引用本文： 高超, 李超明, 徐玉龍, 王振勇, 李浩江, 羅旭江, 彭禮慶, 張彬, 沈師, 劉舒云, 眭翔, 郭全義, 楊建華. 靜電紡絲聚己內酯/Ⅰ型膠原納米纖維取向性補片用于肩袖修復. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(5): 628-633. doi: 10.7507/1002-1892.201811034 復制
肩袖損傷是外科臨床中最常見的肌腱損傷之一，由于肌腱固有的不良再生能力[1]，其自然愈合過程中常常形成瘢痕組織，降低了肌腱整體機械性能，損傷肌腱往往發生再次撕裂。目前用于損傷肌腱修復的治療方式包括直接縫合、自體肌腱移植、同種異體肌腱移植和人工肌腱替代物移植。由于缺乏供體肌腱或存在免疫排斥反應等問題，使得自體肌腱移植、同種異體肌腱移植在臨床上的應用受到限制。組織工程的飛速發展為肌腱再生修復提供了新的希望。組織工程利用種子細胞、生物支架、細胞因子的一種或不同組合取代或修復受傷組織，其中支架在組織再生過程中起到了至關重要的作用。研究表明，Ⅰ型膠原為天然高分子材料，是肌腱中占比最大的有機物，約占肌腱干質量的 60%，占膠原總質量的 95%[2]。聚己內酯（polycaprolactone，PCL）具有良好的生物相容性和力學性能，并且該材料在體內的降解產物無毒，是經美國食品藥品監督管理局（FDA）批準通過的已被大量用于組織再生和修復領域的材料，但 PCL 材料存在細胞親和性較低、降解速度慢等不足[3]。
靜電紡絲技術的興起為組織工程支架的構建提供了新的途徑。靜電紡絲技術能夠簡單且可控地將無機分子與高分子材料混合，制作出具有高孔隙率、高比表面積，力學性能可控，模擬人體組織的微納米級結構，為細胞的黏附提供位點，并有利于細胞與支架材料的相互作用[4-6]。許多研究表明，細胞外基質樣納米纖維具有定制的納米纖維結構（直徑、取向性或非取向性排列、孔隙大小、孔隙率）、可控降解性和固定化可溶性信號，可提供理想的細胞刺激信號，促進細胞黏附、增殖、定向分化和組織形成[7-8]。利用這些優勢，靜電紡絲納米纖維被廣泛用于骨組織工程[9]、創面敷料[10]、人工血管形成[11]、神經組織再生[12]、藥物輸送載體[13]和生物分子輸送[14]等方面。本實驗在預實驗基礎上，得到 PCL 和Ⅰ型膠原的最優靜電紡絲濃度，通過靜電紡絲技術制備 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維取向性補片，對其進行理化表征和生物性能評價，探討其作為肩袖修復人工合成材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康 3 周齡新西蘭大白兔 2 只，體質量 0.5 kg，購于解放軍總醫院實驗動物中心，所有動物實驗均已獲解放軍總醫院動物倫理委員會批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0062。
PCL（相對分子質量 80×103）、六氟異丙醇（阿拉丁生化科技股份公司）；0.25% 胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、死/活細胞染色試劑盒（Sigma 公司，美國）；牛跟腱Ⅰ型膠原（奧多福尼生物科技有限公司）；FBS（HyClone 公司，美國）；DMEM 培養基（Corning 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；鏈霉素-青霉素雙抗（GIBCO 公司，美國）。
靜電紡絲機（北京化工大學實驗室自制）；85-2 型恒溫磁力攪拌器（蘇州國華儀器有限公司）；冷凍干燥機（北京博醫康技術有限公司）；E-1045 型掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；Epoch Take 3 酶標儀（Bio-Tek 公司，美國）；BOSE 5100 生物力學試驗機（BOSE 公司，美國）；傅氏轉換紅外線光譜分析儀（Ettlingen 公司，德國）；接觸角測量儀（上海中晨數字技術設備有限公司）；CO2 恒溫培養箱（Heraeus 公司，德國）；A1R-si 型共聚焦激光掃描顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 納米纖維取向性補片的制備
1.2.1 靜電紡絲溶液的配制
