引用本文： 張曉敏, 宋學文, 王維, 李振珺, 趙紅斌. 凹凸棒石/Ⅰ型膠原/聚己內酯復合修復兔骨缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(5): 626-633. doi: 10.7507/1002-1892.20160126 復制
隨著骨組織工程的發展，研發新型仿生復合材料修復骨缺損成為研究熱點[1-2]。材料的結構及理化性質決定了其能否作為骨組織工程支架材料[3]。膠原是骨組織主要成分，生物相容性良好，但力學強度差，難以維持形狀，極易降解[4-5]。聚己內酯[poly（caprolactone），PCL]黏性大，可增強材料的機械性能，但生物活性不高，缺乏骨誘導性，需要與其他材料復合使用[6-7]。凹凸棒石（attapulgite，ATP）是一種具有層鏈狀結構的天然礦物質，富含鎂、鋁、硅等元素，ATP晶體呈纖維狀、棒狀，潮濕時具有黏性和可塑性，干燥后收縮小且不產生龜裂，硬度大，具有納米材料屬性，內部多孔道，有極大的比表面積和一定的離子交換性[8-10]。本實驗采用溶液澆鑄-粒子濾瀝法制備ATP/Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）/PCL支架材料，并用于修復兔橈骨缺損，觀察該支架材料修復骨缺損能力，旨在探索一種修復骨缺損的新型仿生復合材料。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級2月齡雄性日本大耳白兔24只，體質量1.5～2.0 kg，平均1.78 kg，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供。
ColⅠ（豬皮中提取）、ATP由中國科學院蘭州化學物理研究所提供；六氟異丙醇（純度≥99%、濃度1.596 g/mL）、PCL（Sigma-Aldrich公司，美國）。冷凍干燥機（中國軍事醫學科學院實驗儀器廠）；JSM-5600LV低真空掃描電鏡（JEOL公司，日本）；電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；Micro-CT （GE公司，美國）。
1.2 支架材料的制備
按3∶2比例分別取ColⅠ 0.9 g、PCL 0.6 g溶于15?mL六氟異丙醇，形成濃度為0.1%（W/V）混合溶液；添加0.64 g ATP，磁力攪拌器攪拌過夜。攪拌狀態下加入2.5 g NaCl作為致孔劑，超聲分散使其均勻分布。將混合物倒入玻璃皿中持續攪拌，使六氟異丙醇揮發，直至混合物可塑形，裝入模具中，通風廚中放置3～5 h，置37℃烘箱中烘干24 h，盡量除去殘余的六氟異丙醇。超純水脫鹽72 h，0.1%AgNO3檢測洗脫液至無鹽洗出，冷凍，真空干燥，獲得ATP/ColⅠ/PCL支架材料。另制備ColⅠ/PCL支架材料作為對照，除不添加ATP外，其余操作步驟與ATP/ColⅠ/PCL支架材料制備方法一致。材料制備成直徑4 mm、長15?mm的圓柱狀。掃描電鏡觀察兩種支架材料結構及孔隙大小。60Co照射后，常溫密封保存備用。
1.3 實驗分組及方法
取24只日本大耳白兔制備雙側橈骨缺損模型。具體方法：耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（0.3?mL/ kg）麻醉后，兩側前肢消毒，于雙側橈骨部位縱行切開皮膚，分離暴露橈骨，使用電鉆制備長15?mm的橈骨缺損模型（圖 1a）。根據處理方法不同，將動物模型隨機分為3組，其中A組6只（12側），缺損不作任何處理作為對照；B、C組各9只（18側），于缺損處分別植入長15?mm的ColⅠ/PCL、ATP/ColⅠ/PCL支架材料（圖 1b）。逐層縫合切口，1%聚維酮碘溶液消毒。術后7 d內每天肌肉注射40萬U青霉素預防感染。相同飼養環境下單籠飼養。
圖1
動物模型制備示意圖 ?制備長度為15 mm的橈骨缺損 ?C組植入ATP/ColⅠ/PCL支架材料修復骨缺損 ? ?圖 2 兩種支架材料掃描電鏡觀察（×200） ?ColⅠ/PCL支架材料 ?ATP/ColⅠ/PCL支架材料 ? ?圖 3 術后各時間點各組X線片觀察箭頭示骨缺損處 ?術后4周A組 ?術后4周B組 ?術后4周C組 ?術后8周A組 ?術后8周B組 ?術后8周C組 ?術后12周A組 ?術后12周B組 ?術后12周C組 ? ?圖 4 術后12周各組缺損部位大體觀察箭頭示骨缺損處 ?A組 ?B組 ?C組
Figure1.
