引用本文： 阮洪江, 范大鵬, 陳帥, 李旭軍, 范存義. miRNA219-5P靶向調控Smad4表達影響TGF-β1誘導肌腱成纖維細胞纖維化的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(5): 641-646. doi: 10.7507/1002-1892.20160128 復制
肌腱損傷修復術后常存在肌腱與周圍組織粘連，嚴重影響患者肢體功能。研究表明，大量細胞因子可能參與了粘連形成，其中TGF-β與組織器官纖維化關系最密切[1-3]，TGF-β/Smad信號通路是組織粘連形成中的重要作用通路。TGF-β信號通路的關鍵傳導分子為細胞質Smads蛋白家族，它們可將TGF-β信號直接由細胞膜受體傳導入細胞核內[4-5]。TGF-β與受體TβRⅠ結合后，激活TβRⅡ受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶，Smad2、3蛋白被磷酸化，活化的Smad2、3與Smad4結合形成活性轉錄復合物進入細胞核內，與相應DNA直接結合，啟動或抑制轉錄因子而發揮作用，例如與膠原和纖溶酶原激活物抑制物1基因啟動子結合，促進基質合成增加、降解減少[6-7]。
我們應用生物信息學預測Smad4基因3’UTR區存在理論靶位的miRNA；通過檢測患者肌腱修復后腱周粘連組織發現，與正常腱周組織相比，Smad4蛋白含量增高而miRNA219-5P（miR219-5P）表達降低，二者成負相關。但Smad4的異常主要表現為蛋白表達，轉錄水平則無明顯變化，提示Samd4異常為轉錄后調控，而miRNA調控可能為潛在的機制之一。為此，本研究通過過表達或抑制miR219-5P，觀察TGF-β1誘導人肌腱成纖維細胞（tendon derived fibroblasts，TDFs）纖維化相關指標的變化，探討miR219-5P通過調控靶基因Smad4表達在肌腱成纖維化過程中的作用及機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
RPMI-1640培養基、FBS、0.25%胰蛋白酶、Lipofectamine2000轉染試劑、RNA提取試劑Trizol（Invitrogen公司，美國）；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒、PGL3-promoter/TK表達載體（Promega公司，美國）；熒光定量檢測試劑盒（寶生物工程大連有限公司）；細胞活性檢測試劑盒（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；蛋白一抗及二抗（Abcam公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國）；TGF-β1重組蛋白、動物蛋白提取定量試劑盒、ECL發光試劑盒（Pierce公司，美國）。
細胞培養箱（SANYO公司，日本）；低溫高速離心機（Ependorf公司，德國）；電泳儀、轉膜儀（上海天能科技有限公司）；miRNA合成及測序由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 細胞分離培養
肌腱組織由2014年2月－2015年1月于上海交通大學附屬第六人民醫院行上肢截肢手術患者自愿捐贈。取手部屈肌腱中間部分，切成1?mm×1?mm×1?mm的小塊，每100 毫克組織樣品加入3 mgⅠ型膠原酶于37℃消化1 h。室溫以1?500×g離心15 min，棄上清液，使用10 mL含20% FBS的DMEM培養基重懸沉淀，接種于細胞培養瓶，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，細胞貼壁后每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，肌腱細胞貼于培養瓶底>80%后，用0.125% 胰蛋白酶消化傳代，取第3代細胞進行后續實驗。
1.3 細胞轉染及檢測
1.3.1 細胞轉染
化學合成miRNA序列：miR219-5P類似物（mimics），5'-UGAUUGUCCAAACGCAA-UUCUtt-3'；miR219-5P阻遏物（inhibitor），5'-AGAA-UUGCGUUUGGACAAUCAtt-3’；陰性對照（negative control，NC），5'-AUACUGCUCAGAAUUGUACUCtt-3'。其中mimics合成互補的2條單鏈，轉染實驗前退火形成雙鏈。取對數生長期TDFs，使用含10%FBS的RPMI-1640培養基調整細胞濃度為1×105 個/mL，接種至6孔板，每孔2 mL；置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養24 h后進行RNA轉染實驗，轉染過程嚴格按照轉染試劑Lipofectamine2000說明書進行。根據轉染引物不同，分為mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組，并取未轉染細胞作為空白對照組。轉染48 h取細胞進行相關檢測。
1.3.2 實時定量PCR檢測miR219-5P含量