用電子天平稱取 2 g PCL，加入 18 g 六氟異丙醇溶液中，在磁力攪拌下使其完全溶解，制備質量比為 10% 的 PCL 靜電紡絲溶液；稱取 0.8 g 牛跟腱Ⅰ型膠原完全溶解在 9.2 g 六氟異丙醇中，制備質量比為 8% 的Ⅰ型膠原靜電紡絲溶液。取 4 g PCL 靜電紡絲溶液與 1 g Ⅰ型膠原靜電紡絲溶液混合，形成含有 25%Ⅰ型膠原的混合靜電紡絲溶液。
1.2.2 兩種納米纖維取向性補片的制備
首先制備 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片，將 6 mL 混合靜電紡絲溶液在通風櫥中轉移至注射器中，并使用型號為 21 G 的鈍頭針安裝在注射器上。將注射器裝在靜電紡絲機上，以 0.8 mL/h 速率進行推注。針頭尖端和接收器之間的距離為 15 cm。針頭端連接正高壓，接收器端連接負高壓，兩端電壓差為 18 kV。在 3 000 r/min 高速轉動的接收裝置上，覆蓋鋁箔用于接受取向性纖維補片。電紡完畢后，將電紡絲膜與錫紙一起取下，在真空干燥箱中處理 6 h，使六氟異丙醇充分揮發，隨后用密封袋包裝密封保存。制備單純 PCL 取向性補片時，取 6 mL 10%PCL 靜電紡絲溶液，采用相同的方法進行靜電紡絲。
1.3 兩種補片理化表征觀測指標
1.3.1 大體及微觀結構觀測
取兩種補片分別觀察其大體形貌，然后各剪取 1 cm×1 cm 的小塊，分別黏貼固定于 5 cm 鋁架上，并進行噴金處理，在高壓 5 000 V、發射電流 10 μA 條件下進行掃描電鏡觀察。采用 Image-Pro Plus 軟件對兩種補片內表面 3 張圖片中的 50 條纖維直徑進行測量，計算纖維的平均直徑，并通過密度法檢測補片孔隙率。
1.3.2 力學性能檢測
通過單軸拉伸試驗檢測兩種補片纖維的力學性能。取兩種補片各裁剪 3 個寬 10 mm，有效拉伸長度 20 mm，厚度約 0.15 mm 的樣品。每個樣品在測試前預加載至 0.1 N 以防止樣品松弛，隨后以 5 mm/min 速率拉伸至 5% 應變，而后以相同速率卸載至 0 應變，往復循環 10 次；隨后樣品以 5 mm/min 速率拉伸至斷裂。根據繪制的應力-應變曲線分別記錄兩種補片的拉伸強度，并計算材料的楊氏模量。
1.3.3 紅外光譜分析
取兩種補片剪切成 1 cm×1 cm 的小塊，分別進行壓片，使樣品表面平整光滑。將壓片后的補片放入傅氏轉換紅外線光譜分析儀的反應倉中，以 1 cm?1的分辨率，在 450～4 000 cm?1的吸收光譜范圍內進行分析，根據吸收峰所對應的紅外線波長來確定電紡膜中所存在的官能團，從而確定兩種補片中的成分。
1.3.4 表面接觸角檢測
取兩種補片，經 75% 乙醇擦拭后剪成 1 cm×1 cm 的小塊（n=5）。通過靜滴法，將去離子水滴到兩種補片平整的表面，從側面進行拍照。通過顯微鏡頭與相機獲得液滴的外形圖像，再運用計算機自帶的數字圖像處理軟件，計算圖像中液滴的表面接觸角。
1.4 兩種補片的生物性能評估
1.4.1 兔肌腱干細胞分離培養
取新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉，常規備皮，手術暴露跟腱組織，剝離腱外膜組織，切取整段跟腱，PBS 液洗滌 3 次。將肌腱組織轉移至無菌玻璃瓶中，用眼科剪將半月板剪碎，加入 0.25% 胰蛋白酶和 0.1%Ⅰ型膠原酶，并將無菌磁珠置入玻璃瓶中；然后將玻璃瓶密封后置于 37℃、5%CO2 培養箱內，磁力攪拌器消化 60 min，至組織碎塊完全消失；加入含 20%FBS 的 DMEM 培養液終止消化，以離心半徑 10 cm、2 000 r/min 離心 5 min；去除上清，加入新鮮的含 20%FBS 的 DMEM 培養液，置于 25 cm2 培養瓶內。在原代細胞貼壁生長且融合成單層細胞后，進行傳代培養。取第 3 代細胞進行以下實驗。
1.4.2 CCK-8法檢測細胞活性
根據 ISO10993-12：2009 醫療器械的生物學評定標準，按照浸提比為 1.25 cm2/mL 制備浸提液。分別將 15 cm2 60Co 輻照滅菌后的單純 PCL 補片和 PCL/Ⅰ型膠原補片浸入 90 mL 含 20%FBS 的 DMEM 培養基中，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 72 h；然后將浸提液以離心半徑 10 cm、1 200 r/min 離心 5 min，取上清，制得單純 PCL 補片和 PCL/Ⅰ型膠原補片的 DMEM 浸提液。取第 3 代兔肌腱干細胞，以 4×103個/孔密度接種至 96 孔板，實驗分為 3 組，每組設置 3 個復孔。實驗組和對照組每孔分別加入 200 μL 相應補片浸提液培養基，空白對照組用含 20%FBS 的 DMEM 培養基培養細胞。將 3 組細胞于 37℃、5%CO2 培養箱內培養 5 d，每天取出 1 個孔板，分別加入 10 μL CCK-8 試劑，繼續培養 4 h，用酶標儀于 450 nm 波長下測定吸光度（A）值。