Schematic diagram?of animal model preparation ?Radius defect of 15 mm in length ?ATP/Col I/PCL scaffold in bone defect area of group C ? ?Fig. 2 SEM observation of two kinds of scaffolds (×200) ?Col I/PCL scaffold ?ATP/Col I/PCL scaffold ? ?Fig. 3 X-ray exams after operation Arrow indicated bone defect area ?Group A at 4 weeks ?Group B at 4 weeks ?Group C at 4 weeks ?Group A at 8?weeks ?Group B at 8 weeks ?Group C at 8 weeks ?Group A at 12 weeks ?Group B at 12 weeks ?Group C at 12 weeks ? ?Fig. 4 General observation of defect area at 12 weeks after operation Arrow indicated bone defect area ?Group A ?Group B ?Group C
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察各組動物存活、切口愈合、有無感染發生及其飲食、活動情況。
1.4.2 X線片觀察
術后4、8、12周各組動物固定四肢后，攝X線片觀察骨缺損修復情況。
1.4.3 大體觀察
術后12周X線片觀察后，采用空氣栓塞法處死各組動物，沿原手術切口入路，取前臂橈骨和尺骨，大體觀察支架材料周圍組織有無腫脹、炎性反應癥狀。
1.4.4 掃描電鏡觀察
大體觀察后B、C組隨機選取3個樣本，置于2.5%戊二醛溶液固定，脫水制樣，冷凍干燥，離子濺射儀離子表面噴金，掃描電鏡觀察支架材料表面結構的變化。
1.4.5 Micro-CT觀測
術后12周A組取4個樣本，B、C組各取6個樣本，置于4%甲醛溶液固定，電鋸鋸除橈骨兩端多余骨組織，僅保留缺損部位或材料植入部位分別向兩端延伸0.5～1.0 cm。標本行Micro-CT掃描，觀察骨缺損修復效果，測量橈骨缺損部位新生骨體積（new bone volume，BV）、骨礦物質含量（bone mineral content，BMC）、組織礦含量（tissue mineral content，TMC）及骨小梁連接密度（connectivity density，Coon.D.）。
1.4.6 組織學及免疫組織化學染色觀察
術后12周各組取4個樣本，常規5% EDTA-Na2脫鈣，脫水、石蠟包埋、切片，片厚5 μm。取相同部位組織切片行HE、Masson染色，鏡下分別觀察細胞浸潤、新骨形成以及材料降解情況。取相同部位組織切片，采用SABC法行免疫組織化學染色，具體步驟：切片脫蠟至水，3%H2O2室溫作用10 min，枸櫞酸鹽緩沖液修復，滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫作用20?min；滴加用PBS以1∶200稀釋的ALP、ColⅠ、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）一抗，4℃過夜；滴加二抗，37℃電熱恒溫箱中作用30 min；滴加SABC試劑，37℃電熱恒溫箱中作用30 min；滴加DAB顯色液，避光作用10 min至顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復染；脫水、透明、封片。光鏡下分別觀察ALP、ColⅠ、OPN表達及新生骨組織形成情況，以正常骨組織作為陽性對照。
1.5 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，兩種支架材料均為多孔結構，孔隙直徑為200～500 μm。其中，ColⅠ/PCL支架材料表面光滑、結構疏松（圖 2a）；ATP/ColⅠ/PCL支架材料表面粗糙、結構致密（圖 2b），有利于細胞黏附。
2.2 體內植入觀察
2.2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成。動物均于術后1 d恢復正常飲食，切口愈合良好，無紅腫、化膿、感染等現象，4周后肢體行動均恢復。
2.2.2 X線片觀察
術后4 周，A組缺損界限明顯；B、C組缺損區骨密度低于周圍正常骨組織，其中B組骨密度低于C組，骨斷端間隙可見，C組支架材料與骨斷端間隙模糊，缺損部位形成大量骨痂。8周，A組缺損接近宿主骨處發生骨融合，邊緣界限模糊；B、C組缺損區骨密度高于4周時，其中B組骨斷端與支架材料界限模糊，C組支架材料與周圍骨組織融合，初步形成骨干結構，骨皮質連續，部分骨髓腔連通。12周，A組缺損界限不明顯，但骨皮質仍不連續；B組骨斷端與支架材料間隙消失，缺損區范圍較8周時縮小，骨密度也高于8周時，有骨痂形成；C組缺損區骨密度與周圍正常骨組織相近，支架材料植入部位形成的凹面與周圍骨床處于同一水平面上，骨髓腔連通，骨缺損大部分被修復。見圖 3。
2.2.3 大體觀察
術后12周，A組缺損部位被結締組織填滿；B、C組支架材料植入部位無炎性反應，其中B組支架材料被組織包裹，C組支架材料與周圍組織良好融合。見圖 4。
2.2.4 掃描電鏡觀察
術后12周，B、C組支架材料表面與孔隙間均被大量細胞和纖維組織覆蓋填充，提示兩種支架材料具有良好組織相容性。見圖 5。
圖2
術后12周B、C組掃描電鏡觀察（×500） ?B組 ?C組 ? ?圖 6 術后12周各組Micro-CT掃描觀察 ?A組 ?B組 ?C組 ? ?圖 7 術后12周各組HE染色觀察（×200） 黑箭頭示支架材料，藍箭頭示纖維組織，紅箭頭示新生骨 ?A組 ?B組 ?C組 ? ?圖 8 術后12周各組Masson染色觀察（×200） 黑箭頭示支架材料，黃箭頭示膠原纖維組織，紅箭頭示新生骨 ?A組 ?B組 ?C組
Figure2.