棄培養基，每孔加入1 mL 4℃預冷的dPBS，洗去細胞表面殘留的培養基和血清。每孔加入1 mL 4℃預冷的Trizol，使用1 mL移液器反復吹打細胞，直至液體變得黏稠、透明，將裂解液轉移至1.5 mL無菌離心管，按照Trizol說明書提取細胞總RNA。總RNA提取完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶完整性，紫外分光光度計檢測RNA濃度，取1?μg RNA反轉錄制備cDNA，使用特異性反轉錄引物：U6 primer，5'-GTTTAAGCACTTCGCAAGGTA-3'；miR219-5P primer，5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGAATT-3'。反轉錄完成后，每樣本取2 μL反轉錄產物作為模板，進行定量PCR反應。以U6作為對照，通過Ct值進行數據分析。通過擴增曲線與閾值線的交點來計算每組樣本Ct值，目的基因相對于內參基因的表達量為2ΔΔCt。
1.3.3 Western blot檢測Smad4蛋白含量
棄培養基，每孔加入1 mL 4℃預冷的dPBS，洗去細胞表面殘留的血清及培養基。每孔加入1 mL細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度。每組取10?μL樣本進行10%SDS-PAGE垂直電泳，濕法將膠中蛋白水平轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，加入TBST稀釋后的Smad4一抗（1∶500），4℃過夜；取出后TBST洗膜3次，再加入羊抗鼠二抗（1∶3 000），孵育2 h，洗膜3次，添加ECL發光液反應底物，進行X光曝片，目的條帶經掃描后通過光密度分析軟件進行分析，蛋白相對表達量為目的條帶與GAPDH條帶吸光度（A）值的比值。
1.4 靶基因鑒定實驗
1.4.1 報告基因表達載體制備
根據Smad4基因序列信息（NM_005359.5），使用TargetScan軟件預測Smad4基因3’UTR與miR219-5P可能存在的結合位點，結合位點5'-GACAAUCA-3'位于Smad4基因3’UTR區的第5042-5049位。設計包含結合位點在內的56個堿基序列，合成互補的2條長鏈DNA，長鏈DNA兩端包含酶切位點，2條單鏈經退火后形成雙鏈DNA并克隆至熒光素酶報告基因表達載體pGL3-Promoter，構建野生型報告基因表達載體pGL3-WT-Smad4。使用點突變的方法對種子區序列進行突變，即將結合位點5'-GACAATCA-3'錯義突變為5'-CACAAGAT-3'，構建突變型報告基因表達載體pGL3-MT-Smad4。重組載體經過序列分析后進行無內毒素質粒DNA制備。
1.4.2 雙熒光素酶報告基因檢測
根據轉染的miRNA及重組質粒不同，將實驗分為9組：空白對照組（a組）、pGL3-WT-Smad4轉染組（b組）、pGL3-MT-Smad4轉染組（c組）、pGL3-WT-Smad4+mimics轉染組（d組）、pGL3-MT-Smad4+mimics轉染組（e組）、pGL3-WT-Smad4+inhibitor轉染組（f組）、pGL3-MT-Smad4+inhibitor轉染組（g組）、pGL3-WT-Smad4+NC轉染組（h組）以及pGL3-MT-Smad4+NC轉染組（i組）。
具體方法：a組為正常培養的TDFs；其余各組分別對應取對數生長期正常TDFs及1.3中獲得的轉染24 h的mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組TDFs，0.125%胰蛋白酶消化法制備濃度為1×106 個/mL的細胞懸液，接種至96孔板，每孔100?μL。于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養24 h后，進行質粒DNA及RNA共轉染實驗，每組細胞轉染0.1?μg pGL-TK作為熒光參照，每孔轉染試劑Lipofectamine2000 4 μL、質粒DNA 0.8 μg，RNA（mimics、inhibitor和NC）為20 pmol。轉染時，分別使用25?μL Opti-MEM培養基稀釋轉染試劑、質粒DNA及RNA；得到的稀釋產物室溫放置5 min后混勻，再放置20 min后加入細胞培養基（轉染實驗前使用含10%FBS的DMEM培養基對細胞進行換液），轉染24?h后使用含10%FBS的DMEM培養基對細胞進行換液。轉染48 h后使用雙熒光素酶檢測系統和熒光素酶檢測儀進行熒光素酶含量檢測。
1.5 miR219-5P表達干預實驗
1.5.1 TGF-β1誘導建立纖維化模型
實驗分為5 組：空白對照組（A組，正常TDFs）、直接誘導組（B組，TDFs+TGF-β1）、miR219-5P過表達且誘導組（C組，TDFs+mimics+TGF-β1），miR219-5P表達抑制且誘導組（D組，TDFs+inhibitor+TGF-β1） 以及陰性對照且誘導組（E組，TDFs+NC+TGF-β1）。取正常TDFs以及1.3中獲得的轉染24 h的mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組TDFs，0.125%胰蛋白酶消化法制備濃度為1×106個/mL的細胞懸液，接種至96孔板，每孔100?μL。采用含終濃度為50?ng/ mL TGF-β1及20%FBS的DMEM培養基，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養。空白對照組TDFs正常培養。