1.4.3 細胞黏附及活性觀察
將兩種補片剪成 1 cm×1 cm 的小塊，60Co 滅菌備用。取第 3 代兔肌腱干細胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化計數，加入含 20%FBS 的 DMEM 培養基重懸后，制備成濃度為 3×106個/mL 的細胞懸液，分別接種至兩種補片上，每個補片 100 μL（即每個補片復合 3×105個細胞）；置于 37℃、5%CO2 培養箱孵育 2 h 后，加入含 20%FBS 的 DMEM 培養基，返回培養箱繼續培養。 3 d 后取出細胞-補片復合物，PBS 溶液清洗，按照死/活細胞染色試劑盒說明書進行死/活細胞染色，共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察肌腱干細胞在兩組補片上的活性和黏附情況。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 兩種補片理化表征觀測
2.1.1 大體及微觀結構觀測
大體觀察示，兩組補片均呈乳白色，表面光滑，無明顯粗糙、顆粒感，PCL/Ⅰ型膠原補片略寬于單純 PCL 補片。見圖 1。掃描電鏡觀察示，兩種補片纖維均呈取向性排列，但 PCL/Ⅰ型膠原補片纖維排列取向稍差。對照組補片的纖維直徑為（1.376 3±0.290 2）μm，顯著高于實驗組的（0.247 9±0.061 0）μm，差異有統計學意義（t=26.907，P=0.000）。見圖 2。實驗組補片纖維孔隙率為 56.44%±12.70%，顯著高于對照組的 41.33%±11.41%，差異有統計學意義（t=2.506，P=0.032）。
圖1
兩種補片大體觀察
a. 對照組；b. 實驗組
Figure1. Gross observation of the two patchesa. Control group; b. Experimental group
圖2
兩種補片掃描電鏡觀察（×800）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure2. Scanning electron microscope observation of the two patches (×800)a. Control group; b. Experimental group
2.1.2 力學性能檢測
對照組和實驗組補片的纖維拉伸強度分別為（11.84±2.80）、（23.35±4.59）MPa，楊氏模量分別為（89.90±21.92）、（145.39±12.54）MPa，比較差異均有統計學意義（t=3.705，P=0.029；t=4.064，P=0.034）。
2.1.3 紅外光譜分析
對照組補片中存在 1 725 cm?1處的羰基和 1 165 cm?1處的 C?O 鍵兩個特征吸收峰（均為 PCL 的特征性吸收峰），以及一些相對矮小的吸收峰；實驗組補片中除發現上述對照組補片的吸收峰外，還存在 1 653 cm?1、1 547 cm?1、3 310 cm?1 3 個特征峰（分別對應?C=C?、?NO2、?C≡C?H 特征基團，均為Ⅰ型膠原的特征性吸收峰）。見圖 3。
圖3
兩種補片紅外光譜圖
Figure3.
Fourier transform infrared spectroscopy of the two patches
2.1.4 表面接觸角檢測
實驗組補片表面接觸角為（73.88±4.97）°，為親水的；而對照組補片表面接觸角為（128.46±5.10）°，為疏水的；兩組表面接觸角比較差異有統計學意義（t=21.705，P=0.002）。見圖 4。
圖4
兩種補片的表面接觸角
a. 對照組；b. 實驗組
Figure4. The water contact angle of the two patchesa. Control group; b. Experimental group
2.2 兩種補片的生物性能評估
2.2.1 CCK-8法檢測細胞活性
隨培養時間延長，各組細胞 A 值均逐漸增加，各時間點實驗組和對照組 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；兩組與空白對照組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
CCK-8法檢測各組細胞活性
Figure5.
