引用本文： 翁峰標, 朱立帆, 楊立文, 李勇, 劉榮, 凡進, 周建新. B 淋巴細胞瘤-2 蛋白多位點磷酸化在大鼠脊髓損傷后細胞自噬中的表達研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(5): 618-627. doi: 10.7507/1002-1892.201812064 復制
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）屬于中樞神經功能障礙疾病，具有高并發率、致殘率的特點，嚴重影響患者日常生活，給患者家庭及社會帶來巨大的經濟負擔[1]。研究顯示自噬在大鼠 SCI 后的細胞修復中發揮重要作用，SCI 后細胞自噬水平升高，可降低神經元損傷及神經細胞凋亡率，促進大鼠運動功能恢復[2]。B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白為線粒體抗凋亡因子，主要通過轉錄后磷酸化調控蛋白抗凋亡作用。該蛋白第 70 位及第 87 位絲氨酸殘基（Ser70、Ser87）磷酸化后，可改變細胞對凋亡的敏感性，進而抑制或增強 Bcl-2 抗凋亡作用[3]。然而 Bcl-2 蛋白 Ser70、Ser87 位點磷酸化是否參與 SCI 后細胞自噬，目前尚未見報道。本研究通過制備大鼠 SCI 模型，給予自噬促進劑及抑制劑處理，以探究自噬過程對脊髓組織神經細胞凋亡的影響以及 Bcl-2 蛋白 Ser70、Ser87 位點磷酸化情況，以期為 SCI 的發生機制提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SFP 級 8 周齡雄性 SD 大鼠 52 只，體質量 220～260 g，由南京醫科大學醫藥實驗動物中心提供。飼養條件：溫度 22～25℃，自然光照，濕度 50%～60%，自由飲水、攝食。本研究嚴格遵循《實驗動物管理條例》，獲得南京醫科大學動物倫理委員會批準；實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）20160008。
3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；Sigma 公司，美國）；雷帕霉素（上海吉至生化科技有限公司）；過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；TNF-α、IL-1β ELISA 檢測試劑盒（上海滬震實業有限公司）；HE 染色試劑盒（杭州碧云天生物技術研究所）；鼠抗自噬相關蛋白（Beclin1）、微管相關蛋白輕鏈 3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）熒光一抗、RIPA 蛋白裂解液（Abcam 公司，美國）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Bcl-2 相關 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Bcl-2（Santa Cruze 公司，美國）；p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）一抗（R&D 公司，美國）；辣根過氧化物酶標記二抗、β-actin（CST 公司，美國）。熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；透射電鏡（Hitachi 公司，日本）；凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
實驗分為 4 組，分別為 SCI 組、自噬抑制劑組、自噬促進劑組以及假手術組。
1.2.1 動物模型制備
取 40 只大鼠采用改良 Allen 法[4]制備 SCI 模型。大鼠禁食（不禁水）12 h 后，腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉。于脊柱后正中作 2 cm 長切口，鈍性剝離肌肉，行椎板切除術，暴露 T11 脊髓，選用 10 g 重物 2.5 cm 高度垂直打擊損害脊髓，造成 SCI 后停留 3 min，將重物錘移除。模型制備成功標準：撞擊處脊髓組織出現水腫、充血，鼠尾來回擺動且后肢撲動，大鼠下肢呈癱瘓狀，清醒后后肢運動功能發生障礙。術后皮下注射 12 mg/（kg·d）慶大霉素，共 1 周；按摩膀胱輔助大鼠排尿，直至可以自行排尿。排除造模過程中感染、死亡大鼠，共 36 只大鼠造模成功，將其隨機分為 SCI 組、自噬抑制劑組、自噬促進劑組，每組 12 只。
另取 12 只大鼠作為假手術組，同上法麻醉后，僅切除椎板，不撞擊脊髓。
1.2.2 給藥方法
造模完成后，將各組大鼠固定于操作臺上，背部拱起，標記髂前上棘確定脊髓間隙，將微量注射器于定位點垂直進入脊髓鞘內后緩慢推進藥物，30 s 后拔針。自噬抑制劑組于鞘內注射 20 μL 600 nmol/L 3-MA[5]，自噬促進劑組注射 20 μL 25 nmol/L 雷帕霉素[6]，假手術組及 SCI 組注射 20 μL 生理鹽水。各組每天 1 次，連續注射 4 周。
末次注射 24 h 后，將各組大鼠過量麻醉處死，經原手術入路獲取受損脊髓，將部分組織置于 4% 多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋后制備切片，片厚 6 μm，用于 HE 染色、透射電鏡觀察線粒體超微結構、免疫熒光染色、TUNEL 染色檢測；部分新鮮組織用于炎性因子水平檢測；部分組織剪碎后置于–80℃ 保存，用于 Western blot 檢測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大鼠后肢運動功能評定
造模后 1 d 及 1、2、4 周，采用 BBB 評分法[7]對大鼠后肢步態、關節活動、整體協調能力進行評定。
1.3.2 脊髓組織炎性因子水平檢測
