引用本文： 宋學文, 魏彥明, 李根, 秦文, 王維, 張曉敏, 趙紅斌. 紅景天苷/膠原蛋白/聚己內酯神經導管修復大鼠坐骨神經缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(5): 634-640. doi: 10.7507/1002-1892.20160127 復制
周圍神經損傷后的神經再生及功能恢復一直是臨床研究的熱點和重點。周圍神經損傷會造成外周組織與中樞神經之間的信息交流障礙，使患者喪失感覺或運動功能，嚴重影響患者身心健康[1]。自體神經移植是周圍神經缺損修復的金標準，但自體神經來源有限，應用受限。組織工程技術是修復周圍神經損傷的有效方法，迄今已有大量相關文獻報道，導管支架材料中復合生長因子能有效促進損傷神經的再生和修復，但存在生長因子的劑量及在構建材料中易失活等問題[2-4]。膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，有利于細胞存活、增殖和分化[5]，被廣泛用于神經缺損修復[6-11]。紅景天苷是中藥紅景天的主要成分之一，具有抗氧化和對神經細胞的保護作用 [12]，我們前期研究發現，紅景天苷能誘導BMSCs向神經元細胞定向分化，并促進細胞分泌NGF[13-15]。
本實驗利用紅景天苷作為緩釋藥物替代生長因子，構建復合紅景天苷微球的膠原蛋白多孔神經導管支架材料芯層，以靜電紡絲技術構建膠原蛋白/聚己內酯（polycaprolactone，PCL）納米纖維神經導管支架材料殼層，利用京尼平交聯使芯層與殼層結合構建紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管；并通過動物實驗評價該復合神經導管對坐骨神經缺損修復的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2月齡健康雌性Wistar大鼠38只，體質量190～210 g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供。
PCL、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[ploy（D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]、六氟異丙醇（Sigma公司，美國）；紅景天苷（中國食品藥品檢定研究所）；京尼平（和光純藥工業株式會社，日本）；膠原蛋白（2%wt，豬皮中提取）由本實驗室自制；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA；天津市恒興化學試劑公司）；SABC免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。DT-1003高壓靜電紡絲機（大連鼎通科技發展有限公司）；Keypoint-W肌電誘發電位儀（Medtronic公司，美國）。
1.2 紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管的制備
1.2.1 紅景天苷微球制備及緩釋效果評價
利用W/O/W方法制備紅景天苷微球。配制1.25 mg/mL紅景天苷水溶液、25 mg/mL PLGA二氯甲烷溶液及1%PVA水溶液備用；量取2.4 mL紅景天苷水溶液與4.8?mL PLGA二氯甲烷溶液混合后，采用超聲使其成為乳濁液；用注射器將7.2 mL乳濁液緩慢注入24?mL PVA水溶液中，在磁力攪拌機上攪拌同時進行超聲；最后置于通風櫥中磁力攪拌4 h，以離心半徑13 cm、1 000 r/min離心10 min，冷凍干燥收集微球。取10 mg微球加入10 mL蒸餾水中，置于37℃恒溫搖床；于1、4、8、12、24 h分別取樣保存，之后1 個月內每隔24 h取樣1次；利用紫外分光光度計檢測其濃度，計算緩釋率。
1.2.2 神經導管殼層的制備
取0.6 g凍干膠原蛋白、0.3 g PCL置于50 mL錐形瓶中，用10 mL六氟異丙醇溶解；采用高壓靜電紡絲機，將膠原蛋白/PCL溶液制成內徑2 mm、外徑2.25 mm、長15 mm的導管殼層，常溫干燥。具體參數：電壓14 kV，接收距離12 cm，流速1 mL/h。掃描電鏡觀察殼層纖維結構及直徑。
1.2.3 神經導管芯層的制備
取10、20、40 μg紅景天苷微球分別與1 mL膠原蛋白混合，利用自制模具制備單孔狀含膠原蛋白和紅景天苷微球的導管芯層，同時制備單純膠原蛋白芯層，冷凍干燥。掃描電鏡觀察芯層結構。
1.2.4 復合神經導管構建
將上述不同濃度的紅景天苷/膠原蛋白或單純膠原蛋白芯層嵌套入殼層，1%京尼平37℃交聯1 h，無水乙醇洗10 min，水洗10?min×3次，—40℃真空冷凍干燥后封裝，60Co照射滅菌后備用（圖 1）。掃描電鏡觀察交聯后復合神經導管殼層及芯層結構。
圖1
紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管大體觀察 ? ?圖 2 20 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管修復神經缺損后 ? ?圖 3 紅景天苷微球的累計緩釋率 ? ?圖 4 掃描電鏡觀察神經導管 ?交聯前殼層（×2 000） ?交聯后殼層（×2 000） ?交聯前芯層橫截面（×35） 箭頭示孔道 ?交聯后芯層縱截面（×35） 箭頭示孔道 ? ?圖 5 術后6個月A～D組再生神經大體觀察箭頭示近端神經 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ?E組
Figure1.