The cytotoxicity of each group by CCK-8 method
2.2.2 細胞黏附及活性觀察
共聚焦激光掃描顯微鏡觀察示，培養 3 d，兔肌腱干細胞在兩種補片表面均可黏附、生長，實驗組補片表面黏附的細胞數量多于對照組，且活性更好。見圖 6。
圖6
死/活細胞染色觀察兔肌腱干細胞在兩種補片表面的黏附及活性（共聚焦激光掃描顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. Adhesion and activity of rabbit tendon stem cells on the surface of the two patches observed by dead/living cell staining (Laser confocal scanning microscopy×200)a. Control group;b. Experimental group
3 討論
肌腱連接肌肉和骨骼，在應力傳遞和關節穩定性方面起著至關重要的作用[15]。然而肌腱組織極易受到損傷，由于細胞外基質密度高，膠原組織、血管通透性差，其再生傾向較低。組織工程技術的發展為肌腱再生修復提供了新的途徑。通過組織工程理念設計出一種新型肩袖補片，具有強大的機械強度，同時可以促進遷延而來的 BMSCs 以及激活的肌腱干細胞向肌腱細胞分化，為損傷肌腱提供良好微環境，成為臨床發展的新方向。靜電紡絲技術制備的 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片為功能性修復損傷的肩袖帶來了新的希望。
本研究掃描電鏡結果表明，靜電紡絲技術可以制備直徑為微米級的有序排列的纖維絲，且纖維絲之間孔隙良好。文獻報道靜電紡絲中，微米纖維和納米纖維的組合可產生更大的孔隙互連性和更大孔徑，從而導致更好的細胞滲透[16]。Orr 等[17]研究發現，與無序的纖維相比，多層有序排列的 PCL 靜電紡絲支架可模仿天然肌腱組織的各向異性，顯著增加了細胞浸潤，促進了間充質細胞的腱系分化，并提高了肌腱細胞外基質生成。Lomas 等[18]發現有序的靜電紡絲纖維增加了肌腱樣組織生成，雖然新生成的組織與天然組織相比更薄，機械性能更弱，但是支架的機械刺激促進更多有序的膠原纖維生成，大大增加了支架強度。多孔結構的靜電紡絲納米纖維補片有利于組織之間的物質交換，可以更好地促進肌腱愈合。通過力學檢測可以發現，PCL/Ⅰ型膠原補片的拉伸強度和楊氏模量均強于單純 PCL 補片，說明加入Ⅰ型膠原可以顯著提高補片的力學性能。這也證實了當紡絲纖維中加入明膠、幾丁質、膠原等材料時，靜電紡絲材料的力學性能增強[19]。紅外光譜分析結果顯示，PCL/Ⅰ型膠原補片的吸收峰與單純 PCL 補片相比發生了變化，說明Ⅰ型膠原和 PCL 成功混合，并未在紡絲過程中丟失，且兩者未發生化學反應。Qiu 等[20]發現，Ⅰ型膠原支架與機械刺激共同作用可以促進人 MSCs 向成纖維細胞分化，所以我們認為 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片比單純 PCL 補片更適合肩袖損傷的再生修復。
由于補片將被用來修復肩袖損傷，材料表面為親水性更有利于細胞黏附和增殖，所以測定其親水性十分必要[21]。Ghosal 等[22]研究發現，將膠原和 PCL 混合后材料的親水性有所提高，表面接觸角降低。本研究結果顯示，PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片的表面接觸角顯著小于單純 PCL 補片，說明Ⅰ型膠原的加入可以增加材料的親水性，更有利于細胞黏附。Kopf 等[23]提出，親水性材料表面可增加單位時間內細胞在材料表面的黏附數量，并進一步通過整合素介導細胞外基質等蛋白的黏附。本研究 CCK-8 細胞增殖與毒性實驗進一步表明兩種補片均無細胞毒性，對細胞的增殖無明顯抑制作用。細胞-補片復合物共聚焦激光掃描顯微鏡觀察結果也提示，PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片較單純 PCL 補片更容易使細胞黏附、生長。
綜上述，利用靜電紡絲技術制備的 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片可仿生天然組織的膠原纖維排列，一定程度實現了肌腱生物力學的各向異性；且 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片具有優良的理化性能，可以使細胞更好地黏附同時保持良好活性，未來可能作為肩袖修復理想的組織工程補片。但本實驗只檢測了在體外環境下 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片的性能，尚需進一步動物實驗驗證其促進肌腱愈合的能力。
