 M2 型巨噬細胞轉變[23]。
當到達增殖期時，M2 型巨噬細胞通過調節角質形成細胞、成纖維細胞和內皮細胞的增殖和遷移，來促進組織再生以及大量細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的產生[18]。
到最后的重塑期，新生 ECM 的膠原蛋白分解和結構調整導致傷口厚度減小，大部分新生成的毛細血管退化，使組織的血管正常化，并通過下面結締組織的收縮將創面的邊緣拉到一起，最后創面得以愈合[17, 20, 24]。
3 MSCs-EXOs調節創面愈合
3.1 調控創面的炎性反應
炎癥是機體響應有害刺激的一種自衛機制，當機體遭受損害或病原體侵入后，良好調節的炎性反應是創面愈合的基本保障[25]。
在皮膚損傷后 24～36 h，嗜中性粒細胞作為主要細胞類型最初招募到損傷部位，吞噬外來顆粒、病原體、受損組織和細胞[18]。皮膚損傷后 48～72 h 內，巨噬細胞被募集到傷口部位，并繼續吞噬過程[26]。巨噬細胞呈現促炎 M1 表型和抗炎 M2 表型，M2 型巨噬細胞在組織重塑和血管生成等方面起著核心作用，而 M1 型巨噬細胞則產生促炎細胞因子，吞噬病原體和受損細胞[27]。近年研究表明，EXOs 可通過骨髓來源的巨噬細胞被有效攝取，導致它們從 M1 表型向 M2 表型轉變[28]。另一項研究顯示，脂多糖預處理的 MSCs-EXOs 攜帶的 miRNA-let-7b，可通過抑制 TLR4/NF-κB 通路和激活 STAT3/AKT 信號傳導通路來調節巨噬細胞極化，從而促進創面愈合[29]。
此外，有研究表明，活化的 T 調節性細胞可以通過減少 IFN-γ 產生和 M1 型巨噬細胞聚集促進創面愈合[30]。并且，MSCs-EXOs 不僅可調節 B 淋巴細胞的活化、分化和增殖，還可抑制 T 淋巴細胞的增殖，MSCs-EXOs 可以轉換活化的 T 淋巴細胞到 T 調節性細胞的表型，從而發揮免疫抑制作用[31-32]。
在炎性因子的調控上，MSCs-EXOs 也發揮著重要作用。多種 MSCs-EXOs 可以抑制多種促炎因子的分泌，包括 TNF-α、誘導型一氧化氮合酶、環加氧酶、IL-1 和單核細胞趨化蛋白等，并促進抗炎因子如 IL-10 的分泌[33-35]。有研究表明，MSCs-EXOs 能激活有絲分裂原活化蛋白激酶信號傳導通路，從而抑制促炎因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的分泌[36-38]。另外，Eirin 等[39]在代謝綜合征和腎動脈狹窄的豬模型中，發現 MSCs-EXOs 通過促進抗炎細胞因子 IL-10 的分泌來減輕炎癥。
通過分析 miRNA 表達譜，Ti 等[40]證實 MSCs-EXOs 攜帶的 3 個具有調控有關免疫應答和炎癥功能的特定 miRNAs（miRNA-21、miRNA-146a 和 miRNA-181C），在靶細胞中具有最高表達。此外，研究表明，MSCs-EXOs 攜帶的 miRNA-181C 可通過下調 TLR4 信號傳導通路，從而降低過度的炎性反應[34]。
3.2 促進創面的血管生成
新血管的形成是在多種生理和病理過程，包括創面愈合和組織修復的關鍵步驟[41]。Zhang 等[42]發現，人臍帶MSCs（human umbilical cord MSCs，hucMSCs-EXOs）介導 Wnt4/β 連環蛋白激活，促進內皮細胞增殖和遷移，從而促進血管生成，這可能是一個重要的皮膚傷口愈合機制。Sahoo 等[43]發現人 CD34+ 干細胞衍生的 EXOs 與促進血管生成的 miRNAs（miRNA-126 和 miRNA130A），兩者均可顯著誘導血管在局部缺血的組織中富集。