General observation of the salidroside/collagen/PCL nerve conduit ? ?Fig. 2 Bridging nerve defect with 20 μg/mL salidroside/collagen/PCL nerve conduit ? ?Fig. 3 Cumulative release rate of salidroside microsphere ? ?Fig. 4 SEM observation of the nerve conduit ?Pre cross-linked shell layer (×2 000) ?Cross-linked shell layer (×2 000) ?Cross-section of pre cross-linked core layer (×35) Arrow indicated the channel ?Longitudinal section of pre cross-linked core layer (×35) Arrow indicated the channel ? ?Fig. 5 General observation of regenerative nerve in each group at 6 months after operation Arrow indicated connection point between proximal nerve and nerve conduit ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E
1.3 動物模型制備及分組
將38只大鼠隨機分為5組，其中A、B、C、D組各9只，E組2只。各組大鼠以10%水合氯醛腹腔注射（0.3 mL/100 g）麻醉后，右后肢臀部及大腿備皮，分離暴露并橫斷切除15 mm長坐骨神經，制備坐骨神經缺損模型。各組分別采用以下神經導管或自體神經橋接缺損，8-0縫合線縫合：A組膠原蛋白/PCL復合神經導管，B組10 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管，C組20 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管，D組40 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL神經導管，E組自體神經。見圖 2。3-0縫合線逐級縫合肌肉、皮膚，聚維酮碘溶液消毒。術后常規飼養。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察各組大鼠存活情況、切口愈合、有無感染發生，以及肢體運動恢復情況。
1.4.2 坐骨神經運動功能指數（sciatic functional index，SFI）評價
術后1、3、6個月A～D組各取6只大鼠，E組取2只大鼠，將大鼠雙前肢固定于木板上，后肢固定正常側，用直尺分別測量手術側及正常側足印長度（print length，PL）、足趾寬度（toe spread，TS）和中間足趾距（intermediary toe spread，IT）。PL：足跟至足尖的距離；TS：第1趾至第5趾連線距離；IT：第2趾至第4趾連線距離。參照以下公式計算SFI[16]：SFI=—?38.8×[（EPL－NPL）/NPL]+109.5×[（ETS－NTS）/NTS]+13.3×[（EIT－NIT）/NIT]－8.8；其中E為手術側，N為正常側。SFI為0表示神經功能正常，—?100表示神經功能完全喪失。
1.4.3 大體觀察
術后6個月各組大鼠SFI測量后，同上法麻醉，按原手術切口入路，大體觀察各組導管兩端連接及再生神經情況。
1.4.4 神經電生理檢測
大體觀察后，采用肌電誘發電位儀以100 mA電流于再生神經近端進行刺激，誘發動作電位，并記錄潛伏期（latency，LAT）、傳導速度（conduction velocity，CV），計算兩指標比值（LAT/CV）反映神經傳導功能。
1.4.5 組織學及免疫組織化學染色觀察
神經電生理檢測后處死各組大鼠，分離并切取長約18 mm再生神經（兩端保留部分自體神經），置于10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，光鏡下觀察細胞生長及材料降解情況。部分切片參照免疫組織化學染色試劑盒說明書，行S-100和外周髓鞘蛋白0（peripheral myelin protein 0，P0）免疫組織化學染色，光鏡下觀察陽性染色呈棕黃色。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行免疫組織化學染色定量評價。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 紅景天苷微球緩釋效果評價
紅景天苷微球于3 d出現突釋，累計緩釋率為41.57%；13 d后緩釋趨于平穩，達76.59%，可持續緩釋至16 d。見圖 3。
2.2 掃描電鏡觀察神經導管
掃描電鏡觀察示，神經導管殼層交聯前為無序排列的纖維結構，纖維直徑為200～700 nm（圖 4a）；交聯后纖維間相互粘連、皺縮、致密且有大小不等孔隙（圖 4b）。神經導管芯層交聯前結構疏松，呈多孔蜂窩狀，可見孔道（圖 4c）；交聯后膠原呈多孔板層結構，多孔道清晰可見，芯層材料中可見大小不等孔隙（圖 4d）。
2.3 動物體內植入觀察