肩袖損傷是外科臨床中最常見的肌腱損傷之一，由于肌腱固有的不良再生能力[1]，其自然愈合過程中常常形成瘢痕組織，降低了肌腱整體機械性能，損傷肌腱往往發生再次撕裂。目前用于損傷肌腱修復的治療方式包括直接縫合、自體肌腱移植、同種異體肌腱移植和人工肌腱替代物移植。由于缺乏供體肌腱或存在免疫排斥反應等問題，使得自體肌腱移植、同種異體肌腱移植在臨床上的應用受到限制。組織工程的飛速發展為肌腱再生修復提供了新的希望。組織工程利用種子細胞、生物支架、細胞因子的一種或不同組合取代或修復受傷組織，其中支架在組織再生過程中起到了至關重要的作用。研究表明，Ⅰ型膠原為天然高分子材料，是肌腱中占比最大的有機物，約占肌腱干質量的 60%，占膠原總質量的 95%[2]。聚己內酯（polycaprolactone，PCL）具有良好的生物相容性和力學性能，并且該材料在體內的降解產物無毒，是經美國食品藥品監督管理局（FDA）批準通過的已被大量用于組織再生和修復領域的材料，但 PCL 材料存在細胞親和性較低、降解速度慢等不足[3]。
靜電紡絲技術的興起為組織工程支架的構建提供了新的途徑。靜電紡絲技術能夠簡單且可控地將無機分子與高分子材料混合，制作出具有高孔隙率、高比表面積，力學性能可控，模擬人體組織的微納米級結構，為細胞的黏附提供位點，并有利于細胞與支架材料的相互作用[4-6]。許多研究表明，細胞外基質樣納米纖維具有定制的納米纖維結構（直徑、取向性或非取向性排列、孔隙大小、孔隙率）、可控降解性和固定化可溶性信號，可提供理想的細胞刺激信號，促進細胞黏附、增殖、定向分化和組織形成[7-8]。利用這些優勢，靜電紡絲納米纖維被廣泛用于骨組織工程[9]、創面敷料[10]、人工血管形成[11]、神經組織再生[12]、藥物輸送載體[13]和生物分子輸送[14]等方面。本實驗在預實驗基礎上，得到 PCL 和Ⅰ型膠原的最優靜電紡絲濃度，通過靜電紡絲技術制備 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維取向性補片，對其進行理化表征和生物性能評價，探討其作為肩袖修復人工合成材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康 3 周齡新西蘭大白兔 2 只，體質量 0.5 kg，購于解放軍總醫院實驗動物中心，所有動物實驗均已獲解放軍總醫院動物倫理委員會批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0062。
PCL（相對分子質量 80×103）、六氟異丙醇（阿拉丁生化科技股份公司）；0.25% 胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、死/活細胞染色試劑盒（Sigma 公司，美國）；牛跟腱Ⅰ型膠原（奧多福尼生物科技有限公司）；FBS（HyClone 公司，美國）；DMEM 培養基（Corning 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；鏈霉素-青霉素雙抗（GIBCO 公司，美國）。
靜電紡絲機（北京化工大學實驗室自制）；85-2 型恒溫磁力攪拌器（蘇州國華儀器有限公司）；冷凍干燥機（北京博醫康技術有限公司）；E-1045 型掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；Epoch Take 3 酶標儀（Bio-Tek 公司，美國）；BOSE 5100 生物力學試驗機（BOSE 公司，美國）；傅氏轉換紅外線光譜分析儀（Ettlingen 公司，德國）；接觸角測量儀（上海中晨數字技術設備有限公司）；CO2 恒溫培養箱（Heraeus 公司，德國）；A1R-si 型共聚焦激光掃描顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 納米纖維取向性補片的制備
1.2.1 靜電紡絲溶液的配制
用電子天平稱取 2 g PCL，加入 18 g 六氟異丙醇溶液中，在磁力攪拌下使其完全溶解，制備質量比為 10% 的 PCL 靜電紡絲溶液；稱取 0.8 g 牛跟腱Ⅰ型膠原完全溶解在 9.2 g 六氟異丙醇中，制備質量比為 8% 的Ⅰ型膠原靜電紡絲溶液。取 4 g PCL 靜電紡絲溶液與 1 g Ⅰ型膠原靜電紡絲溶液混合，形成含有 25%Ⅰ型膠原的混合靜電紡絲溶液。