此外，人脂肪來源干細胞（human adipose derived stem cells，hADSCs）來源的 EXOs 含有豐富的 miRNA-125A 和 miRNA-31，其可被轉移到血管內皮細胞，從而顯著促進血管生成。張靜等[44]研究已證明 hADSCs-EXOs 可促進血管內皮細胞的增殖、遷移，從而促進血管新生。既往研究證明 hADSCs-EXOs 可以通過抑制 DLL4 將 miR-125a 轉移到內皮細胞，從而促進血管生成[45]。Kang 等[46]還證實，hADSCs-EXOs 可以通過抑制 HIF1 將 miRNA-31 轉移到內皮細胞，促進血管生成。Shabbir 等[47]發現，MSCs-EXOs 激活了與傷口愈合相關聯的信號通路（AKT、ERK 和 STAT3）和誘導的許多生長因子（如肝細胞生長因子、IGF-1、NGF 和 stromal-表達衍生生長因子 1）來促進新生血管的形成。
3.3 促進皮膚細胞增殖和再上皮化
在增殖期，成纖維細胞增殖通常開始于皮膚損傷后第 3 天，此后成纖維細胞出現并開始增殖產生 ECM；此外，上皮細胞開始增殖并朝創面中心遷移，從而加速創面愈合。因此，細胞增殖和皮膚上皮再形成是皮膚再生的關鍵[41]。
有研究發現，在糖尿病大鼠模型中，富血小板血漿衍生的 EXOs 通過激活 YAP 蛋白，有效促進成纖維細胞的增殖和遷移，以及創面皮膚再上皮化[48]。尹剛等[49]也發現 ADSCs-EXOs 能夠促進周圍神經損傷后再生。另外，Geiger 等[50]發現，人成纖維細胞衍生的 EXOs 富含具有生物活性的熱休克蛋白-90α，以及具有促血管生成能力的 miR-126、miR-130a、miR-132，具有抗炎作用的miR-124a、miR-125b，以及具有調節膠原沉積的miR-21，從而表現出加速創面血管生成、加速創面成纖維細胞及上皮細胞的增殖和遷移，來促進創面愈合。Hu 等[51]發現，hADSCs-EXOs 可以通過促進成纖維細胞增殖和膠原蛋白合成，以及上調 N 鈣黏蛋白的基因表達，促進細胞周期蛋白 1、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Ⅰ型膠原和體外Ⅲ型膠原的合成，來促進創面愈合。體內實驗[46]也證明，hADSCs-EXOs 通過優化成纖維細胞特性，從而顯著促進皮膚傷口愈合。
此外，Zhang 等[52]發現，人誘導多能干細胞衍生的 MSCs-EXOs 通過促進人皮膚成纖維細胞增殖和遷移，以及通過增強膠原合成促進皮膚創面愈合。研究表明，在大鼠深二度燒傷損傷模型中，hucMSCs-EXOs 可抑制細胞凋亡，并激活 Wnt4/β-catenin 和 AKT 信號通路，以增加角蛋白 19、PCNA 和Ⅰ型膠原的表達，從而促進細胞增殖，加速再上皮化[53]。
3.4 促進膠原重塑從而減少瘢痕
嚴重創傷和大面積燒傷通常會導致瘢痕形成，這是肌成纖維細胞過度聚集和 ECM 沉積的結果。瘢痕的形成不僅影響美觀，而且也影響器官功能[41]。
Hu 等[51]報道，hADSCs-EXOs 可優化成纖維細胞的特性來促進創面愈合，他們發現在創面愈合早期階段，hADSCs-EXOs 通過促進成纖維細胞分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原，從而加速皮膚再生；然而在晚期階段，它們可以抑制膠原蛋白的表達，從而減少瘢痕形成。Fang 等[54]證明臍帶間充質干細胞來源 EXOs 內攜帶一些特異性 miRNAs（miRNA-21、miRNA-23A、miRNA-125B 和 miRNA-145），這些 miRNAs 通過抑制 TGF-β/SMAD2 通路，抑制肌成纖維細胞分化和過度纖維化，從而減少瘢痕形成。Zhao 等[55]報道表明，在大鼠創面模型中，高濃度的人羊膜上皮細胞來源 EXOs 通過刺激基質金屬蛋白酶 1 的表達來調控 ECM 沉積，從而促進創面愈合。
此外，近年研究表明，hucMSCs-EXOs 抑制皮膚瘢痕形成的新機制是，在皮膚再生的重塑階段，hucMSCs-EXOs 遞送 14-3-3ζ 蛋白，有效地調控 YAP 通路；在高細胞密度條件下，14-3-3ζ 蛋白募集 YAP 和 p-LATS 形成復合物，復合物誘導 YAP 磷酸化來抑制 Wnt/β-連環蛋白信號傳導，從而限制過度真皮成纖維細胞擴張和膠原沉積[56]。