1.5.2 CCK-8法檢測細胞活性
培養24、48、72?h各組分別取8孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內繼續培養4 h，用酶標儀測定450 nm處A值，實驗重復3次。
1.5.3 Western blot檢測細胞纖維化相關蛋白指標
培養72 h取各組細胞提取總蛋白，同1.3.2方法檢測Smad4、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原、層粘連蛋白（Laminin，LN）相對含量。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，采用析因分析進行組間及組內比較；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 miR219-5P轉染后TDFs miR219-5P及Smad4蛋白含量檢測
轉染48 h，實時定量PCR檢測示，空白對照組、mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組miR219-5P相對表達量分別為1.00±0.22、4.64±0.61、0.34±0.11、1.05±0.21。與空白對照組及NC轉染組比較，mimics轉染組miR219-5P相對表達量明顯上升，inhibitor轉染組明顯下降，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；NC轉染組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
Western blot檢測示，空白對照組、mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組Smad4蛋白相對表達量分別為1.00±0.18、0.42±0.15、4.32±0.47、0.91±0.21。與空白對照組及NC轉染組比較，mimics轉染組Smad4蛋白相對表達量明顯下降，inhibitor轉染組明顯上升，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；NC轉染組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
Western blot檢測各組TDFs Smad4蛋白表達 1：空白對照組 2：mimics轉染組 3：inhibitor轉染組 4：NC轉染組 ? ?圖 2 熒光素酶活性檢測miR219-5P與Smad4 結合靶位
Figure1.
Expressions of Smad4 after miR219-5P transfection by Western blot 1: Blank control group 2: Mimics transfection group 3: Inhibitor transfection group 4: NC transfection group ? ?Fig. 2 The binding sites of miR219-5P and Smad4 by the luciferase activity detection
2.2 靶基因鑒定實驗
熒光素酶活性檢測結果顯示，與b組比較，d組細胞內熒光素酶含量降低，f組細胞內熒光素酶含量升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。c、e、g組組間比較無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。b、c、h、i組間比較細胞內熒光素酶含量，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
2.3 miR219-5P表達干預實驗
2.3.1 CCK-8法檢測細胞活性
培養24、48?h，各組細胞A值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。培養72 h，各組細胞增殖活性明顯增強，B組A值顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.01）；與B組比較，C組細胞增殖活性升高趨勢得到抑制，而D組細胞增殖活性則進一步增強，差異均有統計學意義（P<0.01）；E組與B組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖2
CCK-8法檢測各組細胞增殖活性 ? ?圖 4 Western blot檢測各組細胞纖維化相關蛋白電泳圖 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組 5：E組 ? ?圖 5 Western blot檢測各組細胞纖維化相關蛋白相對表達量比較 ?Smad4 ?α-SMA ?Ⅰ型膠原 ?LN
Figure2.