1.2.2 兩種納米纖維取向性補片的制備
首先制備 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片，將 6 mL 混合靜電紡絲溶液在通風櫥中轉移至注射器中，并使用型號為 21 G 的鈍頭針安裝在注射器上。將注射器裝在靜電紡絲機上，以 0.8 mL/h 速率進行推注。針頭尖端和接收器之間的距離為 15 cm。針頭端連接正高壓，接收器端連接負高壓，兩端電壓差為 18 kV。在 3 000 r/min 高速轉動的接收裝置上，覆蓋鋁箔用于接受取向性纖維補片。電紡完畢后，將電紡絲膜與錫紙一起取下，在真空干燥箱中處理 6 h，使六氟異丙醇充分揮發，隨后用密封袋包裝密封保存。制備單純 PCL 取向性補片時，取 6 mL 10%PCL 靜電紡絲溶液，采用相同的方法進行靜電紡絲。
1.3 兩種補片理化表征觀測指標
1.3.1 大體及微觀結構觀測
取兩種補片分別觀察其大體形貌，然后各剪取 1 cm×1 cm 的小塊，分別黏貼固定于 5 cm 鋁架上，并進行噴金處理，在高壓 5 000 V、發射電流 10 μA 條件下進行掃描電鏡觀察。采用 Image-Pro Plus 軟件對兩種補片內表面 3 張圖片中的 50 條纖維直徑進行測量，計算纖維的平均直徑，并通過密度法檢測補片孔隙率。
1.3.2 力學性能檢測
通過單軸拉伸試驗檢測兩種補片纖維的力學性能。取兩種補片各裁剪 3 個寬 10 mm，有效拉伸長度 20 mm，厚度約 0.15 mm 的樣品。每個樣品在測試前預加載至 0.1 N 以防止樣品松弛，隨后以 5 mm/min 速率拉伸至 5% 應變，而后以相同速率卸載至 0 應變，往復循環 10 次；隨后樣品以 5 mm/min 速率拉伸至斷裂。根據繪制的應力-應變曲線分別記錄兩種補片的拉伸強度，并計算材料的楊氏模量。
1.3.3 紅外光譜分析
取兩種補片剪切成 1 cm×1 cm 的小塊，分別進行壓片，使樣品表面平整光滑。將壓片后的補片放入傅氏轉換紅外線光譜分析儀的反應倉中，以 1 cm?1的分辨率，在 450～4 000 cm?1的吸收光譜范圍內進行分析，根據吸收峰所對應的紅外線波長來確定電紡膜中所存在的官能團，從而確定兩種補片中的成分。
1.3.4 表面接觸角檢測
取兩種補片，經 75% 乙醇擦拭后剪成 1 cm×1 cm 的小塊（n=5）。通過靜滴法，將去離子水滴到兩種補片平整的表面，從側面進行拍照。通過顯微鏡頭與相機獲得液滴的外形圖像，再運用計算機自帶的數字圖像處理軟件，計算圖像中液滴的表面接觸角。
1.4 兩種補片的生物性能評估
1.4.1 兔肌腱干細胞分離培養
取新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉，常規備皮，手術暴露跟腱組織，剝離腱外膜組織，切取整段跟腱，PBS 液洗滌 3 次。將肌腱組織轉移至無菌玻璃瓶中，用眼科剪將半月板剪碎，加入 0.25% 胰蛋白酶和 0.1%Ⅰ型膠原酶，并將無菌磁珠置入玻璃瓶中；然后將玻璃瓶密封后置于 37℃、5%CO2 培養箱內，磁力攪拌器消化 60 min，至組織碎塊完全消失；加入含 20%FBS 的 DMEM 培養液終止消化，以離心半徑 10 cm、2 000 r/min 離心 5 min；去除上清，加入新鮮的含 20%FBS 的 DMEM 培養液，置于 25 cm2 培養瓶內。在原代細胞貼壁生長且融合成單層細胞后，進行傳代培養。取第 3 代細胞進行以下實驗。
1.4.2 CCK-8法檢測細胞活性
根據 ISO10993-12：2009 醫療器械的生物學評定標準，按照浸提比為 1.25 cm2/mL 制備浸提液。分別將 15 cm2 60Co 輻照滅菌后的單純 PCL 補片和 PCL/Ⅰ型膠原補片浸入 90 mL 含 20%FBS 的 DMEM 培養基中，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 72 h；然后將浸提液以離心半徑 10 cm、1 200 r/min 離心 5 min，取上清，制得單純 PCL 補片和 PCL/Ⅰ型膠原補片的 DMEM 浸提液。取第 3 代兔肌腱干細胞，以 4×103個/孔密度接種至 96 孔板，實驗分為 3 組，每組設置 3 個復孔。實驗組和對照組每孔分別加入 200 μL 相應補片浸提液培養基，空白對照組用含 20%FBS 的 DMEM 培養基培養細胞。將 3 組細胞于 37℃、5%CO2 培養箱內培養 5 d，每天取出 1 個孔板，分別加入 10 μL CCK-8 試劑，繼續培養 4 h，用酶標儀于 450 nm 波長下測定吸光度（A）值。