2.3.1 一般情況
各組大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好，無明顯感染現象。A～D組術側足部于1個月左右出現潰瘍，其中A組最嚴重。各組后肢支持功能正常，足部伸縮功能未恢復。
2.3.2 SFI評價
組間比較：術后1、3、6個月，E組SFI均顯著高于A～D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。術后1個月，B、C、D組顯著高于A組（P<0.05），B、C、D組間差異無統計學意義（P>0.05）；3個月，A～D組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；6個月，C組顯著高于A、B、D組，A、B組高于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05），A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。組內比較：除C、E組術后1、3、6個月SFI比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組組內各時間點間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組大鼠SFI比較（2.3.3 大體觀察
術后6個月，B、C組導管支架兩端與神經連接良好，連接處神經較粗；A、D組僅近端連接良好，連接處神經較細。A～D組導管兩端材料均降解明顯，其中C組殘余導管材料最少，其材料殘余量由少到多依次為A、B、D組。E組再生神經狀態良好，神經粗細程度接近正常狀態。見圖 5。
2.3.4 神經電生理檢測
術后6個月，A、B、C、D、E組LAT/CV分別為1.74±0.05、1.70±0.12、1.29±0.19、1.96±0.11、1.10±0.13。C、E組LAT/CV顯著低于A、B、D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、E組間以及A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3.5 組織學觀察
術后6個月，HE染色示A～D組導管支架芯層材料完全降解，有神經纖維形成；B、C、E組神經纖維組織明顯多于A、D組，且C組神經纖維排列較B組緊密，與E組排列相近，但缺少神經內膜包裹神經纖維。見圖 6。
圖2
術后6個月各組組織學觀察（HE×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ?E組 ? ?圖 7 術后6個月各組P0免疫組織化學染色觀察（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ?E組 ? ?圖 8 術后6 個月各組S-100免疫組織化學染色觀察（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ?E組
Figure2.
Histological observation of nerve fibers in each group at 6 months after operation (HE×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ? ?Fig. 7 Immunohistochemical staining of P0 protein in each group at 6 months after operation (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ? ?Fig. 8 Immunohistochemical staining of S-100 protein in each group at 6 months after operation (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E
2.3.6 免疫組織化學染色觀察
術后6個月，各組均可見S-100及P0蛋白表達（圖 7、8）。其中B、C、E組P0和S-100表達水平均顯著高于A、D組，且E組高于B、C組，C組高于B組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D組間比較S-100表達水平差異無統計學意義（P>0.05），但A組P0表達水平低于D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
術后6個月各組S-100及P0表達水平比較（3 討論
神經導管作為修復神經缺損的組織工程支架材料已有大量研究報道，Isaacs等[17]研究發現神經導管直徑為2 mm時修復效果為佳。本實驗采用靜電紡絲技術構建膠原蛋白/PCL神經導管殼層，導管支架材料的芯層嵌套于殼層中形成復合支架材料。構建上述材料的原因，一是具有多孔道的芯層材料中包被的紅景天苷微球可通過其緩釋作用促進神經再生；二是通過靜電紡絲的殼層材料具有一定孔隙，有利于神經修復過程中營養物和組織代謝物的交換，同時引導神經沿一定方向生長。