SEM observation of groups B and C at 12 weeks after operation (×500) ?Group B ?Group C ? ?Fig. 6 Micro-CT scanning observation of each group at 12 weeks after operation ?Group A ?Group B ?Group C ? ?Fig. 7 HE staining observation of each group at 12?weeks after operation (×200) Black arrow indicated scaffold,blue arrow indicated fiber,red arrow indicated new bone ?Group A ?Group B ?Group C ? ?Fig. 8 Masson staining observation of each group at 12 weeks after operation (×200) Black arrow indicated scaffold,yellow arrow indicated collagen fiber,red arrow indicated new bone ?Group A ?Group B ?Group C
2.2.5 Micro-CT觀測
術后12周Micro-CT掃描觀察示，白色區域為宿主骨，黃色區域為新生骨。其中C組新生骨覆蓋了大部分缺損區域，修復效果最好，其次為B組，A組修復效果最差。見圖 6。C組BV、BMC、TMC、Conn.D.顯著高于A、B組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；B組各指標均高于A組，除BMC外，BV、TMC、Conn.D.比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
術后12周各組BV、BMC、TMC及Conn.D.比較（2.2.6 組織學觀察
術后12 周HE染色示，A組骨缺損處被致密纖維組織覆蓋；B組支架材料大部分降解，材料孔隙中被骨髓細胞填充，周圍有大量纖維組織形成；C組支架材料部分降解，孔隙中大量骨細胞增生，材料區域內有新骨形成。見圖 7。Masson染色示，A組缺損區緊鄰正常骨部位有少量新骨形成；B組支架材料降解區域內有膠原纖維組織形成，材料周圍有少量新骨形成；C組支架材料區域內有大面積新骨形成。見圖 8。
2.2.7 免疫組織化學染色觀察
術后12 周，ALP染色示，A組缺損區緊鄰正常骨組織部位有ALP表達；B組支架材料大部分降解，ALP表達量減弱，但仍強于A組；C組支架材料部分降解，間隙中大量骨細胞填充，細胞核呈藍色，ALP表達較B組減弱。見圖 9。
圖3
術后12周各組免疫組織化學染色觀察ALP表達（×400） 黑箭頭示支架材料，紅箭頭示ALP表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?陽性對照 ? ?圖 10 術后12周各組免疫組織化學染色觀察ColⅠ表達（×400） 黑箭頭示支架材料，紅箭頭示ColⅠ表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?陽性對照 ? ?圖 11 術后12周各組免疫組織化學染色觀察OPN表達（×400） 黑箭頭示支架材料，紅箭頭示OPN表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?陽性對照
Figure3.