稱取脊髓組織，與生理鹽水以 1∶9 比例置于勻漿機內，超聲勻漿，制備勻漿液。按照 MPO 活性檢測試劑盒說明書操作，檢測脊髓組織中 MPO 活性。按照 ELISA 檢測試劑盒說明書操作，檢測脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平。
1.3.3 組織學觀察
各組切片常規行 HE 染色，中性樹脂封片后，于 40 倍光鏡下觀察脊髓組織形態學變化。
1.3.4 透射電鏡觀察
將各組切片置于 2% 戊二醛中固定 24 h，1% 鋨酸固定后梯度乙醇脫水、環氧樹脂包埋，制備超薄切片，片厚 100 nm；醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染后，于透射電鏡下觀察線粒體超微結構變化。
1.3.5 免疫熒光染色觀察
將各組切片置于 Triton X-100 透化 20 min，添加熒光染液室溫避光孵育 20 min，封閉后采用 Beclin1、LC3 熒光一抗（1∶500）4℃ 孵育，過夜后添加熒光二抗，室溫孵育 2 h，熒光顯微鏡下觀察 Beclin1、LC3 蛋白表達情況。Beclin1、LC3 蛋白陽性染色均呈紅色熒光，采用 Image Pro-Plus 軟件計算目的蛋白陽性率。
1.3.6 TUNEL 染色觀察
取各組切片按照 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行染色，用 Image Pro-Plus 軟件對細胞凋亡進行定量分析，按以下公式計算細胞凋亡率：陽性染色細胞數/細胞總數×100%。
1.3.7 免疫熒光雙染觀察
將各組切片以驢血清封閉 30 min。LC3 一抗孵育，加入對應二抗孵育。再按照 TUNEL 凋亡檢測試劑盒說明書進行染色，以 DAPI 染色 5 min 后封片拍照，計數陽性細胞。紅色熒光為 LC3 陽性細胞，綠色熒光為 TUNEL 陽性細胞。
1.3.8 Western blot 檢測
取各組–80℃ 保存的脊髓組織，RIPA 蛋白裂解液提取蛋白，經 10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，于聚偏二氟乙烯膜上行轉膜反應，封閉后用 Bax、Bcl-2 及 p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）一抗抗體（1∶200）4℃ 孵育過夜，清洗后加入二抗，室溫下孵育膜 1 h，ECL 曝光顯影后，采用 Quantity One 軟件評估目標蛋白表達 水平。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠后肢運動功能評定
與假手術組相比，SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組各時間點 BBB 評分均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 BBB 評分顯著降低，自噬促進劑組顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
各組造模后不同時間點 BBB 評分比較（n=12，
）
Table1.
Comparison of BBB scores at different time points after modeling between groups (n=12, 
)
2.2 脊髓組織炎性因子水平檢測
與假手術組相比，SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組上述指標水平顯著升高，自噬促進劑組顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠脊髓組織中 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平比較（n=12，
）
Table2.
Comparison of MPO activity and TNF-α and IL-1β levels in spinal cord tissue of each group (n=12, 
)
2.3 組織學觀察
假手術組脊髓組織灰、白質結構完整，灰質中神經細胞分布均勻；SCI 組神經細胞周圍間隙增大，細胞核仁模糊，細胞腫脹、出現空泡；自噬抑制劑組脊髓組織中出現大量壞死細胞，空泡增多，炎性浸潤程度增加；自噬促進劑組壞死神經細胞及空泡數量較自噬抑制劑組減少，炎性浸潤程度減輕。見圖 1。
圖1
各組 HE 染色觀察（×40）
a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure1. HE staining observation of each group (×40)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.4 透射電鏡觀察
假手術組細胞質中分散少量線粒體，未發現自噬小體；SCI 組線粒體腫脹變性，其中分散吞噬顆粒及自噬小體；自噬抑制劑組神經細胞出現少量溶酶體及單層膜包裹的自噬囊泡；自噬促進劑組自噬小體增多，細胞質固縮，細胞核核仁形態不規則。見圖 2。
圖2
各組透射電鏡觀察（×15k）
a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure2. Transmission electron microscopy observation of each group (×15k)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.5 免疫熒光染色觀測
與假手術組相比，SCI 組及自噬促進劑組 Beclin1、LC3 蛋白陽性率顯著升高，自噬抑制劑組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 Beclin1、LC3 蛋白陽性率顯著降低，自噬促進劑組顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3、4 及表 3。
表3
各組 Beclin1、LC3 蛋白陽性率比較（n=12, %, 
）
Table3.