本實驗結果顯示，術后6個月，紅景天苷/膠原蛋白組成的芯層完全降解，所占區域被再生神經組織完全替代；膠原蛋白/PCL電紡的殼層大部分被降解，殘留材料中有大量細胞侵入，提示構建的神經導管支架材料具有良好的組織相容性和可降解性，能夠有效引導缺損神經的再生。且采用20 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管及自體坐骨神經移植后，大鼠運動功能恢復效果優于其他神經導管修復，提示合適劑量的紅景天苷有助于損傷神經再生和功能恢復。
P0是周圍神經髓鞘結構的主要成分，也是髓鞘膜中最豐富的蛋白，其主要功能是保護神經和促進有效神經沖動傳播。神經修復后存在P0表達，表明新生神經有髓鞘形成，由于P0表達能夠影響神經髓鞘結構的完整性和功能，P0表達水平越高，新生神經髓鞘的結構越完整，其神經傳導的功能恢復越優。本實驗結果顯示，術后6個月，20?μg/ mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管修復大鼠坐骨神經缺損后，P0表達水平明顯高于其他神經導管修復。S-100主要分布于中樞神經系統和周圍神經系統的星形膠質細胞和雪旺細胞等組織中，周圍神經中S-100為雪旺細胞標志蛋白。本實驗中20?μg/ mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管修復后，S-100表達水平亦顯著增加。以上結果提示，與紅景天苷濃度為10?μg/mL及40?μg/mL的復合神經導管相比，20?μg/mL復合神經導管修復大鼠坐骨神經缺損后，可獲得較好效果。分析原因可能與低劑量紅景天苷對神經再生無明顯影響，而高劑量紅景天苷對神經的再生有一定抑制作用有關。
周圍神經損傷修復中神經導管必須滿足生物相容性、降解性良好，易于細胞生長、黏附，能促進神經細胞增殖、分化[18]。膠原蛋白、PCL作為神經導管支架材料具有良好的生物相容性且成本低 [18-19]。有研究證明，PCL與膠原蛋白結合后降解性能及生物相容性良好，降解周期為3～6個月[20]，所以膠原蛋白/PCL復合神經導管可滿足神經細胞再生所需。本實驗制備的神經導管芯層孔隙可提供神經細胞生長空間，其中所含的膠原蛋白有利于細胞黏附、增殖；釋放出的紅景天苷可促進細胞分泌NGF，有利于神經細胞增殖、分化。因此采用紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管在修復過程中可確保細胞處于生長有利的微環境中，保證了神經修復效果。
綜上述，本實驗構建的紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管具有修復周圍神經損傷的潛力，通過進一步研究和優化能獲得理想的周圍神經損傷修復支架材料。
周圍神經損傷后的神經再生及功能恢復一直是臨床研究的熱點和重點。周圍神經損傷會造成外周組織與中樞神經之間的信息交流障礙，使患者喪失感覺或運動功能，嚴重影響患者身心健康[1]。自體神經移植是周圍神經缺損修復的金標準，但自體神經來源有限，應用受限。組織工程技術是修復周圍神經損傷的有效方法，迄今已有大量相關文獻報道，導管支架材料中復合生長因子能有效促進損傷神經的再生和修復，但存在生長因子的劑量及在構建材料中易失活等問題[2-4]。膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，有利于細胞存活、增殖和分化[5]，被廣泛用于神經缺損修復[6-11]。紅景天苷是中藥紅景天的主要成分之一，具有抗氧化和對神經細胞的保護作用 [12]，我們前期研究發現，紅景天苷能誘導BMSCs向神經元細胞定向分化，并促進細胞分泌NGF[13-15]。
本實驗利用紅景天苷作為緩釋藥物替代生長因子，構建復合紅景天苷微球的膠原蛋白多孔神經導管支架材料芯層，以靜電紡絲技術構建膠原蛋白/聚己內酯（polycaprolactone，PCL）納米纖維神經導管支架材料殼層，利用京尼平交聯使芯層與殼層結合構建紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管；并通過動物實驗評價該復合神經導管對坐骨神經缺損修復的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2月齡健康雌性Wistar大鼠38只，體質量190～210 g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供。
PCL、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[ploy（D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]、六氟異丙醇（Sigma公司，美國）；紅景天苷（中國食品藥品檢定研究所）；京尼平（和光純藥工業株式會社，日本）；膠原蛋白（2%wt，豬皮中提取）由本實驗室自制；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA；天津市恒興化學試劑公司）；SABC免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。DT-1003高壓靜電紡絲機（大連鼎通科技發展有限公司）；Keypoint-W肌電誘發電位儀（Medtronic公司，美國）。
1.2 紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管的制備
1.2.1 紅景天苷微球制備及緩釋效果評價