4 EXOs的臨床應用前景
4.1 作為載體和聯合支架治療創面
在臨床上，基于 EXOs 的巨大作用潛力，利用其天然的生物相容性和細胞靶向定位性，很多科學家將注意力集中在將 EXOs 作為新藥的載體輸送系統上[6]。另外，為了穩定 EXOs 的局部作用濃度以保證其治療效果，EXOs 可混合水凝膠或涂層在纖維蛋白凝膠上，水凝膠或纖維蛋白凝膠作為支架起到緩釋作用，從而增強 EXOs 的創面愈合能力[6]。
4.2 可開發為免疫抑制劑
基于 EXOs 在免疫調節上的抑制作用，臨床上可將 EXOs 作為免疫抑制治療劑。但由于 EXOs 攜帶少量同種異體蛋白，可刺激自身免疫反應，所以其在免疫調節的應用上尚待考證[57]。最近研究表明，生產含有 EXOs 成分的人造脂質囊泡是一種可行辦法，以增加其穩定性和吸收性。人造 EXOs 磷脂酰絲氨酸的水平使其具有剛性的囊泡膜，可防止胞膜內容物的降解[58]。
4.3 提升EXOs的分離和鑒定技術
臨床上使用 EXOs 作為治療劑的另一個棘手問題是 EXOs 的分離技術。首先，目前 EVs 研究的最新技術尚缺乏廣泛適用的方法來分離和鑒別各個 EVs 亞型；其次，可用的技術導致分離物在不同程度上由多種 EVs 亞型組成，并且還可能含有非 EVs 成分，如脂蛋白、蛋白質和病毒，這取決于初始生物液的性質[59]。
4.4 提高EXOs的功效
盡管現在已證明了 MSCs-EXOs 在創面愈合中的積極作用，但需要進一步提高治療功效。如何提高 EXOs 功效已成為臨床中的熱門話題。目前，有 3 種方法已被用于進一步改善 EXOs 的功效：① 用治療藥物作用于 EXOs 供體細胞。用特定藥物預處理 EXOs 供體細胞有可能改變 EXOs 表達特征，從而調節其治療特性[60]。近年，Lu 等[61]報道用 TNF-α 預處理 ADSCs，從而增加 EXOs 中 Wnt3a 的釋放，促進成骨基因表達。② EXOs 供體細胞的基因工程。在 EXOs 分離之前對供體細胞進行基因工程技術，似乎也是一種非常有前景的策略。許多不同的技術可用于將遺傳物質引入靶細胞，包括重組病毒載體（慢病毒、腺病毒、腺相關病毒）或非病毒轉染技術[62]。可以應用特定 mRNA 或 miRNA 的過表達或沉默技術來改變 EXOs 的表達特性。研究表明，具有促血管新生作用的 miRNA-126 在人滑膜間充質干細胞中的過表達，導致其產生的 EXOs 具有促進人皮膚微血管內皮細胞增殖、遷移和管形成的能力，從而增強糖尿病患者的皮膚創面愈合[63]。③ EXOs 的直接操作，可選擇的方法包括用脂質體處理，與藥物或生物分子直接孵育等[64]。
5 小結與展望
上述研究證明 EXOs 可促進創面愈合，從細胞角度看，EXOs 通過增強上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞的增殖、遷移，以及調節血管新生、膠原合成和 ECM 重塑的能力，來達到創面更快愈合的目的；從分子角度看，EXOs 通過攜帶特定的 miRNA 或蛋白質，來調節靶細胞基因的表達和信號通路的激活。目前雖已證明 EXOs 治療創面從安全性和療效方面都有不錯的效果，但其安全性和療效仍不能完全保證。希望進一步了解 EXOs 促進創面愈合的機制，同時改進 EXOs 純化和鑒定的方法，最終能夠開發出針對急性和慢性創面的高效 EXOs 治療產品。