Comparison of positive rates of Beclin1 and LC3 proteins between groups (n=12, %, 
)
圖3
免疫熒光染色檢測各組 Beclin1 蛋白表達（×100）
從左至右分別為 DAPI 染色、Beclin1 染色及二者重疊 a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure3. Immunofluorescence staining for the expressions of Beclin1 protein in each group (×100)From left to right for DAPI staining, Beclin1 staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
圖4
免疫熒光染色檢測各組 LC3 蛋白表達（×100）
從左至右分別為 DAPI 染色、LC3 染色及二者重疊 a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure4. Immunofluorescence staining for the expression of LC3 protein in each group (×100)From left to right for DAPI staining, LC3 staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.6 TUNEL 染色觀察
假手術組、SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組細胞凋亡率分別為 17.23%±3.26%、34.72%±4.54%、45.18%±5.38%、23.64%±3.13%。與假手術組相比，SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組細胞凋亡率顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組細胞凋亡率顯著升高，自噬促進劑組顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
TUNEL 染色觀察各組脊髓組織中細胞凋亡（×100）
從左至右分別為 DAPI 染色、TUNEL 染色及二者重疊 a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure5. TUNEL staining for apoptosis in spinal cord tissue of each group (×100)From left to right for DAPI staining, TUNEL staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.7 免疫熒光雙染觀察
與假手術組相比，SCI 組、自噬促進劑組 LC3、TUNEL 陽性細胞顯著增多，自噬抑制劑組 LC3 陽性細胞顯著減少、TUNEL 陽性細胞顯著增多，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 LC3 陽性細胞顯著減少、TUNEL 陽性細胞顯著增多，自噬促進劑組 LC3 陽性細胞顯著增多、TUNEL 陽性細胞顯著減少，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6 及表 4。
表4
免疫熒光雙染檢測各組 LC3/TUNEL 陽性細胞數（n=12，
）
Table4.
Immunofluorescence double staining for LC3/TUNEL positive cells count in each group (n=12, 
)
圖6
免疫熒光雙染檢測各組 LC3、TUNEL 表達（×200）
a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure6. Immunofluorescence double staining in LC3 and TUNEL expression of each group (×200)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.8 Western blot 檢測
與假手術組相比，SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低；自噬促進劑組 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達顯著降低，Bcl-2 蛋白表達顯著升高；上述組間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 7 及表 5。
表5
Western blot 檢測各組 Bax、Bcl-2、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達（n=12，
）
Table5.
Expressions of Bax, Bcl-2, p-Bcl-2 (Ser87), and p-Bcl-2 (Ser70) proteins in each group detected by Western blot (n=12, %, 
)
圖7
Western blot 檢測脊髓組織中 Bax、Bcl-2、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達
1：假手術組 2：SCI 組 3：自噬抑制劑組 4：自噬促進劑組