Cell proliferation assay in each group by CCK-8 ? ?Fig. 4 Electrophoresis of relative proteins of TDFs fibrosis by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E ? ?Fig. 5 Relative expressions of relative proteins of TDFs fibrosis by Western blot ?Smad4 ?α-SMA ?Collagen type I ?LN
2.3.2 Western blot檢測細胞纖維化相關蛋白指標
培養72 h，B組Smad4、α-SMA、Ⅰ型膠原和LN蛋白相對表達量均顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；與B組比較，C組以上蛋白相對表達量降低，D組相對表達量增加，差異均有統計學意義（P<0.05）；E組與B組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4、5。
3 討論
臨床肌腱粘連防治療效的提高有賴于對其發生機制的深入研究。目前，通過調控細胞因子的表達、抑制組織纖維細胞增殖來預防肌腱粘連的研究較多[8-14]。TGF-β/Smad信號轉導通路是組織纖維化進程中的重要通路，其分子組成及調節比較復雜，與其他信號通路存在廣泛的交互影響。隨著對miRNA研究的深入，研究者發現miRNA在纖維化相關疾病中起到了極其重要的作用，不僅參與纖維化的發生過程，其表達變化還與纖維化程度密切相關。miRNA是一類長度為18～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[15]。目前Sanger miR Base16.0收錄的miRNA已有15 000多個，涉及140多個物種。其中人類miRNA已超過1 000個，雖然僅占人類基因組序列的1%～3%，卻參與了30%基因表達的調控[16]。
miRNA可以影響TGF-β信號通路的不同位點，Smad4是其中一個重要靶基因[17]。Smad4的MH1 結構域中也存在類似受體激活的Smads (receptor actived Smads，R-Smads)結構中的β發夾結構，具有結合DNA的能力。R-Smads被磷酸化后，Smad4 便與其形成雜聚體，并轉位至細胞核調節靶基因的轉錄。Smad4參與所有的TGF-β超家族信號轉導，故稱之為共同介體性Smads。近年來，越來越多研究證實miRNA和Smad4表達失調與多種疾病，如癌癥、心血管疾病、纖維化疾病等密切相關。Hao等[18- 19]報道在胰腺癌組織中高表達的miRNA-483-3p、miRNA-421與DPC4/Smad4 成負相關，miRNA-483-3p、miRNA-421通過負調控DPC4/Smad4蛋白水平的表達，調節細胞生長及克隆形成率，以及對Smad4下游的TGF-β/BMP通路有抑制作用。He等[20]報道miRNA-146a可通過抑制Smad4的表達來阻斷TGF-β/Smad信號通路，進而抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖。因此，miRNA及Smad4在肌腱粘連過程中可能也起著與上述同樣的重要作用。但是，國內外尚未檢索到肌腱粘連防治領域miRNA和Smad4在TGF-β/Smad通路中的具體調控機制及相關研究的報道。
我們根據Smad4基因序列信息（NM_005359.5），使用TargetScan軟件預測Smad4基因3’UTR與miR219-5P可能存在的結合位點，為明確Smad4 是否為miR219-5P調控的靶基因，本研究使用雙熒光素酶檢測系統，檢測細胞干預前后熒光素酶的變化趨勢，通過熒光素酶活性變化判斷預測的理論靶位是否存在。結果顯示，與pGL3-WT-Smad4轉染組比較，miR219-5P mimic能夠明顯抑制細胞內熒光素酶活性，而miR219-5P inhibitor則會增強熒光素酶表達，且組間比較差異有統計學意義；pGL3-MT-Smad4相關轉染組中，miR219-5P mimic和miR219-5P inhibitor對于細胞內熒光素酶活性無明顯影響；無論pGL3-WT-Smad4還是pGL3-MT-Smad4，NC共轉染組與報告基因表達載體單獨轉染組細胞內熒光素酶活性均無明顯差異。由此表明，Smad4 可能是miR219-5P的靶基因。
為進一步驗證miR219-5P與Smad4 在生理狀態下是否具有上述靶向調控關系，本研究通過TGF-β1誘導TDFs建立纖維化模型，CCK-8法檢測細胞活性，Western blot檢測過表達及抑制miR219-5P表達后細胞纖維化相關蛋白指標變化。結果顯示，TGF-β1誘導培養72 h后細胞會發生纖維化，具體表現為細胞增殖活性增強及纖維化標志蛋白表達明顯增強。過表達miR219-5P可明顯抑制TGF-β1誘導的細胞纖維化，這可能與miR219-5P抑制其靶蛋白Smad4的表達有關。Smad4蛋白含量降低，導致其與Smad2/3形成復合物并將其轉運至細胞核的能力明顯降低，從而抑制了TGF-β1/Smad信號在細胞內的傳遞，最終抑制了TDFs被誘導的纖維化。
