引用本文： 孫寧, 黃益洲, 張憶, 皮晉魁, LawJaznie, 鄧力, 吳誠光. 人胎盤蛻膜基層來源MSCs參與裸鼠皮膚創面修復的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(5): 619-625. doi: 10.7507/1002-1892.20160125 復制
創傷、大面積燒傷、腫瘤切除后、褥瘡或代謝性疾病（如糖尿病）等均會造成嚴重皮膚軟組織缺損，目前臨床常用自體游離皮片移植、皮瓣移植、同種異體/異種皮移植和人工替代物覆蓋等方法修復，但這些方法存在造成新的創傷、供皮來源有限和免疫排斥等問題。近年來，應用MSCs修復皮膚損傷受到廣泛關注。MSCs是一類來源廣泛且具有多向分化潛能的細胞，研究發現移植的MSCs可在真皮組織中形成成纖維樣及血管內皮樣結構[1]；在表皮組織中可呈角朊細胞表型，促進創面愈合[2]。我們前期研究發現經裸鼠尾靜脈注射人胎盤蛻膜基層來源MSCs（placental decidua basalis derived MSCs，PDB-MSCs）后，細胞主要分布于肺、骨髓、肝臟等組織器官，注射3 d后被大量代謝（90%以上），但在180 d觀察期內仍有部分PDB-MSCs存在于骨髓、肺等組織器官[3]。提示外源性MSCs經靜脈注射后，部分細胞可長期存活并儲存于機體組織器官內，但如何被機體利用并發揮修復作用尚未明確。本研究采用裸鼠全層皮膚缺損模型，進一步探究預先儲存于機體內的PDB-MSCs能否被調動至皮膚缺損部位及其在皮膚全層缺損修復中的修復效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
胎盤組織由四川大學華西第二醫院收治的妊娠38～40周健康產婦自愿捐贈，術后無菌保存。4～5周齡健康雌性BALB/c裸鼠42只，體質量18～22?g，由成都達碩實驗動物有限公司提供。EDTA、H-DMEM（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；抗人CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-DR抗體（BD公司，美國）；抗人線粒體抗體（Abcam公司，英國）；辣根過氧化物酶（基因科技上海有限公司）。水套式CO2細胞培養箱（Thermo公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；流式細胞儀（Beckman公司，美國）。
1.2 PDB-MSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 細胞分離及培養
無菌環境下，將胎盤用PBS（pH7.4）洗凈，剝離胎盤蛻膜基層，剪為1～2?mm3小塊，加入酶混合液（含0.1%Ⅳ型膠原酶、0.5%胰蛋白酶、80 U/mL DNA酶的DMEM），37°C恒溫水浴震搖消化20 min，靜置后收集上清消化液；再次加入酶混合液重復以上步驟。混合2次消化液，移入裝有等體積人外周血淋巴細胞分離液的離心管中，以500×g離心30 min。吸取中間單核細胞層液體，加入等體積DMEM洗滌，250×g離心 5 min后以5 mL完全培養基（含10% FBS的H-DMEM）重懸，接種于T-25培養瓶中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。72?h后PBS清洗未貼壁細胞，之后每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，待生長達約80%融合時，用TNE（0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA-Na2液）消化貼壁細胞，按1∶3比例傳代，取第4代細胞進行后續實驗。
1.2.2 細胞鑒定
①成骨誘導：將第4代細胞以3×103個/cm2接種于放置血蓋片的6孔板中，加入3?mL完全培養基。置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，更換為3 mL成骨誘導液[3]進行誘導培養，每3天換液1次。誘導21 d后吸棄培養液，PBS清洗3次，行茜素紅染色觀察。以完全培養基培養的正常細胞作為對照。
②成脂誘導：同成骨誘導方法將第4代細胞接種于6孔板中，培養24 h后更換為成脂誘導液[3]進行誘導培養，每3天換液1次。誘導14 d后吸棄培養液，PBS清洗3次，行油紅O染色觀察。以完全培養基培養的正常細胞作為對照。
③特異性表面抗原表達分析：將第4代細胞以TNE消化洗滌后重懸于PBS中，制成濃度為1×107 個 /mL的單細胞懸液，分別取100 μL加入流式管中，并加入20 μL結合FITC或PE熒光標記的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166及HLA-DR抗體。室溫避光孵育30?min，PBS離心洗滌，棄上清后加入200 μL PBS混勻細胞沉淀，流式細胞儀檢測特異性表面抗原表達情況。