Figure7. Western blot analysis of Bax, Bcl-2, p-Bcl-2 (Ser87), and p-Bcl-2 (Ser70) protein expression in spinal cord1: Sham operation group 2: SCI group 3: Autophagy inhibitor group 4: Autophagy promoter group
3 討論
SCI 病理機制較復雜，為評估藥物對 SCI 的干預效果，需要首先進行動物實驗。目前實驗研究制備 SCI 動物模型的方法較多，包括脊髓撞擊（Allen 法）、供血管栓塞或結扎造成脊髓缺血、鉗夾壓迫等[8]，其中脊髓撞擊制備的 SCI 模型與臨床 SCI 病理過程相似，穩定性好，可信度高，是基礎研究常用 SCI 模型制備方法[9]。本研究采用脊髓撞擊法制備 SCI 大鼠模型，結果顯示，與假手術組相比，SCI 組大鼠 BBB 評分顯著降低，運動功能出現障礙；神經細胞周圍間隙增大，細胞核仁模糊，細胞腫脹、出現空泡，與 SCI 后脊髓損傷特征相符[7]，提示 SCI 大鼠模型制備成功。
炎性反應是引發脊髓組織損傷的重要原因，神經細胞損傷后能夠釋放大量炎性因子（如 TNF-α、IL-1β），進一步促進炎性細胞遷移，導致復雜炎癥級聯反應，造成組織損傷[10]。中性粒細胞是 SCI 發生后發揮主要作用的炎性細胞，研究顯示抑制中性粒細胞活化后，能夠減輕脊髓功能損傷程度，進而降低神經功能損傷[11]。本研究顯示與假手術組相比，SCI 組脊髓組織中 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平升高，提示炎性因子參與 SCI 的發生。
近年來，研究發現自噬現象廣泛存在于神經疾病，如腦卒中、腦外傷及神經退行性疾病。一般情況下細胞自噬水平較低，適量自噬可促進細胞生存，當細胞受損后，自噬被激活參與損傷細胞及組織，進而影響神經疾病生理過程[12]。自噬體是判定細胞是否出現自噬的主要診斷標志物，腦損傷及 SCI 后均可在受損組織神經細胞中發現自噬小體及自噬泡的形成，表明組織損傷后能夠激活自噬[13-14]。本研究透射電鏡觀察發現，SCI 組出現吞噬顆粒及自噬小體，而自噬抑制劑組出現少量溶酶體及單層膜包裹的自噬囊泡，自噬促進劑組出現大量自噬小體，提示 SCI 后存在自噬，而進一步激活自噬后可顯著增加自噬小體數量。LC3 蛋白是目前檢測自噬活性的重要標志物，主要定位于自噬體膜上，當受到外界刺激后，LC3 在 Agt4 的催化下發生泛素化形成 LC3-Ⅰ，隨后與磷脂酰乙醇胺偶聯形成 LC3-Ⅱ，穩定存在于內膜上，因此 LC3 水平可反映自噬程度[15]。Beclin1 是哺乳動物參與自噬的特異基因之一，主要與 PI3K 結合為復合體調控自噬蛋白在自噬小體的位置，進而調控細胞自噬活性，當細胞發生自噬后，其水平迅速升高，可反映細胞自噬程度[16]。本研究發現 SCI 組脊髓組織中 LC3、Beclin1 蛋白陽性率較假手術組顯著升高；與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 LC3、Beclin1 蛋白陽性率明顯降低，而自噬促進劑組顯著升高；進一步提示自噬參與 SCI 的發生。
SCI 發生后可引發神經細胞凋亡，然而自噬與凋亡同時存在，兩者具體關系目前尚無定論。部分學者認為自噬可誘導或加速細胞凋亡[17]；也有學者認為自噬可通過吞噬受損線粒體，減少細胞凋亡，進而保護細胞[18]。本研究發現 SCI 組脊髓組織神經細胞凋亡率較假手術組顯著升高。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組大鼠 BBB 評分降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2 蛋白表達降低，Bax 蛋白表達升高；而自噬促進劑大鼠組 BBB 評分升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2 蛋白表達升高，Bax 蛋白表達降低。LC3/TUNEL 免疫熒光雙染得到與 LC3、TUNEL 免疫熒光檢測細胞凋亡類似的結果。上述結果提示 SCI 后可激活細胞自噬，能夠抑制神經細胞凋亡，進而促進神經功能恢復。
Bcl-2 轉錄后磷酸化水平對于蛋白發揮抗凋亡作用十分重要，既往研究顯示當使用促凋亡劑處理細胞后，能使 Bcl-2 的 Ser 87、Ser 757 位點發生磷酸化，抑制 Bcl-2 轉錄水平，進而抑制抗凋亡作用，使細胞凋亡率升高[19-20]。體外研究發現，通過誘導心肌細胞中 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 及 T69 位點發生磷酸化，進而導致 Bax 解離，加速心肌細胞的凋亡[21]。以上研究提示 Bcl-2磷酸化水平升高影響細胞的抗凋亡作用，本研究結果顯示，與 SCI 組相比，自噬抑制劑組經 3-MA 處理后細胞凋亡率升高，p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低，而自噬促進組結果與之相反。提示 SCI 后自噬水平升高，可能通過下調 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 位點磷酸化水平，進而增強抗凋亡作用，抑制脊髓組織神經細胞凋亡。
綜上述，大鼠 SCI 后誘導自噬可降低神經細胞凋亡，保護脊髓功能，其機制可能與抑制 BCL-2 蛋白多位點磷酸化有關。本研究尚未就自噬抑制劑和自噬促進劑對假手術大鼠的影響進行觀察，僅研究了自噬水平對 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 位點磷酸化的影響，對于 Bcl-2 蛋白其他位點磷酸化的作用有待后續深入研究。