皮膚是保護機體免受外界環境侵襲和病原體入侵的屏障。然而，皮膚經常因創傷或各種疾病而受損，比如在患有糖尿病的情況下，創面愈合非常困難[1]。如何快速有效地加速創面愈合，對于機體健康是至關重要的。干細胞療法曾一度成為促進和改善創面愈合的熱門研究領域之一，但有文獻報道干細胞修復創面時可能發生急性心肌梗死、急性腎損傷、嚴重肢體缺血、中風和腫瘤等一系列并發癥[2-4]。所以，干細胞治療創面的療效一直備受爭議。細胞因子療法也一度成為促進創面愈合的熱門研究領域，但由于細胞因子半衰期短、不穩定、靶細胞的吸收率低等一系列因素，使得細胞因子修復創面愈合的療效一直不樂觀[5]。近期研究發現，MSCs 的療效主要來自于其旁分泌方式分泌的產物——外泌體（exosomes，EXOs）[6]。MSCs-EXOs 治療創面由于避免了干細胞治療的免疫排斥、致瘤、栓塞等缺點，且具有高穩定性、易于儲存、無需增殖、便于定量使用等優勢，與單一細胞因子治療比較，具有較高的安全性和更大的組織再生潛能，從而成為近年研究的熱點領域[6]。本文就 MSCs-EXOs 的生物學特性以及促進創面愈合的研究進展綜述如下。
1 EXOs的生物學特性
EXOs 是一種由細胞經過“內吞-融合-外排”等一系列調控過程形成的直徑 40～100 nm 的膜性脂質小囊泡[7]。EXOs 首先由 Harding 等[8]于 1983 年在大鼠的網織紅細胞中發現。1985 年，Pan 等[9]用電鏡同樣發現了這種由細胞分泌的小囊泡。1987 年，Johnstone 等[10]將這種小囊泡正式定義為“exosomes”。而 EXOs 是細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的一種亞型。EVs 是脂質雙層膜封閉的亞細胞結構，通常為球形，尺寸范圍為幾納米至幾微米。它們幾乎是由體內的每種細胞類型產生的，并且已從大多數體液（從母乳到尿液樣品）及分離的組織和細胞培養上清液中分離出來[7, 11]。EVs 根據其生物合成模式被分為 3 個主要亞型——EXOs、微泡和凋亡小體[7]。
EXOs 的合成始于細胞膜的內向出芽和初級核內體的產生，這些初級核內體進一步內向出芽形成次級核內體，次級核內體繼續向內逆向出芽，形成含有多囊泡的次級核內體，稱為多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）。MVBs 部分進入溶酶體被降解；剩余部分與質膜融合，再次向內凹陷出芽為顆粒狀小囊泡，并釋放到細胞外，這種囊泡結構就稱為 EXOs[12]。微泡起源于質膜的小突起向外出芽和酶促裂變，其生成需要通過調節肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，而使細胞骨架蛋白收縮[13]。當細胞進行程序性死亡時，凋亡細胞經核碎裂形成核碎片，然后整個細胞通過發芽、起泡等方式形成一個球形的突起，并在其根部脫落形成一些大小不等，內含細胞質、細胞器及核碎片的小體稱為凋亡小體，凋亡小體在細胞間通訊過程中也具有功能效應[14]。
EXOs 囊泡膜具有脂質雙分子層結構，其大小較均一，直徑為 40～100 nm，膜表面標記物主要有 CD9、CD63、CD81、CD82、HSP70 等。囊泡內富含多種蛋白質和核酸如 mRNA、微小 RNA（micro RNA，miRNA） 等，其中 Alix 蛋白和 TSG101 蛋白為其囊內標記物[15]。微泡直徑較 EXOs 大，為 100～1 000 nm。微泡內除了富含蛋白質、mRNA 及 miRNA 外，還有大量細胞因子、趨化因子、金屬蛋白酶和磷脂酰絲氨酸等，其標記物主要有整合素、基質金屬蛋白酶和組織因子等[16]。凋亡小體大小為 50～5 000 nm，內含組蛋白質、RNA、DNA 等，其磷脂酰絲氨酸含量也很高[14]。
2 創面愈合的生理過程
創面愈合是一個動態又復雜的生理過程，已被細分為 4 個階段：止血期、炎癥期、增殖期和重塑期[17]。
在止血期，創面形成的血凝塊保護傷口部位免受環境污染，并提供基質和可溶性因子如 TGF-β、PDGF、FGF 和 EGF 促進黏附，并成為創面愈合過程中各種細胞譜系分化的誘導劑[18-20]。