Immunohistochemical staining observation of ALP expression in each group at 12 weeks after operation (×400) Black arrow indicated scaffold,red arrow indicated ALP expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Positive control ? ?Fig. 10 Immunohistochemical staining observation of Col I expression in each group at 12 weeks after operation (×400) Black arrow indicated scaffold,red arrow indicated Col I expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Positive control ? ?Fig. 11 Immunohistochemical staining observation of OPN expression in each group at 12 weeks after operation (×400) Black arrow indicated scaffold,red arrow indicated OPN expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Positive control
ColⅠ染色示，A組缺損區緊鄰正常骨部位ColⅠ微弱表達，缺損部位被大量纖維組織填充；B組支架材料區域內ColⅠ表達較A組增強；C組ColⅠ表達顯著強于B組，新生骨組織呈棕色。見圖 10。
OPN染色示，A組缺損區域有大量細胞填充，周圍組織出現黃色，OPN微弱表達；B組支架材料大部分降解，黃棕色組織增多，OPN表達顯著強于A組，但OPN表達強度不均一；C組有大片新生骨組織呈深黃色陽性表達，OPN表達明顯增強。見圖 11。
3 討論
理想的骨組織工程材料應具有以下特征：三維多孔結構、一定的力學強度、可加工性和可塑性、合適的降解速率、安全無毒、不引起炎性和免疫排斥反應、良好的生物相容性和骨誘導性等[11-12]。單一材料很難滿足全部特征，因此研究復合材料以改善材料生物學性能成為熱點[13-15]。研究表明[16-20]，一定濃度鎂離子可促進BMP-2表達，具有誘導動物新骨生成能力；不同濃度硅離子在細胞培養基質中能誘導出現不同程度的礦化鈣結節；生物活性材料硅能夠強烈誘導體外成骨分化和類骨細胞的礦物沉積；以硅為基礎的生物陶瓷、生物玻璃和納米硅材料能夠刺激成骨分化和體內骨生成。有研究將復合ATP的硅酸鹽材料用于早期胃癌治療[21]，但將ATP用于組織工程材料尚罕見報道。富含與骨形成相關的硅、鈣、鎂等多種離子的ATP具有骨誘導性，將其應用于骨替代材料是一種新的探索。本實驗采用ATP、ColⅠ、PCL成功制備復合支架材料，掃描電鏡觀察示ATP/ColⅠ/PCL支架材料為多孔結構，孔徑為200～500 μm。多孔結構能提供較大的表面積和空間，促進細胞黏附生長，利于細胞外基質沉積、營養物質交換、代謝產物排出和血管生成[22]。當支架孔隙率達70%，孔徑為100～900 μm時，對于負載于其上的細胞，特別是成骨細胞的增殖與分化極其有利[23]。
將制備的支架材料植入兔體內修復橈骨缺損后，手術區域均未感染，切口愈合良好，取材大體觀察也未見明顯紅腫等情況，提示支架材料不會引起細胞壞死等不良反應。掃描電鏡觀察示，材料表面與孔隙中被大量組織覆蓋，進一步表明支架材料生物相容性好。組織學觀察示，12周時ATP/ColⅠ/PCL支架材料降解區域內出現新生骨組織，表明ATP具有骨誘導能力，可誘導新骨形成。同時，ColⅠ/PCL材料基本降解，但復合ATP后，ATP/ColⅠ/PCL支架材料降解速度較B組減慢，可在缺損修復過程中較長時間內為新骨長入提供支撐作用。ALP、ColⅠ、OPN是成骨細胞標志分子，在分化早期主要為ALP表達，其被認為是細胞外基質成熟的早期標志；分化晚期，細胞進入礦化期，細胞內的ALP活性下降，而與細胞外基質中羥磷灰石沉積相關的OPN表達顯著上調[24-25]。ColⅠ是骨組織中的主要成分，骨骼形成時必須有大量膠原蛋白為其提供必要的支架，因此，ColⅠ表達會隨骨缺損修復顯著增強。本實驗免疫組織化學染色結果示，術后12周，A組缺損部位被結締組織填充，ALP、OPN、ColⅠ表達微弱，修復不明顯；B組ALP、OPN、ColⅠ的表達增強，修復效果較A組好；C組ALP表達減弱，OPN、ColⅠ表達強于B組，支架材料可誘導新骨形成，修復效果最好。Micro-CT觀測示，C組缺損部位的礦化區域、新生骨體積及新生骨量均顯著高于其他兩組，缺損修復效果最好。