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）屬于中樞神經功能障礙疾病，具有高并發率、致殘率的特點，嚴重影響患者日常生活，給患者家庭及社會帶來巨大的經濟負擔[1]。研究顯示自噬在大鼠 SCI 后的細胞修復中發揮重要作用，SCI 后細胞自噬水平升高，可降低神經元損傷及神經細胞凋亡率，促進大鼠運動功能恢復[2]。B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白為線粒體抗凋亡因子，主要通過轉錄后磷酸化調控蛋白抗凋亡作用。該蛋白第 70 位及第 87 位絲氨酸殘基（Ser70、Ser87）磷酸化后，可改變細胞對凋亡的敏感性，進而抑制或增強 Bcl-2 抗凋亡作用[3]。然而 Bcl-2 蛋白 Ser70、Ser87 位點磷酸化是否參與 SCI 后細胞自噬，目前尚未見報道。本研究通過制備大鼠 SCI 模型，給予自噬促進劑及抑制劑處理，以探究自噬過程對脊髓組織神經細胞凋亡的影響以及 Bcl-2 蛋白 Ser70、Ser87 位點磷酸化情況，以期為 SCI 的發生機制提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SFP 級 8 周齡雄性 SD 大鼠 52 只，體質量 220～260 g，由南京醫科大學醫藥實驗動物中心提供。飼養條件：溫度 22～25℃，自然光照，濕度 50%～60%，自由飲水、攝食。本研究嚴格遵循《實驗動物管理條例》，獲得南京醫科大學動物倫理委員會批準；實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）20160008。
3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；Sigma 公司，美國）；雷帕霉素（上海吉至生化科技有限公司）；過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；TNF-α、IL-1β ELISA 檢測試劑盒（上海滬震實業有限公司）；HE 染色試劑盒（杭州碧云天生物技術研究所）；鼠抗自噬相關蛋白（Beclin1）、微管相關蛋白輕鏈 3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）熒光一抗、RIPA 蛋白裂解液（Abcam 公司，美國）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Bcl-2 相關 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Bcl-2（Santa Cruze 公司，美國）；p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）一抗（R&D 公司，美國）；辣根過氧化物酶標記二抗、β-actin（CST 公司，美國）。熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；透射電鏡（Hitachi 公司，日本）；凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
實驗分為 4 組，分別為 SCI 組、自噬抑制劑組、自噬促進劑組以及假手術組。
1.2.1 動物模型制備
取 40 只大鼠采用改良 Allen 法[4]制備 SCI 模型。大鼠禁食（不禁水）12 h 后，腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉。于脊柱后正中作 2 cm 長切口，鈍性剝離肌肉，行椎板切除術，暴露 T11 脊髓，選用 10 g 重物 2.5 cm 高度垂直打擊損害脊髓，造成 SCI 后停留 3 min，將重物錘移除。模型制備成功標準：撞擊處脊髓組織出現水腫、充血，鼠尾來回擺動且后肢撲動，大鼠下肢呈癱瘓狀，清醒后后肢運動功能發生障礙。術后皮下注射 12 mg/（kg·d）慶大霉素，共 1 周；按摩膀胱輔助大鼠排尿，直至可以自行排尿。排除造模過程中感染、死亡大鼠，共 36 只大鼠造模成功，將其隨機分為 SCI 組、自噬抑制劑組、自噬促進劑組，每組 12 只。
另取 12 只大鼠作為假手術組，同上法麻醉后，僅切除椎板，不撞擊脊髓。
1.2.2 給藥方法
造模完成后，將各組大鼠固定于操作臺上，背部拱起，標記髂前上棘確定脊髓間隙，將微量注射器于定位點垂直進入脊髓鞘內后緩慢推進藥物，30 s 后拔針。自噬抑制劑組于鞘內注射 20 μL 600 nmol/L 3-MA[5]，自噬促進劑組注射 20 μL 25 nmol/L 雷帕霉素[6]，假手術組及 SCI 組注射 20 μL 生理鹽水。各組每天 1 次，連續注射 4 周。
末次注射 24 h 后，將各組大鼠過量麻醉處死，經原手術入路獲取受損脊髓，將部分組織置于 4% 多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋后制備切片，片厚 6 μm，用于 HE 染色、透射電鏡觀察線粒體超微結構、免疫熒光染色、TUNEL 染色檢測；部分新鮮組織用于炎性因子水平檢測；部分組織剪碎后置于–80℃ 保存，用于 Western blot 檢測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大鼠后肢運動功能評定
造模后 1 d 及 1、2、4 周，采用 BBB 評分法[7]對大鼠后肢步態、關節活動、整體協調能力進行評定。
1.3.2 脊髓組織炎性因子水平檢測
稱取脊髓組織，與生理鹽水以 1∶9 比例置于勻漿機內，超聲勻漿，制備勻漿液。按照 MPO 活性檢測試劑盒說明書操作，檢測脊髓組織中 MPO 活性。按照 ELISA 檢測試劑盒說明書操作，檢測脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平。
1.3.3 組織學觀察