目前研究提示miRNA激動劑或拮抗劑可作為一種新的潛在治療工具，這為未來miRNA作為一種新的治療靶點提供了可能。因此，深入探討miRNA在TGF-β/Smads信號轉導通路中信息反饋及交叉調控的機制，有助于進一步揭示肌腱粘連的發生機制奠定基礎，可能對肌腱粘連的治療靶點選擇和臨床藥物開發起到重要作用。
肌腱損傷修復術后常存在肌腱與周圍組織粘連，嚴重影響患者肢體功能。研究表明，大量細胞因子可能參與了粘連形成，其中TGF-β與組織器官纖維化關系最密切[1-3]，TGF-β/Smad信號通路是組織粘連形成中的重要作用通路。TGF-β信號通路的關鍵傳導分子為細胞質Smads蛋白家族，它們可將TGF-β信號直接由細胞膜受體傳導入細胞核內[4-5]。TGF-β與受體TβRⅠ結合后，激活TβRⅡ受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶，Smad2、3蛋白被磷酸化，活化的Smad2、3與Smad4結合形成活性轉錄復合物進入細胞核內，與相應DNA直接結合，啟動或抑制轉錄因子而發揮作用，例如與膠原和纖溶酶原激活物抑制物1基因啟動子結合，促進基質合成增加、降解減少[6-7]。
我們應用生物信息學預測Smad4基因3’UTR區存在理論靶位的miRNA；通過檢測患者肌腱修復后腱周粘連組織發現，與正常腱周組織相比，Smad4蛋白含量增高而miRNA219-5P（miR219-5P）表達降低，二者成負相關。但Smad4的異常主要表現為蛋白表達，轉錄水平則無明顯變化，提示Samd4異常為轉錄后調控，而miRNA調控可能為潛在的機制之一。為此，本研究通過過表達或抑制miR219-5P，觀察TGF-β1誘導人肌腱成纖維細胞（tendon derived fibroblasts，TDFs）纖維化相關指標的變化，探討miR219-5P通過調控靶基因Smad4表達在肌腱成纖維化過程中的作用及機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
RPMI-1640培養基、FBS、0.25%胰蛋白酶、Lipofectamine2000轉染試劑、RNA提取試劑Trizol（Invitrogen公司，美國）；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒、PGL3-promoter/TK表達載體（Promega公司，美國）；熒光定量檢測試劑盒（寶生物工程大連有限公司）；細胞活性檢測試劑盒（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；蛋白一抗及二抗（Abcam公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國）；TGF-β1重組蛋白、動物蛋白提取定量試劑盒、ECL發光試劑盒（Pierce公司，美國）。
細胞培養箱（SANYO公司，日本）；低溫高速離心機（Ependorf公司，德國）；電泳儀、轉膜儀（上海天能科技有限公司）；miRNA合成及測序由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 細胞分離培養
肌腱組織由2014年2月－2015年1月于上海交通大學附屬第六人民醫院行上肢截肢手術患者自愿捐贈。取手部屈肌腱中間部分，切成1?mm×1?mm×1?mm的小塊，每100 毫克組織樣品加入3 mgⅠ型膠原酶于37℃消化1 h。室溫以1?500×g離心15 min，棄上清液，使用10 mL含20% FBS的DMEM培養基重懸沉淀，接種于細胞培養瓶，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，細胞貼壁后每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，肌腱細胞貼于培養瓶底>80%后，用0.125% 胰蛋白酶消化傳代，取第3代細胞進行后續實驗。
1.3 細胞轉染及檢測
1.3.1 細胞轉染
化學合成miRNA序列：miR219-5P類似物（mimics），5'-UGAUUGUCCAAACGCAA-UUCUtt-3'；miR219-5P阻遏物（inhibitor），5'-AGAA-UUGCGUUUGGACAAUCAtt-3’；陰性對照（negative control，NC），5'-AUACUGCUCAGAAUUGUACUCtt-3'。其中mimics合成互補的2條單鏈，轉染實驗前退火形成雙鏈。取對數生長期TDFs，使用含10%FBS的RPMI-1640培養基調整細胞濃度為1×105 個/mL，接種至6孔板，每孔2 mL；置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養24 h后進行RNA轉染實驗，轉染過程嚴格按照轉染試劑Lipofectamine2000說明書進行。根據轉染引物不同，分為mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組，并取未轉染細胞作為空白對照組。轉染48 h取細胞進行相關檢測。
1.3.2 實時定量PCR檢測miR219-5P含量