ATP/ColⅠ/PCL材料修復骨缺損的可能機制：①ColⅠ 可促進成骨細胞增殖，誘導礦物沉積；②ATP富含礦物質，在誘導新骨形成過程中起著重要作用；③ATP具有納米材料屬性，比表面積較大，利于更多成骨細胞黏附生長及組織形成；④ATP含有鈉、鈣、鐵等陽離子，大部分陽離子、水分子和一定大小的有機分子均可直接被吸附進孔道中，這些離子與分子可能作為信號分子刺激并打開與骨形成有關的信號通路；⑤ATP具有介于鏈狀結構和層狀結構之間的結構，含兩層硅氧四面體和一層鋁氧八面體，其結構中存在晶格置換，這種結構也可能對新骨形成具有一定作用。
綜上述，本實驗采用溶液澆鑄-粒子濾瀝方法成功制備ATP/ColⅠ/PCL復合支架材料，經植入兔體內觀察，進一步驗證其具有促進骨缺損修復的能力，有望作為一種理想骨組織工程材料。下一步需結合材料降解速率與修復效果明確ATP、ColⅠ、PCL的最佳比例；并聯合骨生長因子、BMP及血管生長因等促進血管化，加快新骨形成。
隨著骨組織工程的發展，研發新型仿生復合材料修復骨缺損成為研究熱點[1-2]。材料的結構及理化性質決定了其能否作為骨組織工程支架材料[3]。膠原是骨組織主要成分，生物相容性良好，但力學強度差，難以維持形狀，極易降解[4-5]。聚己內酯[poly（caprolactone），PCL]黏性大，可增強材料的機械性能，但生物活性不高，缺乏骨誘導性，需要與其他材料復合使用[6-7]。凹凸棒石（attapulgite，ATP）是一種具有層鏈狀結構的天然礦物質，富含鎂、鋁、硅等元素，ATP晶體呈纖維狀、棒狀，潮濕時具有黏性和可塑性，干燥后收縮小且不產生龜裂，硬度大，具有納米材料屬性，內部多孔道，有極大的比表面積和一定的離子交換性[8-10]。本實驗采用溶液澆鑄-粒子濾瀝法制備ATP/Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）/PCL支架材料，并用于修復兔橈骨缺損，觀察該支架材料修復骨缺損能力，旨在探索一種修復骨缺損的新型仿生復合材料。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級2月齡雄性日本大耳白兔24只，體質量1.5～2.0 kg，平均1.78 kg，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供。
ColⅠ（豬皮中提取）、ATP由中國科學院蘭州化學物理研究所提供；六氟異丙醇（純度≥99%、濃度1.596 g/mL）、PCL（Sigma-Aldrich公司，美國）。冷凍干燥機（中國軍事醫學科學院實驗儀器廠）；JSM-5600LV低真空掃描電鏡（JEOL公司，日本）；電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；Micro-CT （GE公司，美國）。
1.2 支架材料的制備
按3∶2比例分別取ColⅠ 0.9 g、PCL 0.6 g溶于15?mL六氟異丙醇，形成濃度為0.1%（W/V）混合溶液；添加0.64 g ATP，磁力攪拌器攪拌過夜。攪拌狀態下加入2.5 g NaCl作為致孔劑，超聲分散使其均勻分布。將混合物倒入玻璃皿中持續攪拌，使六氟異丙醇揮發，直至混合物可塑形，裝入模具中，通風廚中放置3～5 h，置37℃烘箱中烘干24 h，盡量除去殘余的六氟異丙醇。超純水脫鹽72 h，0.1%AgNO3檢測洗脫液至無鹽洗出，冷凍，真空干燥，獲得ATP/ColⅠ/PCL支架材料。另制備ColⅠ/PCL支架材料作為對照，除不添加ATP外，其余操作步驟與ATP/ColⅠ/PCL支架材料制備方法一致。材料制備成直徑4 mm、長15?mm的圓柱狀。掃描電鏡觀察兩種支架材料結構及孔隙大小。60Co照射后，常溫密封保存備用。
1.3 實驗分組及方法
取24只日本大耳白兔制備雙側橈骨缺損模型。具體方法：耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（0.3?mL/ kg）麻醉后，兩側前肢消毒，于雙側橈骨部位縱行切開皮膚，分離暴露橈骨，使用電鉆制備長15?mm的橈骨缺損模型（圖 1a）。根據處理方法不同，將動物模型隨機分為3組，其中A組6只（12側），缺損不作任何處理作為對照；B、C組各9只（18側），于缺損處分別植入長15?mm的ColⅠ/PCL、ATP/ColⅠ/PCL支架材料（圖 1b）。逐層縫合切口，1%聚維酮碘溶液消毒。術后7 d內每天肌肉注射40萬U青霉素預防感染。相同飼養環境下單籠飼養。
圖1
動物模型制備示意圖 ?制備長度為15 mm的橈骨缺損 ?C組植入ATP/ColⅠ/PCL支架材料修復骨缺損 ? ?圖 2 兩種支架材料掃描電鏡觀察（×200） ?ColⅠ/PCL支架材料 ?ATP/ColⅠ/PCL支架材料 ? ?圖 3 術后各時間點各組X線片觀察箭頭示骨缺損處 ?術后4周A組 ?術后4周B組 ?術后4周C組 ?術后8周A組 ?術后8周B組 ?術后8周C組 ?術后12周A組 ?術后12周B組 ?術后12周C組 ? ?圖 4 術后12周各組缺損部位大體觀察箭頭示骨缺損處 ?A組 ?B組 ?C組
Figure1.
