目的 研究過氧化氫對 A549 細胞表達轉化生長因子 β1 （ TGF-β1 ）和 Smad3 磷酸化的影響。方法 用過氧化氫建立體外A549細胞損傷模型，MTT法檢測過氧化氫對A549細胞增殖活性的影響，免疫印跡法（Western Blotting）觀察過氧化氫作用不同時間后A549細胞TGF-β1和Smad 3磷酸化的表達。結果 過氧化氫明顯抑制A549細胞的增殖，濃度為1.0 mmol/L時，其對A549細胞增殖的抑制率為46.34%；A549細胞在過氧化氫（1.0 mmol/L）的刺激下，TGF-β1和Smad3磷酸化的表達量逐漸升高，24 h時達到高峰, 48 h下降。結論 氧化損傷早期，A549細胞表達TGF-β1和Smad3磷酸化增加,這可能與肺損傷后依賴Smad3的組織修復有關。
【摘 要】 目的 對近年TGF-β1/Smad3信號轉導通路與創傷后瘢痕形成的相關研究作一綜述。 方法 廣泛查閱國內外近年有關TGF-β1/Smad3信號轉導通路及與創傷后瘢痕形成的文獻，并進行綜述。 結果 TGF-β1是纖維化疾病的重要影響因子，通過TGF-β1/Smad3信號通路轉導產生其生物學效應。該途徑受多種因子調控并在細胞及分子水平與其他信號通路串話。該途徑參與創傷后早期炎性反應、創面愈合及后期病理性瘢痕的形成。在分子水平干預轉導途徑的各個環節，可以影響纖維化及細胞外基質沉著的進程。 結論 TGF-β1/Smad3信號轉導途徑是影響創傷后瘢痕形成及細胞外基質沉著的重要途徑。對該途徑進行深入研究，可為臨床促進創面的愈合及病理性瘢痕的防治奠定理論基礎。
目的 研究積雪草苷對增生性瘢痕成纖維細胞增殖及對Smad信號通路的影響。 方法 采用組織塊法培養人瘢痕成纖維細胞，將成纖維細胞分為用與不用積雪草苷兩組(實驗組和對照組)，48小時后采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）觀察Smad2及Smad7 mRNA表達量的改變。應用流式細胞儀分析、免疫細胞化學及蛋白印跡（Western blot）技術結合光密度掃描分析，觀察積雪草苷對瘢痕成纖維細胞周期及磷酸化Smad2和Smad7的改變。結果實驗組可見瘢痕中成纖維細胞從S期進入M期細胞減少，受到抑制；成纖維細胞中Smad2的含量及Smad2 mRNA的表達實驗組較對照組改變不明顯，但Smad7的含量及Smad7 mRNA的表達實驗組與對照組分別為(1.33±1.26)%、(50.80±22.40)%及(9.15±3.36)%、(32.18±17.84)%，二者兩組差異均有統計學意義(P＜0.05) 。結論 積雪草苷抑制瘢痕的作用是通過Smad通路，使成纖維細胞增殖受阻而發揮作用的。
目的綜述有關骨形態發生蛋白(BMPs)誘導成骨的信號傳導機制,深入了解BMPs基礎及應用研究的理論依據. 方法查閱近期相關文獻,了解BMPs相關蛋白(Smads)及其相關轉錄因子在BMPs誘導成骨的信號傳導中的作用. 結果 BMPs的信號傳導過程是:BMPs首先與Ⅱ型受體和Ⅰ型受體結合,Ⅰ型受體磷酸化Smads,Smads進入核內與轉錄因子相互作用影響相關蛋白的轉錄.Smads可分為受體調節Smads(R-Smads:Smad1、2、3、5、8和9)、共同介導者Smad(Co-Smad:Smad4)和抑制性Smads (I-Smads:Smad6、7).Smad1、Smad5和Smad8,可能還有Smad9涉及BMPs的信號傳導.多種激酶如局部粘連激酶(FAK)、Ras-細胞外信號調節激酶(ERK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和Akt絲/蘇氨酸激酶與Smads的信號傳導有關.與Smad1和Smad5相關的轉錄因子有核心結合蛋白A1(CBFA1)、Smad相互作用蛋白1(SIP1)、鳥氨酸脫羧酶拮抗酶(OAZ)、激活蛋白-1(AP-1)、蟾蜍腹側形成同源框蛋白-2(Xvent-2)、生長抑素(Ski)、抗增殖蛋白(Tob)、同源結構域轉錄因子-8(Hoxc-8)等.CBFA1與轉化生長因子-β和BMP-2信號傳導有關,能與Smad1、2、3、5相互作用,在骨形成中起重要作用.鎖骨、顱骨發育不良被認為是CBFA1的雜合型突變引起的.CBFA1基因敲除的小鼠缺乏膜內和軟骨內成骨,軟骨的成熟及分化也受到了嚴重干擾. 結論 Smads及其相關轉錄因子尤其是Smad1、5、8和CBFA1在BMPs誘導成骨的信號傳導中起重要作用.