1.4.3 細胞黏附及活性觀察
將兩種補片剪成 1 cm×1 cm 的小塊，60Co 滅菌備用。取第 3 代兔肌腱干細胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化計數，加入含 20%FBS 的 DMEM 培養基重懸后，制備成濃度為 3×106個/mL 的細胞懸液，分別接種至兩種補片上，每個補片 100 μL（即每個補片復合 3×105個細胞）；置于 37℃、5%CO2 培養箱孵育 2 h 后，加入含 20%FBS 的 DMEM 培養基，返回培養箱繼續培養。 3 d 后取出細胞-補片復合物，PBS 溶液清洗，按照死/活細胞染色試劑盒說明書進行死/活細胞染色，共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察肌腱干細胞在兩組補片上的活性和黏附情況。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 兩種補片理化表征觀測
2.1.1 大體及微觀結構觀測
大體觀察示，兩組補片均呈乳白色，表面光滑，無明顯粗糙、顆粒感，PCL/Ⅰ型膠原補片略寬于單純 PCL 補片。見圖 1。掃描電鏡觀察示，兩種補片纖維均呈取向性排列，但 PCL/Ⅰ型膠原補片纖維排列取向稍差。對照組補片的纖維直徑為（1.376 3±0.290 2）μm，顯著高于實驗組的（0.247 9±0.061 0）μm，差異有統計學意義（t=26.907，P=0.000）。見圖 2。實驗組補片纖維孔隙率為 56.44%±12.70%，顯著高于對照組的 41.33%±11.41%，差異有統計學意義（t=2.506，P=0.032）。
圖1
兩種補片大體觀察
a. 對照組；b. 實驗組
Figure1. Gross observation of the two patchesa. Control group; b. Experimental group
圖2
兩種補片掃描電鏡觀察（×800）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure2. Scanning electron microscope observation of the two patches (×800)a. Control group; b. Experimental group
2.1.2 力學性能檢測
對照組和實驗組補片的纖維拉伸強度分別為（11.84±2.80）、（23.35±4.59）MPa，楊氏模量分別為（89.90±21.92）、（145.39±12.54）MPa，比較差異均有統計學意義（t=3.705，P=0.029；t=4.064，P=0.034）。
2.1.3 紅外光譜分析
對照組補片中存在 1 725 cm?1處的羰基和 1 165 cm?1處的 C?O 鍵兩個特征吸收峰（均為 PCL 的特征性吸收峰），以及一些相對矮小的吸收峰；實驗組補片中除發現上述對照組補片的吸收峰外，還存在 1 653 cm?1、1 547 cm?1、3 310 cm?1 3 個特征峰（分別對應?C=C?、?NO2、?C≡C?H 特征基團，均為Ⅰ型膠原的特征性吸收峰）。見圖 3。
圖3
兩種補片紅外光譜圖
Figure3.
Fourier transform infrared spectroscopy of the two patches
2.1.4 表面接觸角檢測
實驗組補片表面接觸角為（73.88±4.97）°，為親水的；而對照組補片表面接觸角為（128.46±5.10）°，為疏水的；兩組表面接觸角比較差異有統計學意義（t=21.705，P=0.002）。見圖 4。
圖4
兩種補片的表面接觸角
a. 對照組；b. 實驗組
Figure4. The water contact angle of the two patchesa. Control group; b. Experimental group
2.2 兩種補片的生物性能評估
2.2.1 CCK-8法檢測細胞活性
隨培養時間延長，各組細胞 A 值均逐漸增加，各時間點實驗組和對照組 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；兩組與空白對照組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
CCK-8法檢測各組細胞活性
Figure5.