各組切片常規行 HE 染色，中性樹脂封片后，于 40 倍光鏡下觀察脊髓組織形態學變化。
1.3.4 透射電鏡觀察
將各組切片置于 2% 戊二醛中固定 24 h，1% 鋨酸固定后梯度乙醇脫水、環氧樹脂包埋，制備超薄切片，片厚 100 nm；醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染后，于透射電鏡下觀察線粒體超微結構變化。
1.3.5 免疫熒光染色觀察
將各組切片置于 Triton X-100 透化 20 min，添加熒光染液室溫避光孵育 20 min，封閉后采用 Beclin1、LC3 熒光一抗（1∶500）4℃ 孵育，過夜后添加熒光二抗，室溫孵育 2 h，熒光顯微鏡下觀察 Beclin1、LC3 蛋白表達情況。Beclin1、LC3 蛋白陽性染色均呈紅色熒光，采用 Image Pro-Plus 軟件計算目的蛋白陽性率。
1.3.6 TUNEL 染色觀察
取各組切片按照 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行染色，用 Image Pro-Plus 軟件對細胞凋亡進行定量分析，按以下公式計算細胞凋亡率：陽性染色細胞數/細胞總數×100%。
1.3.7 免疫熒光雙染觀察
將各組切片以驢血清封閉 30 min。LC3 一抗孵育，加入對應二抗孵育。再按照 TUNEL 凋亡檢測試劑盒說明書進行染色，以 DAPI 染色 5 min 后封片拍照，計數陽性細胞。紅色熒光為 LC3 陽性細胞，綠色熒光為 TUNEL 陽性細胞。
1.3.8 Western blot 檢測
取各組–80℃ 保存的脊髓組織，RIPA 蛋白裂解液提取蛋白，經 10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，于聚偏二氟乙烯膜上行轉膜反應，封閉后用 Bax、Bcl-2 及 p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）一抗抗體（1∶200）4℃ 孵育過夜，清洗后加入二抗，室溫下孵育膜 1 h，ECL 曝光顯影后，采用 Quantity One 軟件評估目標蛋白表達 水平。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠后肢運動功能評定
與假手術組相比，SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組各時間點 BBB 評分均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 BBB 評分顯著降低，自噬促進劑組顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
各組造模后不同時間點 BBB 評分比較（n=12，）
Table1.
Comparison of BBB scores at different time points after modeling between groups (n=12, )
2.2 脊髓組織炎性因子水平檢測
與假手術組相比，SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組上述指標水平顯著升高，自噬促進劑組顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠脊髓組織中 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平比較（n=12，）
Table2.
Comparison of MPO activity and TNF-α and IL-1β levels in spinal cord tissue of each group (n=12, )
2.3 組織學觀察
假手術組脊髓組織灰、白質結構完整，灰質中神經細胞分布均勻；SCI 組神經細胞周圍間隙增大，細胞核仁模糊，細胞腫脹、出現空泡；自噬抑制劑組脊髓組織中出現大量壞死細胞，空泡增多，炎性浸潤程度增加；自噬促進劑組壞死神經細胞及空泡數量較自噬抑制劑組減少，炎性浸潤程度減輕。見圖 1。
圖1
各組 HE 染色觀察（×40）
a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure1. HE staining observation of each group (×40)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.4 透射電鏡觀察
假手術組細胞質中分散少量線粒體，未發現自噬小體；SCI 組線粒體腫脹變性，其中分散吞噬顆粒及自噬小體；自噬抑制劑組神經細胞出現少量溶酶體及單層膜包裹的自噬囊泡；自噬促進劑組自噬小體增多，細胞質固縮，細胞核核仁形態不規則。見圖 2。
圖2
各組透射電鏡觀察（×15k）
a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure2. Transmission electron microscopy observation of each group (×15k)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.5 免疫熒光染色觀測
與假手術組相比，SCI 組及自噬促進劑組 Beclin1、LC3 蛋白陽性率顯著升高，自噬抑制劑組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 Beclin1、LC3 蛋白陽性率顯著降低，自噬促進劑組顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3、4 及表 3。
表3
各組 Beclin1、LC3 蛋白陽性率比較（n=12, %, ）
Table3.