Schematic diagram?of animal model preparation ?Radius defect of 15 mm in length ?ATP/Col I/PCL scaffold in bone defect area of group C ? ?Fig. 2 SEM observation of two kinds of scaffolds (×200) ?Col I/PCL scaffold ?ATP/Col I/PCL scaffold ? ?Fig. 3 X-ray exams after operation Arrow indicated bone defect area ?Group A at 4 weeks ?Group B at 4 weeks ?Group C at 4 weeks ?Group A at 8?weeks ?Group B at 8 weeks ?Group C at 8 weeks ?Group A at 12 weeks ?Group B at 12 weeks ?Group C at 12 weeks ? ?Fig. 4 General observation of defect area at 12 weeks after operation Arrow indicated bone defect area ?Group A ?Group B ?Group C
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察各組動物存活、切口愈合、有無感染發生及其飲食、活動情況。
1.4.2 X線片觀察
術后4、8、12周各組動物固定四肢后，攝X線片觀察骨缺損修復情況。
1.4.3 大體觀察
術后12周X線片觀察后，采用空氣栓塞法處死各組動物，沿原手術切口入路，取前臂橈骨和尺骨，大體觀察支架材料周圍組織有無腫脹、炎性反應癥狀。
1.4.4 掃描電鏡觀察
大體觀察后B、C組隨機選取3個樣本，置于2.5%戊二醛溶液固定，脫水制樣，冷凍干燥，離子濺射儀離子表面噴金，掃描電鏡觀察支架材料表面結構的變化。
1.4.5 Micro-CT觀測
術后12周A組取4個樣本，B、C組各取6個樣本，置于4%甲醛溶液固定，電鋸鋸除橈骨兩端多余骨組織，僅保留缺損部位或材料植入部位分別向兩端延伸0.5～1.0 cm。標本行Micro-CT掃描，觀察骨缺損修復效果，測量橈骨缺損部位新生骨體積（new bone volume，BV）、骨礦物質含量（bone mineral content，BMC）、組織礦含量（tissue mineral content，TMC）及骨小梁連接密度（connectivity density，Coon.D.）。
1.4.6 組織學及免疫組織化學染色觀察
術后12周各組取4個樣本，常規5% EDTA-Na2脫鈣，脫水、石蠟包埋、切片，片厚5 μm。取相同部位組織切片行HE、Masson染色，鏡下分別觀察細胞浸潤、新骨形成以及材料降解情況。取相同部位組織切片，采用SABC法行免疫組織化學染色，具體步驟：切片脫蠟至水，3%H2O2室溫作用10 min，枸櫞酸鹽緩沖液修復，滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫作用20?min；滴加用PBS以1∶200稀釋的ALP、ColⅠ、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）一抗，4℃過夜；滴加二抗，37℃電熱恒溫箱中作用30 min；滴加SABC試劑，37℃電熱恒溫箱中作用30 min；滴加DAB顯色液，避光作用10 min至顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復染；脫水、透明、封片。光鏡下分別觀察ALP、ColⅠ、OPN表達及新生骨組織形成情況，以正常骨組織作為陽性對照。
1.5 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，兩種支架材料均為多孔結構，孔隙直徑為200～500 μm。其中，ColⅠ/PCL支架材料表面光滑、結構疏松（圖 2a）；ATP/ColⅠ/PCL支架材料表面粗糙、結構致密（圖 2b），有利于細胞黏附。
2.2 體內植入觀察
2.2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成。動物均于術后1 d恢復正常飲食，切口愈合良好，無紅腫、化膿、感染等現象，4周后肢體行動均恢復。
2.2.2 X線片觀察
術后4 周，A組缺損界限明顯；B、C組缺損區骨密度低于周圍正常骨組織，其中B組骨密度低于C組，骨斷端間隙可見，C組支架材料與骨斷端間隙模糊，缺損部位形成大量骨痂。8周，A組缺損接近宿主骨處發生骨融合，邊緣界限模糊；B、C組缺損區骨密度高于4周時，其中B組骨斷端與支架材料界限模糊，C組支架材料與周圍骨組織融合，初步形成骨干結構，骨皮質連續，部分骨髓腔連通。12周，A組缺損界限不明顯，但骨皮質仍不連續；B組骨斷端與支架材料間隙消失，缺損區范圍較8周時縮小，骨密度也高于8周時，有骨痂形成；C組缺損區骨密度與周圍正常骨組織相近，支架材料植入部位形成的凹面與周圍骨床處于同一水平面上，骨髓腔連通，骨缺損大部分被修復。見圖 3。
2.2.3 大體觀察
術后12周，A組缺損部位被結締組織填滿；B、C組支架材料植入部位無炎性反應，其中B組支架材料被組織包裹，C組支架材料與周圍組織良好融合。見圖 4。
2.2.4 掃描電鏡觀察
術后12周，B、C組支架材料表面與孔隙間均被大量細胞和纖維組織覆蓋填充，提示兩種支架材料具有良好組織相容性。見圖 5。
圖2
術后12周B、C組掃描電鏡觀察（×500） ?B組 ?C組 ? ?圖 6 術后12周各組Micro-CT掃描觀察 ?A組 ?B組 ?C組 ? ?圖 7 術后12周各組HE染色觀察（×200） 黑箭頭示支架材料，藍箭頭示纖維組織，紅箭頭示新生骨 ?A組 ?B組 ?C組 ? ?圖 8 術后12周各組Masson染色觀察（×200） 黑箭頭示支架材料，黃箭頭示膠原纖維組織，紅箭頭示新生骨 ?A組 ?B組 ?C組
Figure2.