棄培養基，每孔加入1 mL 4℃預冷的dPBS，洗去細胞表面殘留的培養基和血清。每孔加入1 mL 4℃預冷的Trizol，使用1 mL移液器反復吹打細胞，直至液體變得黏稠、透明，將裂解液轉移至1.5 mL無菌離心管，按照Trizol說明書提取細胞總RNA。總RNA提取完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶完整性，紫外分光光度計檢測RNA濃度，取1?μg RNA反轉錄制備cDNA，使用特異性反轉錄引物：U6 primer，5'-GTTTAAGCACTTCGCAAGGTA-3'；miR219-5P primer，5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGAATT-3'。反轉錄完成后，每樣本取2 μL反轉錄產物作為模板，進行定量PCR反應。以U6作為對照，通過Ct值進行數據分析。通過擴增曲線與閾值線的交點來計算每組樣本Ct值，目的基因相對于內參基因的表達量為2ΔΔCt。
1.3.3 Western blot檢測Smad4蛋白含量
棄培養基，每孔加入1 mL 4℃預冷的dPBS，洗去細胞表面殘留的血清及培養基。每孔加入1 mL細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度。每組取10?μL樣本進行10%SDS-PAGE垂直電泳，濕法將膠中蛋白水平轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，加入TBST稀釋后的Smad4一抗（1∶500），4℃過夜；取出后TBST洗膜3次，再加入羊抗鼠二抗（1∶3 000），孵育2 h，洗膜3次，添加ECL發光液反應底物，進行X光曝片，目的條帶經掃描后通過光密度分析軟件進行分析，蛋白相對表達量為目的條帶與GAPDH條帶吸光度（A）值的比值。
1.4 靶基因鑒定實驗
1.4.1 報告基因表達載體制備
根據Smad4基因序列信息（NM_005359.5），使用TargetScan軟件預測Smad4基因3’UTR與miR219-5P可能存在的結合位點，結合位點5'-GACAAUCA-3'位于Smad4基因3’UTR區的第5042-5049位。設計包含結合位點在內的56個堿基序列，合成互補的2條長鏈DNA，長鏈DNA兩端包含酶切位點，2條單鏈經退火后形成雙鏈DNA并克隆至熒光素酶報告基因表達載體pGL3-Promoter，構建野生型報告基因表達載體pGL3-WT-Smad4。使用點突變的方法對種子區序列進行突變，即將結合位點5'-GACAATCA-3'錯義突變為5'-CACAAGAT-3'，構建突變型報告基因表達載體pGL3-MT-Smad4。重組載體經過序列分析后進行無內毒素質粒DNA制備。
1.4.2 雙熒光素酶報告基因檢測
根據轉染的miRNA及重組質粒不同，將實驗分為9組：空白對照組（a組）、pGL3-WT-Smad4轉染組（b組）、pGL3-MT-Smad4轉染組（c組）、pGL3-WT-Smad4+mimics轉染組（d組）、pGL3-MT-Smad4+mimics轉染組（e組）、pGL3-WT-Smad4+inhibitor轉染組（f組）、pGL3-MT-Smad4+inhibitor轉染組（g組）、pGL3-WT-Smad4+NC轉染組（h組）以及pGL3-MT-Smad4+NC轉染組（i組）。
具體方法：a組為正常培養的TDFs；其余各組分別對應取對數生長期正常TDFs及1.3中獲得的轉染24 h的mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組TDFs，0.125%胰蛋白酶消化法制備濃度為1×106 個/mL的細胞懸液，接種至96孔板，每孔100?μL。于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養24 h后，進行質粒DNA及RNA共轉染實驗，每組細胞轉染0.1?μg pGL-TK作為熒光參照，每孔轉染試劑Lipofectamine2000 4 μL、質粒DNA 0.8 μg，RNA（mimics、inhibitor和NC）為20 pmol。轉染時，分別使用25?μL Opti-MEM培養基稀釋轉染試劑、質粒DNA及RNA；得到的稀釋產物室溫放置5 min后混勻，再放置20 min后加入細胞培養基（轉染實驗前使用含10%FBS的DMEM培養基對細胞進行換液），轉染24?h后使用含10%FBS的DMEM培養基對細胞進行換液。轉染48 h后使用雙熒光素酶檢測系統和熒光素酶檢測儀進行熒光素酶含量檢測。
1.5 miR219-5P表達干預實驗
1.5.1 TGF-β1誘導建立纖維化模型
實驗分為5 組：空白對照組（A組，正常TDFs）、直接誘導組（B組，TDFs+TGF-β1）、miR219-5P過表達且誘導組（C組，TDFs+mimics+TGF-β1），miR219-5P表達抑制且誘導組（D組，TDFs+inhibitor+TGF-β1） 以及陰性對照且誘導組（E組，TDFs+NC+TGF-β1）。取正常TDFs以及1.3中獲得的轉染24 h的mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組TDFs，0.125%胰蛋白酶消化法制備濃度為1×106個/mL的細胞懸液，接種至96孔板，每孔100?μL。采用含終濃度為50?ng/ mL TGF-β1及20%FBS的DMEM培養基，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養。空白對照組TDFs正常培養。