隨后的炎癥期以骨髓來源免疫細胞浸潤為特征，通過清除創面部位的病原體、凋亡細胞、細胞碎片和受損基質，為愈合做準備[17]。微生物病原體被中性粒細胞除去，巨噬細胞接下來就開始吞噬凋亡的細胞和細胞碎片[21]。當然，淋巴細胞也參與傷口愈合，文獻表明 CD4+ T 細胞與促愈合作用有關，而 CD8+ T 細胞則對創面修復有負面影響[22]。其中更發現一種在皮膚駐留的 γ-δT 細胞亞群，其可通過調節組織結構和炎癥以及防止感染，從而在創面愈合中發揮重要作用。這些炎癥變化最終促進 M1 型巨噬細胞向 M2 型巨噬細胞轉變[23]。
當到達增殖期時，M2 型巨噬細胞通過調節角質形成細胞、成纖維細胞和內皮細胞的增殖和遷移，來促進組織再生以及大量細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的產生[18]。
到最后的重塑期，新生 ECM 的膠原蛋白分解和結構調整導致傷口厚度減小，大部分新生成的毛細血管退化，使組織的血管正常化，并通過下面結締組織的收縮將創面的邊緣拉到一起，最后創面得以愈合[17, 20, 24]。
3 MSCs-EXOs調節創面愈合
3.1 調控創面的炎性反應
炎癥是機體響應有害刺激的一種自衛機制，當機體遭受損害或病原體侵入后，良好調節的炎性反應是創面愈合的基本保障[25]。
在皮膚損傷后 24～36 h，嗜中性粒細胞作為主要細胞類型最初招募到損傷部位，吞噬外來顆粒、病原體、受損組織和細胞[18]。皮膚損傷后 48～72 h 內，巨噬細胞被募集到傷口部位，并繼續吞噬過程[26]。巨噬細胞呈現促炎 M1 表型和抗炎 M2 表型，M2 型巨噬細胞在組織重塑和血管生成等方面起著核心作用，而 M1 型巨噬細胞則產生促炎細胞因子，吞噬病原體和受損細胞[27]。近年研究表明，EXOs 可通過骨髓來源的巨噬細胞被有效攝取，導致它們從 M1 表型向 M2 表型轉變[28]。另一項研究顯示，脂多糖預處理的 MSCs-EXOs 攜帶的 miRNA-let-7b，可通過抑制 TLR4/NF-κB 通路和激活 STAT3/AKT 信號傳導通路來調節巨噬細胞極化，從而促進創面愈合[29]。
此外，有研究表明，活化的 T 調節性細胞可以通過減少 IFN-γ 產生和 M1 型巨噬細胞聚集促進創面愈合[30]。并且，MSCs-EXOs 不僅可調節 B 淋巴細胞的活化、分化和增殖，還可抑制 T 淋巴細胞的增殖，MSCs-EXOs 可以轉換活化的 T 淋巴細胞到 T 調節性細胞的表型，從而發揮免疫抑制作用[31-32]。
在炎性因子的調控上，MSCs-EXOs 也發揮著重要作用。多種 MSCs-EXOs 可以抑制多種促炎因子的分泌，包括 TNF-α、誘導型一氧化氮合酶、環加氧酶、IL-1 和單核細胞趨化蛋白等，并促進抗炎因子如 IL-10 的分泌[33-35]。有研究表明，MSCs-EXOs 能激活有絲分裂原活化蛋白激酶信號傳導通路，從而抑制促炎因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的分泌[36-38]。另外，Eirin 等[39]在代謝綜合征和腎動脈狹窄的豬模型中，發現 MSCs-EXOs 通過促進抗炎細胞因子 IL-10 的分泌來減輕炎癥。
通過分析 miRNA 表達譜，Ti 等[40]證實 MSCs-EXOs 攜帶的 3 個具有調控有關免疫應答和炎癥功能的特定 miRNAs（miRNA-21、miRNA-146a 和 miRNA-181C），在靶細胞中具有最高表達。此外，研究表明，MSCs-EXOs 攜帶的 miRNA-181C 可通過下調 TLR4 信號傳導通路，從而降低過度的炎性反應[34]。
3.2 促進創面的血管生成
新血管的形成是在多種生理和病理過程，包括創面愈合和組織修復的關鍵步驟[41]。Zhang 等[42]發現，人臍帶MSCs（human umbilical cord MSCs，hucMSCs-EXOs）介導 Wnt4/β 連環蛋白激活，促進內皮細胞增殖和遷移，從而促進血管生成，這可能是一個重要的皮膚傷口愈合機制。Sahoo 等[43]發現人 CD34+ 干細胞衍生的 EXOs 與促進血管生成的 miRNAs（miRNA-126 和 miRNA130A），兩者均可顯著誘導血管在局部缺血的組織中富集。