Comparison of positive rates of Beclin1 and LC3 proteins between groups (n=12, %, )
圖3
免疫熒光染色檢測各組 Beclin1 蛋白表達（×100）
從左至右分別為 DAPI 染色、Beclin1 染色及二者重疊 a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure3. Immunofluorescence staining for the expressions of Beclin1 protein in each group (×100)From left to right for DAPI staining, Beclin1 staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
圖4
免疫熒光染色檢測各組 LC3 蛋白表達（×100）
從左至右分別為 DAPI 染色、LC3 染色及二者重疊 a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure4. Immunofluorescence staining for the expression of LC3 protein in each group (×100)From left to right for DAPI staining, LC3 staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.6 TUNEL 染色觀察
假手術組、SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組細胞凋亡率分別為 17.23%±3.26%、34.72%±4.54%、45.18%±5.38%、23.64%±3.13%。與假手術組相比，SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組細胞凋亡率顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組細胞凋亡率顯著升高，自噬促進劑組顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
TUNEL 染色觀察各組脊髓組織中細胞凋亡（×100）
從左至右分別為 DAPI 染色、TUNEL 染色及二者重疊 a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure5. TUNEL staining for apoptosis in spinal cord tissue of each group (×100)From left to right for DAPI staining, TUNEL staining, and merge, respectively a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.7 免疫熒光雙染觀察
與假手術組相比，SCI 組、自噬促進劑組 LC3、TUNEL 陽性細胞顯著增多，自噬抑制劑組 LC3 陽性細胞顯著減少、TUNEL 陽性細胞顯著增多，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 LC3 陽性細胞顯著減少、TUNEL 陽性細胞顯著增多，自噬促進劑組 LC3 陽性細胞顯著增多、TUNEL 陽性細胞顯著減少，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6 及表 4。
表4
免疫熒光雙染檢測各組 LC3/TUNEL 陽性細胞數（n=12，）
Table4.
Immunofluorescence double staining for LC3/TUNEL positive cells count in each group (n=12, )
圖6
免疫熒光雙染檢測各組 LC3、TUNEL 表達（×200）
a. 假手術組；b. SCI 組；c. 自噬抑制劑組；d. 自噬促進劑組
Figure6. Immunofluorescence double staining in LC3 and TUNEL expression of each group (×200)a. Sham operation group; b. SCI group; c. Autophagy inhibitor group; d. Autophagy promoter group
2.8 Western blot 檢測
與假手術組相比，SCI 組、自噬抑制劑組及自噬促進劑組 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低；自噬促進劑組 Bax、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達顯著降低，Bcl-2 蛋白表達顯著升高；上述組間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 7 及表 5。
表5
Western blot 檢測各組 Bax、Bcl-2、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達（n=12，）
Table5.
Expressions of Bax, Bcl-2, p-Bcl-2 (Ser87), and p-Bcl-2 (Ser70) proteins in each group detected by Western blot (n=12, %, )
圖7