目的 觀察囊素五肽( BP5) 對轉化生長因子β1 ( TGF-β1 ) 刺激的人肺成纖維細胞分泌的細胞外基質以及對轉化生長-β1 /Smad 信號通路的影響, 探討囊素五肽抗肺纖維化的機制。方法 HLF細胞分為陰性對照組、TGF-β1 刺激組、TGF-β1 + BP5 藥物干預組( 三組均用TGF-β1 刺激后分別使用不同濃度BP5 2. 5、5 及10 μg/ mL 進行干預) 。免疫熒光法測定細胞α平滑肌肌動蛋白( α-SMA) 的表達, Western blot 方法檢測collagen-Ⅰ、p-Smad2/3、p-Smad3 和Smad7 蛋白的表達。結果 TGF-β1 刺激細胞經免疫熒光標記顯示α-SMA 陽性表達, 說明人肺成纖維細胞在TGF-β1 刺激下轉化為肌成纖維細胞( MF) , TGF-β1 刺激同時加BP5 不同藥物濃度組中, 10 μg/ mL 的BP5 藥物濃度能顯著減少細胞增殖轉化。經TGF-β1 刺激后, 人肺成纖維細胞collagen-Ⅰ[ ( 1. 402 ±0. 158) 比( 0. 605 ±0. 367) ] 、p-Smad2/3[ ( 1. 457 ±0. 111) 比( 0. 815 ±0. 039) ] 、p-Smad3[ ( 1. 320 ± 0. 147) 比( 0. 623±0. 128) ] 蛋白表達較刺激前表達明顯增多( P lt;0. 01 ) , Smad7 表達較對照組降低[ ( 0. 613 ±0. 107)比( 0. 865 ±0. 063) , P lt;0. 05) ] ; 與TGF-β1 處理組相比, BP5 可抑制由TGF-β1 刺激人肺成纖維細胞引起的collagen-Ⅰ 蛋白[ ( 0. 718 ±0. 049) 比( 1. 402 ±0. 158 ) ] 、p-Smad2 /3[ ( 0. 696 ±0. 031) 比( 1. 457 ±0. 111 ) ] p-Smad3[ ( 0. 766 ±0. 006) 比( 1. 320 ±0. 147 ) ] 表達上調( P 均lt; 0. 01) , 而Smad7的蛋白表達明顯增加[ ( 1. 237 ±0. 173) 比( 0. 614 ±0. 107) , P lt; 0. 05] 。結論 BP5 可能通過抑制TGF-β1 /Smads 信號通路激活, 下調TGF-β1 刺激下人肺成纖維細胞的collagen-I 及α-SMA 蛋白的表達, 提示BP5 可能對肺纖維化具有一定的干預作用。
轉移生長因子-β1(TGF-β1)/Smad3信號轉導通路與人類的多種生理病理發生機制相關,但是該信號通路中Smad3被磷酸化的時空信息仍然不完全清楚。為了動態觀察活細胞生理狀態下Smad3被磷酸化的過程,首先進行ECFP-Smad3-Citrine(Smad3 biosensor)融合蛋白表達載體的構建及鑒定;然后轉染293T細胞并觀察轉染效率和融合蛋白表達情況。在熒光顯微鏡下,應用MetaFlour FRET 4.6軟件測量TGF-β1刺激293T細胞前后Smad3 biosensor的熒光能量共振轉移(FRET)的變化情況。結果顯示,Smad3 biosensor轉染效率達40%,融合蛋白表達成功。TGF-β1刺激293T細胞10 min后,監測到胞質內FRET值逐漸減小,青色熒光蛋白(CFP)減弱,黃色熒光蛋白變體(Citrine)增強,歷時約300 s后逐漸恢復。應用FRET技術能使我們在活細胞生理狀態下,實時動態監測TGF-β1/Smad3信號轉導通路的過程。
目的探討柚皮素對人肺成纖維細胞生成血管內皮生長因子(VEGF)的影響,并研究其可能的機制。 方法培養人胚肺成纖維細胞,分為對照組、香煙提取物(CSE)組和柚皮素干預組。柚皮素干預組分別與低、中、高劑量的柚皮素共孵育2 h后,與CSE組一起加入CSE,調整終濃度柚皮素5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L,CSE終濃度5%。培養24、48及72 h后,ELISA法測定各組VEGF含量,采用Western blot法觀察各組Smad3及磷酸化Smad3(p-Smad3)的表達情況。 結果在人胚肺成纖維細胞中,柚皮素能抑制CSE誘導的血管內皮生長因子生成。CSE能顯著提高p-Smad3水平,而添加了柚皮素后p-Smad3明顯減少,并隨柚皮素劑量的增加而p-Smad3水平愈低。 結論柚皮素能夠抑制Smad3的磷酸化,從而抑制CSE誘導的血管內皮生長因子的分泌。
目的探討miR-93-5p是否通過靶向調控其預測靶基因Smad5的表達，從而抑制小鼠MSCsC3H10T1/2細胞的成骨分化。 方法構建Smad5 3'-UTR-熒光素酶報告載體（pmiR-RB-REPORTTM），通過雙熒光素酶報告基因檢測，觀察miR-93-5p對Smad5 3'-UTR熒光素酶活性的影響，鑒定Smad5是否為miR-93-5p的靶基因。將miR-93-5p mimics（M組）與miR-93-5p inhibitor（In組）及其對應的陰性對照組miR-93-5p mimics陰性對照（MC組）與miR-93-5p inhibitor陰性對照（InC組）分別轉染至C3H10T1/2細胞中，并進行成骨誘導培養，48 h后分別采用實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）及Western blot檢測各組細胞Smad5在mRNA及蛋白水平的相對表達量；14 d后通過茜素紅染色檢測各組細胞外鈣鹽的沉積情況，了解miR-93-5p對C3H10T1/2細胞成骨分化的調控效應。 