利用W/O/W方法制備紅景天苷微球。配制1.25 mg/mL紅景天苷水溶液、25 mg/mL PLGA二氯甲烷溶液及1%PVA水溶液備用；量取2.4 mL紅景天苷水溶液與4.8?mL PLGA二氯甲烷溶液混合后，采用超聲使其成為乳濁液；用注射器將7.2 mL乳濁液緩慢注入24?mL PVA水溶液中，在磁力攪拌機上攪拌同時進行超聲；最后置于通風櫥中磁力攪拌4 h，以離心半徑13 cm、1 000 r/min離心10 min，冷凍干燥收集微球。取10 mg微球加入10 mL蒸餾水中，置于37℃恒溫搖床；于1、4、8、12、24 h分別取樣保存，之后1 個月內每隔24 h取樣1次；利用紫外分光光度計檢測其濃度，計算緩釋率。
1.2.2 神經導管殼層的制備
取0.6 g凍干膠原蛋白、0.3 g PCL置于50 mL錐形瓶中，用10 mL六氟異丙醇溶解；采用高壓靜電紡絲機，將膠原蛋白/PCL溶液制成內徑2 mm、外徑2.25 mm、長15 mm的導管殼層，常溫干燥。具體參數：電壓14 kV，接收距離12 cm，流速1 mL/h。掃描電鏡觀察殼層纖維結構及直徑。
1.2.3 神經導管芯層的制備
取10、20、40 μg紅景天苷微球分別與1 mL膠原蛋白混合，利用自制模具制備單孔狀含膠原蛋白和紅景天苷微球的導管芯層，同時制備單純膠原蛋白芯層，冷凍干燥。掃描電鏡觀察芯層結構。
1.2.4 復合神經導管構建
將上述不同濃度的紅景天苷/膠原蛋白或單純膠原蛋白芯層嵌套入殼層，1%京尼平37℃交聯1 h，無水乙醇洗10 min，水洗10?min×3次，—40℃真空冷凍干燥后封裝，60Co照射滅菌后備用（圖 1）。掃描電鏡觀察交聯后復合神經導管殼層及芯層結構。
圖1
紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管大體觀察 ? ?圖 2 20 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管修復神經缺損后 ? ?圖 3 紅景天苷微球的累計緩釋率 ? ?圖 4 掃描電鏡觀察神經導管 ?交聯前殼層（×2 000） ?交聯后殼層（×2 000） ?交聯前芯層橫截面（×35） 箭頭示孔道 ?交聯后芯層縱截面（×35） 箭頭示孔道 ? ?圖 5 術后6個月A～D組再生神經大體觀察箭頭示近端神經 ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ?E組
Figure1.
General observation of the salidroside/collagen/PCL nerve conduit ? ?Fig. 2 Bridging nerve defect with 20 μg/mL salidroside/collagen/PCL nerve conduit ? ?Fig. 3 Cumulative release rate of salidroside microsphere ? ?Fig. 4 SEM observation of the nerve conduit ?Pre cross-linked shell layer (×2 000) ?Cross-linked shell layer (×2 000) ?Cross-section of pre cross-linked core layer (×35) Arrow indicated the channel ?Longitudinal section of pre cross-linked core layer (×35) Arrow indicated the channel ? ?Fig. 5 General observation of regenerative nerve in each group at 6 months after operation Arrow indicated connection point between proximal nerve and nerve conduit ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E
1.3 動物模型制備及分組
將38只大鼠隨機分為5組，其中A、B、C、D組各9只，E組2只。各組大鼠以10%水合氯醛腹腔注射（0.3 mL/100 g）麻醉后，右后肢臀部及大腿備皮，分離暴露并橫斷切除15 mm長坐骨神經，制備坐骨神經缺損模型。各組分別采用以下神經導管或自體神經橋接缺損，8-0縫合線縫合：A組膠原蛋白/PCL復合神經導管，B組10 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管，C組20 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管，D組40 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL神經導管，E組自體神經。見圖 2。3-0縫合線逐級縫合肌肉、皮膚，聚維酮碘溶液消毒。術后常規飼養。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察各組大鼠存活情況、切口愈合、有無感染發生，以及肢體運動恢復情況。
1.4.2 坐骨神經運動功能指數（sciatic functional index，SFI）評價