此外，人脂肪來源干細胞（human adipose derived stem cells，hADSCs）來源的 EXOs 含有豐富的 miRNA-125A 和 miRNA-31，其可被轉移到血管內皮細胞，從而顯著促進血管生成。張靜等[44]研究已證明 hADSCs-EXOs 可促進血管內皮細胞的增殖、遷移，從而促進血管新生。既往研究證明 hADSCs-EXOs 可以通過抑制 DLL4 將 miR-125a 轉移到內皮細胞，從而促進血管生成[45]。Kang 等[46]還證實，hADSCs-EXOs 可以通過抑制 HIF1 將 miRNA-31 轉移到內皮細胞，促進血管生成。Shabbir 等[47]發現，MSCs-EXOs 激活了與傷口愈合相關聯的信號通路（AKT、ERK 和 STAT3）和誘導的許多生長因子（如肝細胞生長因子、IGF-1、NGF 和 stromal-表達衍生生長因子 1）來促進新生血管的形成。
3.3 促進皮膚細胞增殖和再上皮化
在增殖期，成纖維細胞增殖通常開始于皮膚損傷后第 3 天，此后成纖維細胞出現并開始增殖產生 ECM；此外，上皮細胞開始增殖并朝創面中心遷移，從而加速創面愈合。因此，細胞增殖和皮膚上皮再形成是皮膚再生的關鍵[41]。
有研究發現，在糖尿病大鼠模型中，富血小板血漿衍生的 EXOs 通過激活 YAP 蛋白，有效促進成纖維細胞的增殖和遷移，以及創面皮膚再上皮化[48]。尹剛等[49]也發現 ADSCs-EXOs 能夠促進周圍神經損傷后再生。另外，Geiger 等[50]發現，人成纖維細胞衍生的 EXOs 富含具有生物活性的熱休克蛋白-90α，以及具有促血管生成能力的 miR-126、miR-130a、miR-132，具有抗炎作用的miR-124a、miR-125b，以及具有調節膠原沉積的miR-21，從而表現出加速創面血管生成、加速創面成纖維細胞及上皮細胞的增殖和遷移，來促進創面愈合。Hu 等[51]發現，hADSCs-EXOs 可以通過促進成纖維細胞增殖和膠原蛋白合成，以及上調 N 鈣黏蛋白的基因表達，促進細胞周期蛋白 1、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Ⅰ型膠原和體外Ⅲ型膠原的合成，來促進創面愈合。體內實驗[46]也證明，hADSCs-EXOs 通過優化成纖維細胞特性，從而顯著促進皮膚傷口愈合。
此外，Zhang 等[52]發現，人誘導多能干細胞衍生的 MSCs-EXOs 通過促進人皮膚成纖維細胞增殖和遷移，以及通過增強膠原合成促進皮膚創面愈合。研究表明，在大鼠深二度燒傷損傷模型中，hucMSCs-EXOs 可抑制細胞凋亡，并激活 Wnt4/β-catenin 和 AKT 信號通路，以增加角蛋白 19、PCNA 和Ⅰ型膠原的表達，從而促進細胞增殖，加速再上皮化[53]。
3.4 促進膠原重塑從而減少瘢痕
嚴重創傷和大面積燒傷通常會導致瘢痕形成，這是肌成纖維細胞過度聚集和 ECM 沉積的結果。瘢痕的形成不僅影響美觀，而且也影響器官功能[41]。
Hu 等[51]報道，hADSCs-EXOs 可優化成纖維細胞的特性來促進創面愈合，他們發現在創面愈合早期階段，hADSCs-EXOs 通過促進成纖維細胞分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原，從而加速皮膚再生；然而在晚期階段，它們可以抑制膠原蛋白的表達，從而減少瘢痕形成。Fang 等[54]證明臍帶間充質干細胞來源 EXOs 內攜帶一些特異性 miRNAs（miRNA-21、miRNA-23A、miRNA-125B 和 miRNA-145），這些 miRNAs 通過抑制 TGF-β/SMAD2 通路，抑制肌成纖維細胞分化和過度纖維化，從而減少瘢痕形成。Zhao 等[55]報道表明，在大鼠創面模型中，高濃度的人羊膜上皮細胞來源 EXOs 通過刺激基質金屬蛋白酶 1 的表達來調控 ECM 沉積，從而促進創面愈合。