SEM observation of groups B and C at 12 weeks after operation (×500) ?Group B ?Group C ? ?Fig. 6 Micro-CT scanning observation of each group at 12 weeks after operation ?Group A ?Group B ?Group C ? ?Fig. 7 HE staining observation of each group at 12?weeks after operation (×200) Black arrow indicated scaffold,blue arrow indicated fiber,red arrow indicated new bone ?Group A ?Group B ?Group C ? ?Fig. 8 Masson staining observation of each group at 12 weeks after operation (×200) Black arrow indicated scaffold,yellow arrow indicated collagen fiber,red arrow indicated new bone ?Group A ?Group B ?Group C
2.2.5 Micro-CT觀測
術后12周Micro-CT掃描觀察示，白色區域為宿主骨，黃色區域為新生骨。其中C組新生骨覆蓋了大部分缺損區域，修復效果最好，其次為B組，A組修復效果最差。見圖 6。C組BV、BMC、TMC、Conn.D.顯著高于A、B組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；B組各指標均高于A組，除BMC外，BV、TMC、Conn.D.比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
術后12周各組BV、BMC、TMC及Conn.D.比較（2.2.6 組織學觀察
術后12 周HE染色示，A組骨缺損處被致密纖維組織覆蓋；B組支架材料大部分降解，材料孔隙中被骨髓細胞填充，周圍有大量纖維組織形成；C組支架材料部分降解，孔隙中大量骨細胞增生，材料區域內有新骨形成。見圖 7。Masson染色示，A組缺損區緊鄰正常骨部位有少量新骨形成；B組支架材料降解區域內有膠原纖維組織形成，材料周圍有少量新骨形成；C組支架材料區域內有大面積新骨形成。見圖 8。
2.2.7 免疫組織化學染色觀察
術后12 周，ALP染色示，A組缺損區緊鄰正常骨組織部位有ALP表達；B組支架材料大部分降解，ALP表達量減弱，但仍強于A組；C組支架材料部分降解，間隙中大量骨細胞填充，細胞核呈藍色，ALP表達較B組減弱。見圖 9。
圖3
術后12周各組免疫組織化學染色觀察ALP表達（×400） 黑箭頭示支架材料，紅箭頭示ALP表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?陽性對照 ? ?圖 10 術后12周各組免疫組織化學染色觀察ColⅠ表達（×400） 黑箭頭示支架材料，紅箭頭示ColⅠ表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?陽性對照 ? ?圖 11 術后12周各組免疫組織化學染色觀察OPN表達（×400） 黑箭頭示支架材料，紅箭頭示OPN表達 ?A組 ?B組 ?C組 ?陽性對照
Figure3.