術后1、3、6個月A～D組各取6只大鼠，E組取2只大鼠，將大鼠雙前肢固定于木板上，后肢固定正常側，用直尺分別測量手術側及正常側足印長度（print length，PL）、足趾寬度（toe spread，TS）和中間足趾距（intermediary toe spread，IT）。PL：足跟至足尖的距離；TS：第1趾至第5趾連線距離；IT：第2趾至第4趾連線距離。參照以下公式計算SFI[16]：SFI=—?38.8×[（EPL－NPL）/NPL]+109.5×[（ETS－NTS）/NTS]+13.3×[（EIT－NIT）/NIT]－8.8；其中E為手術側，N為正常側。SFI為0表示神經功能正常，—?100表示神經功能完全喪失。
1.4.3 大體觀察
術后6個月各組大鼠SFI測量后，同上法麻醉，按原手術切口入路，大體觀察各組導管兩端連接及再生神經情況。
1.4.4 神經電生理檢測
大體觀察后，采用肌電誘發電位儀以100 mA電流于再生神經近端進行刺激，誘發動作電位，并記錄潛伏期（latency，LAT）、傳導速度（conduction velocity，CV），計算兩指標比值（LAT/CV）反映神經傳導功能。
1.4.5 組織學及免疫組織化學染色觀察
神經電生理檢測后處死各組大鼠，分離并切取長約18 mm再生神經（兩端保留部分自體神經），置于10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，光鏡下觀察細胞生長及材料降解情況。部分切片參照免疫組織化學染色試劑盒說明書，行S-100和外周髓鞘蛋白0（peripheral myelin protein 0，P0）免疫組織化學染色，光鏡下觀察陽性染色呈棕黃色。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行免疫組織化學染色定量評價。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 紅景天苷微球緩釋效果評價
紅景天苷微球于3 d出現突釋，累計緩釋率為41.57%；13 d后緩釋趨于平穩，達76.59%，可持續緩釋至16 d。見圖 3。
2.2 掃描電鏡觀察神經導管
掃描電鏡觀察示，神經導管殼層交聯前為無序排列的纖維結構，纖維直徑為200～700 nm（圖 4a）；交聯后纖維間相互粘連、皺縮、致密且有大小不等孔隙（圖 4b）。神經導管芯層交聯前結構疏松，呈多孔蜂窩狀，可見孔道（圖 4c）；交聯后膠原呈多孔板層結構，多孔道清晰可見，芯層材料中可見大小不等孔隙（圖 4d）。
2.3 動物體內植入觀察
2.3.1 一般情況
各組大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好，無明顯感染現象。A～D組術側足部于1個月左右出現潰瘍，其中A組最嚴重。各組后肢支持功能正常，足部伸縮功能未恢復。
2.3.2 SFI評價
組間比較：術后1、3、6個月，E組SFI均顯著高于A～D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。術后1個月，B、C、D組顯著高于A組（P<0.05），B、C、D組間差異無統計學意義（P>0.05）；3個月，A～D組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；6個月，C組顯著高于A、B、D組，A、B組高于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05），A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。組內比較：除C、E組術后1、3、6個月SFI比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組組內各時間點間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組大鼠SFI比較（2.3.3 大體觀察
術后6個月，B、C組導管支架兩端與神經連接良好，連接處神經較粗；A、D組僅近端連接良好，連接處神經較細。A～D組導管兩端材料均降解明顯，其中C組殘余導管材料最少，其材料殘余量由少到多依次為A、B、D組。E組再生神經狀態良好，神經粗細程度接近正常狀態。見圖 5。
2.3.4 神經電生理檢測
術后6個月，A、B、C、D、E組LAT/CV分別為1.74±0.05、1.70±0.12、1.29±0.19、1.96±0.11、1.10±0.13。C、E組LAT/CV顯著低于A、B、D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、E組間以及A、B、D組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3.5 組織學觀察
術后6個月，HE染色示A～D組導管支架芯層材料完全降解，有神經纖維形成；B、C、E組神經纖維組織明顯多于A、D組，且C組神經纖維排列較B組緊密，與E組排列相近，但缺少神經內膜包裹神經纖維。見圖 6。
圖2
術后6個月各組組織學觀察（HE×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ?E組 ? ?圖 7 術后6個月各組P0免疫組織化學染色觀察（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ?E組 ? ?圖 8 術后6 個月各組S-100免疫組織化學染色觀察（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ?E組
Figure2.