結果雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miR-93-5p能與Smad5 mRNA3'-UTR特異性結合，抑制其熒光素酶活性（P＜0.05）。qRT-PCR檢測示，M組及In組Smad5的mRNA相對表達量與對應陰性對照組MC組及InC組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；Western blot檢測示，M組及In組Smad5蛋白相對表達量與對應陰性對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），其中M組較MC組表達量下調，而In組則較InC組表達量上調。茜素紅染色示，M組鈣鹽沉積較MC組明顯減少，而In組則較InC組鈣鹽沉積明顯增多。 結論Smad5是miR-93-5p的靶基因，miR-93-5p可通過靶向調控Smad5的表達，抑制小鼠C3H10T1/2細胞成骨分化。
目的探討miRNA219-5P（miR219-5P）調控Smad4在TGF-β1誘導人肌腱成纖維細胞（tendonderived fibroblasts，TDFs）纖維化過程中的作用。 方法取患者自愿捐贈的肌腱組織分離培養TDFs，取第3代細胞進行實驗。化學合成miR219-5P類似物（mimics）、阻遏物（inhibitor）及陰性對照序列，分別轉染TDFs 48 h后，采用實時定量PCR及Western blot法分別檢測miR219-5P基因及Smad4蛋白表達情況；以正常細胞作為空白對照。信息學軟件預測miR219-5P與Smad4基因3’UTR區結合位點，構建Smad4預測基因3’UTR-PGL3重組質粒，構建野生型及突變型報告基因表達載體，并通過熒光素酶報告基因實驗進行靶位驗證。取正常及轉染后TDFs，采用TGF-β1誘導細胞發生纖維化，于培養24、48、72 h采用細胞計數試劑盒8法檢測細胞增殖活性變化，72 h時采用Western blot法檢測纖維化相關蛋白指標。 結果miR219-5P mimics轉染TDFs可明顯上調miR219-5P表達、下調Smad4蛋白表達，而miR219-5P inhibitor抑制細胞內miR219-5P表達、增加Smad4蛋白表達，與空白對照組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。熒光素酶實驗顯示，與pGL3-WT-Smad4轉染組比較，pGL3-WT-Smad4+mimics轉染組細胞內熒光素酶活性降低、pGL3-WT-Smad4+inhibitor轉染組活性增強（P<0.05）；而pGL3-MT-Smad4+mimics轉染組、pGL3-MT-Smad4+inhibitor轉染組組間比較無明顯變化（P>0.05）。與空白對照組比較，TGF-β1誘導培養72 h后細胞增殖活性明顯增強（P<0.01），同時上調細胞纖維化相關蛋白指標的表達（P<0.01）；與直接誘導組比較，miR219-5P過表達且誘導組TDFs細胞增殖活性和纖維化蛋白指標升高趨勢得到抑制，而miR219-5P表達抑制且誘導組細胞增殖活性和纖維化蛋白指標則進一步增強，差異有統計學意義（P<0.01）。 結論miR219-5P可通過抑制其靶基因Smad4表達，顯著抑制TGF-β1誘導TDFs纖維化。
目的觀察瘢痕疙瘩成纖維細胞（keloid fibroblasts，KFb）轉染Smad7過表達載體后，對細胞內Smad7、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因、蛋白表達和細胞增殖的影響，探討Smad7蛋白對瘢痕疙瘩生長有無抑制作用。 方法收集10例20～25歲男性瘢痕疙瘩患者（排除其他疾病）手術切下的瘢痕疙瘩組織，體外無菌條件下培養KFb后分為3組，A組為未轉染組；B組為空載體pcDNA3.1（-）轉染細胞組；C組為Smad7基因過表達載體pcDNA3.1（-）-smad7轉染細胞組。轉染48 h后行實時熒光定量PCR和Western blot法檢測各組細胞內Smad7、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因轉錄和蛋白表達水平，轉染24 h后MTT法檢測各組細胞增殖能力。 結果C組Smad7 mRNA和蛋白相對表達量顯著高于A、B組，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白相對表達量顯著低于A、B組，差異均有統計學意義（P < 0.01）；B組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA相對表達量高于A組（P < 0.01），Smad7、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白相對表達量低于A組（P < 0.01）。MTT檢測示，培養各時間點C組細胞增殖能力均小于A、B組（P < 0.05），A、B組間差異均無統計學意義（P>0.05）。 結論轉染Smad7基因過表達載體能抑制KFbⅠ型膠原、Ⅲ型膠原基因的表達和細胞增殖能力。