1.5.2 CCK-8法檢測細胞活性
培養24、48、72?h各組分別取8孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內繼續培養4 h，用酶標儀測定450 nm處A值，實驗重復3次。
1.5.3 Western blot檢測細胞纖維化相關蛋白指標
培養72 h取各組細胞提取總蛋白，同1.3.2方法檢測Smad4、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原、層粘連蛋白（Laminin，LN）相對含量。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，采用析因分析進行組間及組內比較；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 miR219-5P轉染后TDFs miR219-5P及Smad4蛋白含量檢測
轉染48 h，實時定量PCR檢測示，空白對照組、mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組miR219-5P相對表達量分別為1.00±0.22、4.64±0.61、0.34±0.11、1.05±0.21。與空白對照組及NC轉染組比較，mimics轉染組miR219-5P相對表達量明顯上升，inhibitor轉染組明顯下降，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；NC轉染組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
Western blot檢測示，空白對照組、mimics轉染組、inhibitor轉染組、NC轉染組Smad4蛋白相對表達量分別為1.00±0.18、0.42±0.15、4.32±0.47、0.91±0.21。與空白對照組及NC轉染組比較，mimics轉染組Smad4蛋白相對表達量明顯下降，inhibitor轉染組明顯上升，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；NC轉染組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
Western blot檢測各組TDFs Smad4蛋白表達 1：空白對照組 2：mimics轉染組 3：inhibitor轉染組 4：NC轉染組 ? ?圖 2 熒光素酶活性檢測miR219-5P與Smad4 結合靶位
Figure1.
Expressions of Smad4 after miR219-5P transfection by Western blot 1: Blank control group 2: Mimics transfection group 3: Inhibitor transfection group 4: NC transfection group ? ?Fig. 2 The binding sites of miR219-5P and Smad4 by the luciferase activity detection
2.2 靶基因鑒定實驗
熒光素酶活性檢測結果顯示，與b組比較，d組細胞內熒光素酶含量降低，f組細胞內熒光素酶含量升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。c、e、g組組間比較無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。b、c、h、i組間比較細胞內熒光素酶含量，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
2.3 miR219-5P表達干預實驗
2.3.1 CCK-8法檢測細胞活性
培養24、48?h，各組細胞A值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。培養72 h，各組細胞增殖活性明顯增強，B組A值顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.01）；與B組比較，C組細胞增殖活性升高趨勢得到抑制，而D組細胞增殖活性則進一步增強，差異均有統計學意義（P<0.01）；E組與B組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖2
CCK-8法檢測各組細胞增殖活性 ? ?圖 4 Western blot檢測各組細胞纖維化相關蛋白電泳圖 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組 5：E組 ? ?圖 5 Western blot檢測各組細胞纖維化相關蛋白相對表達量比較 ?Smad4 ?α-SMA ?Ⅰ型膠原 ?LN
Figure2.