此外，近年研究表明，hucMSCs-EXOs 抑制皮膚瘢痕形成的新機制是，在皮膚再生的重塑階段，hucMSCs-EXOs 遞送 14-3-3ζ 蛋白，有效地調控 YAP 通路；在高細胞密度條件下，14-3-3ζ 蛋白募集 YAP 和 p-LATS 形成復合物，復合物誘導 YAP 磷酸化來抑制 Wnt/β-連環蛋白信號傳導，從而限制過度真皮成纖維細胞擴張和膠原沉積[56]。
4 EXOs的臨床應用前景
4.1 作為載體和聯合支架治療創面
在臨床上，基于 EXOs 的巨大作用潛力，利用其天然的生物相容性和細胞靶向定位性，很多科學家將注意力集中在將 EXOs 作為新藥的載體輸送系統上[6]。另外，為了穩定 EXOs 的局部作用濃度以保證其治療效果，EXOs 可混合水凝膠或涂層在纖維蛋白凝膠上，水凝膠或纖維蛋白凝膠作為支架起到緩釋作用，從而增強 EXOs 的創面愈合能力[6]。
4.2 可開發為免疫抑制劑
基于 EXOs 在免疫調節上的抑制作用，臨床上可將 EXOs 作為免疫抑制治療劑。但由于 EXOs 攜帶少量同種異體蛋白，可刺激自身免疫反應，所以其在免疫調節的應用上尚待考證[57]。最近研究表明，生產含有 EXOs 成分的人造脂質囊泡是一種可行辦法，以增加其穩定性和吸收性。人造 EXOs 磷脂酰絲氨酸的水平使其具有剛性的囊泡膜，可防止胞膜內容物的降解[58]。
4.3 提升EXOs的分離和鑒定技術
臨床上使用 EXOs 作為治療劑的另一個棘手問題是 EXOs 的分離技術。首先，目前 EVs 研究的最新技術尚缺乏廣泛適用的方法來分離和鑒別各個 EVs 亞型；其次，可用的技術導致分離物在不同程度上由多種 EVs 亞型組成，并且還可能含有非 EVs 成分，如脂蛋白、蛋白質和病毒，這取決于初始生物液的性質[59]。
4.4 提高EXOs的功效
盡管現在已證明了 MSCs-EXOs 在創面愈合中的積極作用，但需要進一步提高治療功效。如何提高 EXOs 功效已成為臨床中的熱門話題。目前，有 3 種方法已被用于進一步改善 EXOs 的功效：① 用治療藥物作用于 EXOs 供體細胞。用特定藥物預處理 EXOs 供體細胞有可能改變 EXOs 表達特征，從而調節其治療特性[60]。近年，Lu 等[61]報道用 TNF-α 預處理 ADSCs，從而增加 EXOs 中 Wnt3a 的釋放，促進成骨基因表達。② EXOs 供體細胞的基因工程。在 EXOs 分離之前對供體細胞進行基因工程技術，似乎也是一種非常有前景的策略。許多不同的技術可用于將遺傳物質引入靶細胞，包括重組病毒載體（慢病毒、腺病毒、腺相關病毒）或非病毒轉染技術[62]。可以應用特定 mRNA 或 miRNA 的過表達或沉默技術來改變 EXOs 的表達特性。研究表明，具有促血管新生作用的 miRNA-126 在人滑膜間充質干細胞中的過表達，導致其產生的 EXOs 具有促進人皮膚微血管內皮細胞增殖、遷移和管形成的能力，從而增強糖尿病患者的皮膚創面愈合[63]。③ EXOs 的直接操作，可選擇的方法包括用脂質體處理，與藥物或生物分子直接孵育等[64]。
5 小結與展望
上述研究證明 EXOs 可促進創面愈合，從細胞角度看，EXOs 通過增強上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞的增殖、遷移，以及調節血管新生、膠原合成和 ECM 重塑的能力，來達到創面更快愈合的目的；從分子角度看，EXOs 通過攜帶特定的 miRNA 或蛋白質，來調節靶細胞基因的表達和信號通路的激活。目前雖已證明 EXOs 治療創面從安全性和療效方面都有不錯的效果，但其安全性和療效仍不能完全保證。希望進一步了解 EXOs 促進創面愈合的機制，同時改進 EXOs 純化和鑒定的方法，最終能夠開發出針對急性和慢性創面的高效 EXOs 治療產品。