Immunohistochemical staining observation of ALP expression in each group at 12 weeks after operation (×400) Black arrow indicated scaffold,red arrow indicated ALP expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Positive control ? ?Fig. 10 Immunohistochemical staining observation of Col I expression in each group at 12 weeks after operation (×400) Black arrow indicated scaffold,red arrow indicated Col I expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Positive control ? ?Fig. 11 Immunohistochemical staining observation of OPN expression in each group at 12 weeks after operation (×400) Black arrow indicated scaffold,red arrow indicated OPN expression ?Group A ?Group B ?Group C ?Positive control
ColⅠ染色示，A組缺損區緊鄰正常骨部位ColⅠ微弱表達，缺損部位被大量纖維組織填充；B組支架材料區域內ColⅠ表達較A組增強；C組ColⅠ表達顯著強于B組，新生骨組織呈棕色。見圖 10。
OPN染色示，A組缺損區域有大量細胞填充，周圍組織出現黃色，OPN微弱表達；B組支架材料大部分降解，黃棕色組織增多，OPN表達顯著強于A組，但OPN表達強度不均一；C組有大片新生骨組織呈深黃色陽性表達，OPN表達明顯增強。見圖 11。
3 討論
理想的骨組織工程材料應具有以下特征：三維多孔結構、一定的力學強度、可加工性和可塑性、合適的降解速率、安全無毒、不引起炎性和免疫排斥反應、良好的生物相容性和骨誘導性等[11-12]。單一材料很難滿足全部特征，因此研究復合材料以改善材料生物學性能成為熱點[13-15]。研究表明[16-20]，一定濃度鎂離子可促進BMP-2表達，具有誘導動物新骨生成能力；不同濃度硅離子在細胞培養基質中能誘導出現不同程度的礦化鈣結節；生物活性材料硅能夠強烈誘導體外成骨分化和類骨細胞的礦物沉積；以硅為基礎的生物陶瓷、生物玻璃和納米硅材料能夠刺激成骨分化和體內骨生成。有研究將復合ATP的硅酸鹽材料用于早期胃癌治療[21]，但將ATP用于組織工程材料尚罕見報道。富含與骨形成相關的硅、鈣、鎂等多種離子的ATP具有骨誘導性，將其應用于骨替代材料是一種新的探索。本實驗采用ATP、ColⅠ、PCL成功制備復合支架材料，掃描電鏡觀察示ATP/ColⅠ/PCL支架材料為多孔結構，孔徑為200～500 μm。多孔結構能提供較大的表面積和空間，促進細胞黏附生長，利于細胞外基質沉積、營養物質交換、代謝產物排出和血管生成[22]。當支架孔隙率達70%，孔徑為100～900 μm時，對于負載于其上的細胞，特別是成骨細胞的增殖與分化極其有利[23]。
將制備的支架材料植入兔體內修復橈骨缺損后，手術區域均未感染，切口愈合良好，取材大體觀察也未見明顯紅腫等情況，提示支架材料不會引起細胞壞死等不良反應。掃描電鏡觀察示，材料表面與孔隙中被大量組織覆蓋，進一步表明支架材料生物相容性好。組織學觀察示，12周時ATP/ColⅠ/PCL支架材料降解區域內出現新生骨組織，表明ATP具有骨誘導能力，可誘導新骨形成。同時，ColⅠ/PCL材料基本降解，但復合ATP后，ATP/ColⅠ/PCL支架材料降解速度較B組減慢，可在缺損修復過程中較長時間內為新骨長入提供支撐作用。ALP、ColⅠ、OPN是成骨細胞標志分子，在分化早期主要為ALP表達，其被認為是細胞外基質成熟的早期標志；分化晚期，細胞進入礦化期，細胞內的ALP活性下降，而與細胞外基質中羥磷灰石沉積相關的OPN表達顯著上調[24-25]。ColⅠ是骨組織中的主要成分，骨骼形成時必須有大量膠原蛋白為其提供必要的支架，因此，ColⅠ表達會隨骨缺損修復顯著增強。本實驗免疫組織化學染色結果示，術后12周，A組缺損部位被結締組織填充，ALP、OPN、ColⅠ表達微弱，修復不明顯；B組ALP、OPN、ColⅠ的表達增強，修復效果較A組好；C組ALP表達減弱，OPN、ColⅠ表達強于B組，支架材料可誘導新骨形成，修復效果最好。Micro-CT觀測示，C組缺損部位的礦化區域、新生骨體積及新生骨量均顯著高于其他兩組，缺損修復效果最好。
ATP/ColⅠ/PCL材料修復骨缺損的可能機制：①ColⅠ 可促進成骨細胞增殖，誘導礦物沉積；②ATP富含礦物質，在誘導新骨形成過程中起著重要作用；③ATP具有納米材料屬性，比表面積較大，利于更多成骨細胞黏附生長及組織形成；④ATP含有鈉、鈣、鐵等陽離子，大部分陽離子、水分子和一定大小的有機分子均可直接被吸附進孔道中，這些離子與分子可能作為信號分子刺激并打開與骨形成有關的信號通路；⑤ATP具有介于鏈狀結構和層狀結構之間的結構，含兩層硅氧四面體和一層鋁氧八面體，其結構中存在晶格置換，這種結構也可能對新骨形成具有一定作用。
綜上述，本實驗采用溶液澆鑄-粒子濾瀝方法成功制備ATP/ColⅠ/PCL復合支架材料，經植入兔體內觀察，進一步驗證其具有促進骨缺損修復的能力，有望作為一種理想骨組織工程材料。下一步需結合材料降解速率與修復效果明確ATP、ColⅠ、PCL的最佳比例；并聯合骨生長因子、BMP及血管生長因等促進血管化，加快新骨形成。