Cell proliferation assay in each group by CCK-8 ? ?Fig. 4 Electrophoresis of relative proteins of TDFs fibrosis by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E ? ?Fig. 5 Relative expressions of relative proteins of TDFs fibrosis by Western blot ?Smad4 ?α-SMA ?Collagen type I ?LN
2.3.2 Western blot檢測細胞纖維化相關蛋白指標
培養72 h，B組Smad4、α-SMA、Ⅰ型膠原和LN蛋白相對表達量均顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；與B組比較，C組以上蛋白相對表達量降低，D組相對表達量增加，差異均有統計學意義（P<0.05）；E組與B組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4、5。
3 討論
臨床肌腱粘連防治療效的提高有賴于對其發生機制的深入研究。目前，通過調控細胞因子的表達、抑制組織纖維細胞增殖來預防肌腱粘連的研究較多[8-14]。TGF-β/Smad信號轉導通路是組織纖維化進程中的重要通路，其分子組成及調節比較復雜，與其他信號通路存在廣泛的交互影響。隨著對miRNA研究的深入，研究者發現miRNA在纖維化相關疾病中起到了極其重要的作用，不僅參與纖維化的發生過程，其表達變化還與纖維化程度密切相關。miRNA是一類長度為18～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[15]。目前Sanger miR Base16.0收錄的miRNA已有15 000多個，涉及140多個物種。其中人類miRNA已超過1 000個，雖然僅占人類基因組序列的1%～3%，卻參與了30%基因表達的調控[16]。
miRNA可以影響TGF-β信號通路的不同位點，Smad4是其中一個重要靶基因[17]。Smad4的MH1 結構域中也存在類似受體激活的Smads (receptor actived Smads，R-Smads)結構中的β發夾結構，具有結合DNA的能力。R-Smads被磷酸化后，Smad4 便與其形成雜聚體，并轉位至細胞核調節靶基因的轉錄。Smad4參與所有的TGF-β超家族信號轉導，故稱之為共同介體性Smads。近年來，越來越多研究證實miRNA和Smad4表達失調與多種疾病，如癌癥、心血管疾病、纖維化疾病等密切相關。Hao等[18- 19]報道在胰腺癌組織中高表達的miRNA-483-3p、miRNA-421與DPC4/Smad4 成負相關，miRNA-483-3p、miRNA-421通過負調控DPC4/Smad4蛋白水平的表達，調節細胞生長及克隆形成率，以及對Smad4下游的TGF-β/BMP通路有抑制作用。He等[20]報道miRNA-146a可通過抑制Smad4的表達來阻斷TGF-β/Smad信號通路，進而抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖。因此，miRNA及Smad4在肌腱粘連過程中可能也起著與上述同樣的重要作用。但是，國內外尚未檢索到肌腱粘連防治領域miRNA和Smad4在TGF-β/Smad通路中的具體調控機制及相關研究的報道。
我們根據Smad4基因序列信息（NM_005359.5），使用TargetScan軟件預測Smad4基因3’UTR與miR219-5P可能存在的結合位點，為明確Smad4 是否為miR219-5P調控的靶基因，本研究使用雙熒光素酶檢測系統，檢測細胞干預前后熒光素酶的變化趨勢，通過熒光素酶活性變化判斷預測的理論靶位是否存在。結果顯示，與pGL3-WT-Smad4轉染組比較，miR219-5P mimic能夠明顯抑制細胞內熒光素酶活性，而miR219-5P inhibitor則會增強熒光素酶表達，且組間比較差異有統計學意義；pGL3-MT-Smad4相關轉染組中，miR219-5P mimic和miR219-5P inhibitor對于細胞內熒光素酶活性無明顯影響；無論pGL3-WT-Smad4還是pGL3-MT-Smad4，NC共轉染組與報告基因表達載體單獨轉染組細胞內熒光素酶活性均無明顯差異。由此表明，Smad4 可能是miR219-5P的靶基因。
為進一步驗證miR219-5P與Smad4 在生理狀態下是否具有上述靶向調控關系，本研究通過TGF-β1誘導TDFs建立纖維化模型，CCK-8法檢測細胞活性，Western blot檢測過表達及抑制miR219-5P表達后細胞纖維化相關蛋白指標變化。結果顯示，TGF-β1誘導培養72 h后細胞會發生纖維化，具體表現為細胞增殖活性增強及纖維化標志蛋白表達明顯增強。過表達miR219-5P可明顯抑制TGF-β1誘導的細胞纖維化，這可能與miR219-5P抑制其靶蛋白Smad4的表達有關。Smad4蛋白含量降低，導致其與Smad2/3形成復合物并將其轉運至細胞核的能力明顯降低，從而抑制了TGF-β1/Smad信號在細胞內的傳遞，最終抑制了TDFs被誘導的纖維化。
目前研究提示miRNA激動劑或拮抗劑可作為一種新的潛在治療工具，這為未來miRNA作為一種新的治療靶點提供了可能。因此，深入探討miRNA在TGF-β/Smads信號轉導通路中信息反饋及交叉調控的機制，有助于進一步揭示肌腱粘連的發生機制奠定基礎，可能對肌腱粘連的治療靶點選擇和臨床藥物開發起到重要作用。