Western blot 檢測脊髓組織中 Bax、Bcl-2、p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達
1：假手術組 2：SCI 組 3：自噬抑制劑組 4：自噬促進劑組
Figure7. Western blot analysis of Bax, Bcl-2, p-Bcl-2 (Ser87), and p-Bcl-2 (Ser70) protein expression in spinal cord1: Sham operation group 2: SCI group 3: Autophagy inhibitor group 4: Autophagy promoter group
3 討論
SCI 病理機制較復雜，為評估藥物對 SCI 的干預效果，需要首先進行動物實驗。目前實驗研究制備 SCI 動物模型的方法較多，包括脊髓撞擊（Allen 法）、供血管栓塞或結扎造成脊髓缺血、鉗夾壓迫等[8]，其中脊髓撞擊制備的 SCI 模型與臨床 SCI 病理過程相似，穩定性好，可信度高，是基礎研究常用 SCI 模型制備方法[9]。本研究采用脊髓撞擊法制備 SCI 大鼠模型，結果顯示，與假手術組相比，SCI 組大鼠 BBB 評分顯著降低，運動功能出現障礙；神經細胞周圍間隙增大，細胞核仁模糊，細胞腫脹、出現空泡，與 SCI 后脊髓損傷特征相符[7]，提示 SCI 大鼠模型制備成功。
炎性反應是引發脊髓組織損傷的重要原因，神經細胞損傷后能夠釋放大量炎性因子（如 TNF-α、IL-1β），進一步促進炎性細胞遷移，導致復雜炎癥級聯反應，造成組織損傷[10]。中性粒細胞是 SCI 發生后發揮主要作用的炎性細胞，研究顯示抑制中性粒細胞活化后，能夠減輕脊髓功能損傷程度，進而降低神經功能損傷[11]。本研究顯示與假手術組相比，SCI 組脊髓組織中 MPO 活性及 TNF-α、IL-1β 水平升高，提示炎性因子參與 SCI 的發生。
近年來，研究發現自噬現象廣泛存在于神經疾病，如腦卒中、腦外傷及神經退行性疾病。一般情況下細胞自噬水平較低，適量自噬可促進細胞生存，當細胞受損后，自噬被激活參與損傷細胞及組織，進而影響神經疾病生理過程[12]。自噬體是判定細胞是否出現自噬的主要診斷標志物，腦損傷及 SCI 后均可在受損組織神經細胞中發現自噬小體及自噬泡的形成，表明組織損傷后能夠激活自噬[13-14]。本研究透射電鏡觀察發現，SCI 組出現吞噬顆粒及自噬小體，而自噬抑制劑組出現少量溶酶體及單層膜包裹的自噬囊泡，自噬促進劑組出現大量自噬小體，提示 SCI 后存在自噬，而進一步激活自噬后可顯著增加自噬小體數量。LC3 蛋白是目前檢測自噬活性的重要標志物，主要定位于自噬體膜上，當受到外界刺激后，LC3 在 Agt4 的催化下發生泛素化形成 LC3-Ⅰ，隨后與磷脂酰乙醇胺偶聯形成 LC3-Ⅱ，穩定存在于內膜上，因此 LC3 水平可反映自噬程度[15]。Beclin1 是哺乳動物參與自噬的特異基因之一，主要與 PI3K 結合為復合體調控自噬蛋白在自噬小體的位置，進而調控細胞自噬活性，當細胞發生自噬后，其水平迅速升高，可反映細胞自噬程度[16]。本研究發現 SCI 組脊髓組織中 LC3、Beclin1 蛋白陽性率較假手術組顯著升高；與 SCI 組相比，自噬抑制劑組 LC3、Beclin1 蛋白陽性率明顯降低，而自噬促進劑組顯著升高；進一步提示自噬參與 SCI 的發生。
SCI 發生后可引發神經細胞凋亡，然而自噬與凋亡同時存在，兩者具體關系目前尚無定論。部分學者認為自噬可誘導或加速細胞凋亡[17]；也有學者認為自噬可通過吞噬受損線粒體，減少細胞凋亡，進而保護細胞[18]。本研究發現 SCI 組脊髓組織神經細胞凋亡率較假手術組顯著升高。與 SCI 組相比，自噬抑制劑組大鼠 BBB 評分降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2 蛋白表達降低，Bax 蛋白表達升高；而自噬促進劑大鼠組 BBB 評分升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2 蛋白表達升高，Bax 蛋白表達降低。LC3/TUNEL 免疫熒光雙染得到與 LC3、TUNEL 免疫熒光檢測細胞凋亡類似的結果。上述結果提示 SCI 后可激活細胞自噬，能夠抑制神經細胞凋亡，進而促進神經功能恢復。
Bcl-2 轉錄后磷酸化水平對于蛋白發揮抗凋亡作用十分重要，既往研究顯示當使用促凋亡劑處理細胞后，能使 Bcl-2 的 Ser 87、Ser 757 位點發生磷酸化，抑制 Bcl-2 轉錄水平，進而抑制抗凋亡作用，使細胞凋亡率升高[19-20]。體外研究發現，通過誘導心肌細胞中 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 及 T69 位點發生磷酸化，進而導致 Bax 解離，加速心肌細胞的凋亡[21]。以上研究提示 Bcl-2磷酸化水平升高影響細胞的抗凋亡作用，本研究結果顯示，與 SCI 組相比，自噬抑制劑組經 3-MA 處理后細胞凋亡率升高，p-Bcl-2（Ser87）、p-Bcl-2（Ser70）蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低，而自噬促進組結果與之相反。提示 SCI 后自噬水平升高，可能通過下調 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 位點磷酸化水平，進而增強抗凋亡作用，抑制脊髓組織神經細胞凋亡。
綜上述，大鼠 SCI 后誘導自噬可降低神經細胞凋亡，保護脊髓功能，其機制可能與抑制 BCL-2 蛋白多位點磷酸化有關。本研究尚未就自噬抑制劑和自噬促進劑對假手術大鼠的影響進行觀察，僅研究了自噬水平對 Bcl-2 蛋白 Ser 87、Ser 70 位點磷酸化的影響，對于 Bcl-2 蛋白其他位點磷酸化的作用有待后續深入研究。