The cytotoxicity of each group by CCK-8 method
2.2.2 細胞黏附及活性觀察
共聚焦激光掃描顯微鏡觀察示，培養 3 d，兔肌腱干細胞在兩種補片表面均可黏附、生長，實驗組補片表面黏附的細胞數量多于對照組，且活性更好。見圖 6。
圖6
死/活細胞染色觀察兔肌腱干細胞在兩種補片表面的黏附及活性（共聚焦激光掃描顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. Adhesion and activity of rabbit tendon stem cells on the surface of the two patches observed by dead/living cell staining (Laser confocal scanning microscopy×200)a. Control group;b. Experimental group
3 討論
肌腱連接肌肉和骨骼，在應力傳遞和關節穩定性方面起著至關重要的作用[15]。然而肌腱組織極易受到損傷，由于細胞外基質密度高，膠原組織、血管通透性差，其再生傾向較低。組織工程技術的發展為肌腱再生修復提供了新的途徑。通過組織工程理念設計出一種新型肩袖補片，具有強大的機械強度，同時可以促進遷延而來的 BMSCs 以及激活的肌腱干細胞向肌腱細胞分化，為損傷肌腱提供良好微環境，成為臨床發展的新方向。靜電紡絲技術制備的 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片為功能性修復損傷的肩袖帶來了新的希望。
本研究掃描電鏡結果表明，靜電紡絲技術可以制備直徑為微米級的有序排列的纖維絲，且纖維絲之間孔隙良好。文獻報道靜電紡絲中，微米纖維和納米纖維的組合可產生更大的孔隙互連性和更大孔徑，從而導致更好的細胞滲透[16]。Orr 等[17]研究發現，與無序的纖維相比，多層有序排列的 PCL 靜電紡絲支架可模仿天然肌腱組織的各向異性，顯著增加了細胞浸潤，促進了間充質細胞的腱系分化，并提高了肌腱細胞外基質生成。Lomas 等[18]發現有序的靜電紡絲纖維增加了肌腱樣組織生成，雖然新生成的組織與天然組織相比更薄，機械性能更弱，但是支架的機械刺激促進更多有序的膠原纖維生成，大大增加了支架強度。多孔結構的靜電紡絲納米纖維補片有利于組織之間的物質交換，可以更好地促進肌腱愈合。通過力學檢測可以發現，PCL/Ⅰ型膠原補片的拉伸強度和楊氏模量均強于單純 PCL 補片，說明加入Ⅰ型膠原可以顯著提高補片的力學性能。這也證實了當紡絲纖維中加入明膠、幾丁質、膠原等材料時，靜電紡絲材料的力學性能增強[19]。紅外光譜分析結果顯示，PCL/Ⅰ型膠原補片的吸收峰與單純 PCL 補片相比發生了變化，說明Ⅰ型膠原和 PCL 成功混合，并未在紡絲過程中丟失，且兩者未發生化學反應。Qiu 等[20]發現，Ⅰ型膠原支架與機械刺激共同作用可以促進人 MSCs 向成纖維細胞分化，所以我們認為 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片比單純 PCL 補片更適合肩袖損傷的再生修復。
由于補片將被用來修復肩袖損傷，材料表面為親水性更有利于細胞黏附和增殖，所以測定其親水性十分必要[21]。Ghosal 等[22]研究發現，將膠原和 PCL 混合后材料的親水性有所提高，表面接觸角降低。本研究結果顯示，PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片的表面接觸角顯著小于單純 PCL 補片，說明Ⅰ型膠原的加入可以增加材料的親水性，更有利于細胞黏附。Kopf 等[23]提出，親水性材料表面可增加單位時間內細胞在材料表面的黏附數量，并進一步通過整合素介導細胞外基質等蛋白的黏附。本研究 CCK-8 細胞增殖與毒性實驗進一步表明兩種補片均無細胞毒性，對細胞的增殖無明顯抑制作用。細胞-補片復合物共聚焦激光掃描顯微鏡觀察結果也提示，PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片較單純 PCL 補片更容易使細胞黏附、生長。
綜上述，利用靜電紡絲技術制備的 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片可仿生天然組織的膠原纖維排列，一定程度實現了肌腱生物力學的各向異性；且 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片具有優良的理化性能，可以使細胞更好地黏附同時保持良好活性，未來可能作為肩袖修復理想的組織工程補片。但本實驗只檢測了在體外環境下 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補片的性能，尚需進一步動物實驗驗證其促進肌腱愈合的能力。