Histological observation of nerve fibers in each group at 6 months after operation (HE×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ? ?Fig. 7 Immunohistochemical staining of P0 protein in each group at 6 months after operation (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ? ?Fig. 8 Immunohistochemical staining of S-100 protein in each group at 6 months after operation (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E
2.3.6 免疫組織化學染色觀察
術后6個月，各組均可見S-100及P0蛋白表達（圖 7、8）。其中B、C、E組P0和S-100表達水平均顯著高于A、D組，且E組高于B、C組，C組高于B組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D組間比較S-100表達水平差異無統計學意義（P>0.05），但A組P0表達水平低于D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
術后6個月各組S-100及P0表達水平比較（3 討論
神經導管作為修復神經缺損的組織工程支架材料已有大量研究報道，Isaacs等[17]研究發現神經導管直徑為2 mm時修復效果為佳。本實驗采用靜電紡絲技術構建膠原蛋白/PCL神經導管殼層，導管支架材料的芯層嵌套于殼層中形成復合支架材料。構建上述材料的原因，一是具有多孔道的芯層材料中包被的紅景天苷微球可通過其緩釋作用促進神經再生；二是通過靜電紡絲的殼層材料具有一定孔隙，有利于神經修復過程中營養物和組織代謝物的交換，同時引導神經沿一定方向生長。
本實驗結果顯示，術后6個月，紅景天苷/膠原蛋白組成的芯層完全降解，所占區域被再生神經組織完全替代；膠原蛋白/PCL電紡的殼層大部分被降解，殘留材料中有大量細胞侵入，提示構建的神經導管支架材料具有良好的組織相容性和可降解性，能夠有效引導缺損神經的再生。且采用20 μg/mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管及自體坐骨神經移植后，大鼠運動功能恢復效果優于其他神經導管修復，提示合適劑量的紅景天苷有助于損傷神經再生和功能恢復。
P0是周圍神經髓鞘結構的主要成分，也是髓鞘膜中最豐富的蛋白，其主要功能是保護神經和促進有效神經沖動傳播。神經修復后存在P0表達，表明新生神經有髓鞘形成，由于P0表達能夠影響神經髓鞘結構的完整性和功能，P0表達水平越高，新生神經髓鞘的結構越完整，其神經傳導的功能恢復越優。本實驗結果顯示，術后6個月，20?μg/ mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管修復大鼠坐骨神經缺損后，P0表達水平明顯高于其他神經導管修復。S-100主要分布于中樞神經系統和周圍神經系統的星形膠質細胞和雪旺細胞等組織中，周圍神經中S-100為雪旺細胞標志蛋白。本實驗中20?μg/ mL紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管修復后，S-100表達水平亦顯著增加。以上結果提示，與紅景天苷濃度為10?μg/mL及40?μg/mL的復合神經導管相比，20?μg/mL復合神經導管修復大鼠坐骨神經缺損后，可獲得較好效果。分析原因可能與低劑量紅景天苷對神經再生無明顯影響，而高劑量紅景天苷對神經的再生有一定抑制作用有關。
周圍神經損傷修復中神經導管必須滿足生物相容性、降解性良好，易于細胞生長、黏附，能促進神經細胞增殖、分化[18]。膠原蛋白、PCL作為神經導管支架材料具有良好的生物相容性且成本低 [18-19]。有研究證明，PCL與膠原蛋白結合后降解性能及生物相容性良好，降解周期為3～6個月[20]，所以膠原蛋白/PCL復合神經導管可滿足神經細胞再生所需。本實驗制備的神經導管芯層孔隙可提供神經細胞生長空間，其中所含的膠原蛋白有利于細胞黏附、增殖；釋放出的紅景天苷可促進細胞分泌NGF，有利于神經細胞增殖、分化。因此采用紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管在修復過程中可確保細胞處于生長有利的微環境中，保證了神經修復效果。
綜上述，本實驗構建的紅景天苷/膠原蛋白/PCL復合神經導管具有修復周圍神經損傷的潛力，通過進一步研究和優化能獲得理想的周圍神經損傷修復支架材料。