1.3 實驗分組及方法
取42只裸鼠隨機分為實驗組及對照組，每組21只。將第4代細胞經TNE消化后重懸于PBS中，制成濃度為5×106個/mL的單細胞懸液，經尾靜脈注射至實驗組裸鼠體內，每只注射200 μL；對照組同法注射等體積PBS。注射3 d后，兩組裸鼠制備全層皮膚缺損模型，具體方法：實驗動物經腹腔注射10%水合氯醛（5 μL/g）麻醉，背部消毒，用預先制備的硬紙板模型于背部制備1.5?cm×1.5 cm大小的全層皮膚缺損，聚維酮碘溶液消毒，無加壓包扎。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
細胞注射后及模型制備后，觀察兩組裸鼠存活及飲食等情況。
1.4.2 大體觀察
于模型制備后1、2、4、7、14、18、21、25、30?d，兩組大體觀察創面愈合情況。待創面開始脫痂后，兩組各時間點各取3只裸鼠，用透明薄膜覆蓋于創面并勾畫其形狀，通過小方格測量創面面積，并按以下公式計算創面愈合率：（原始創面面積－第n天創面面積）/原始創面面積×100%。
1.4.3 組織學觀察
術后1、7、14、21、30?d兩組各取3只裸鼠，麻醉處死后沿創面邊緣剪取部分創傷組織，4%中性甲醛固定48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋、切片，片厚4 μm。常規HE染色后，光鏡下觀察創面修復情況。
1.4.4 免疫熒光染色觀察
術后7、14、30 d實驗組取裸鼠創面剩余組織進行冰凍切片，4°C丙酮固定10 min，滴加3%H2O2 室溫封閉內源性過氧化物酶。1%牛血清白蛋白封閉60 min后滴加抗人線粒體一抗（鼠抗人單抗），4°C過夜；滴加帶熒光的羊抗鼠結合辣根過氧化物酶二抗，室溫孵育60?min；滴加DAPI染液染色5～10 min。熒光顯微鏡下觀察，藍色熒光為DAPI細胞核染色，紅色熒光為抗人線粒體抗原陽性染色。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，接種72 h后可見少量貼壁細胞，呈長梭形、多角形，平行排列或漩渦樣生長；初次換液4～5 d后開始出現細胞集落，細胞形態趨于均一，多為長梭形成纖維樣細胞；傳至第4代后細胞增殖快，培養細胞可穩定生長。見圖 1。
成骨誘導21 d，茜素紅染色見細胞有紅色鈣結節結構形成（圖 2a）；成脂誘導14 d后，細胞變圓，細胞質內出現顆粒狀脂滴，油紅O染色見細胞質呈紅色（圖 2b）。流式細胞儀檢測示，細胞CD34、CD45、HLA-DR表達呈陰性，CD29、CD73、CD90、CD105及CD166表達呈陽性。見圖 3。提示細胞具有多向分化能力和MSCs免疫組織表型。
圖1
第4代PDB-MSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? ?圖 2 第4代PDB-MSCs成骨、成脂誘導鑒定觀察 ?成骨誘導21 d茜素紅染色（×200） ?成脂誘導14 d油紅O染色（×200） ? ?圖 3 第4代PDB-MSCs特異性表面抗原表達分析 ?CD29 ?CD34 ?CD45 ?HLA-DR ?CD73 ?CD90 ?CD105 ?CD166 ? ?圖 4 兩組術后創面大體觀察 從左至右分別為術后即刻及2、14、21、30 d ?實驗組 ?對照組
Figure1.
Morphology observation of the 4th passage PDB-MSCs (Inverted phase contrast microscope×40) ? ?Fig. 2 Identification of the 4th passage PDB-MSCs ?Alizarin red staining after 21 days of osteogenic induction (×200) ?Oil red O staining after 14 days of adipogenic induction (×200) ? ?Fig. 3 Phenotype analysis of the 4th passage PDB-MSCs ?CD29 ?CD34 ?CD45 ?HLA-DR ?CD73 ?CD90 ?CD105 ?CD166 ? ?Fig. 4 General observation of wounds in 2 groups after operation From left to right for immediate,2,14,21,and 30 days,respectively ?Experimental group ?Control group
2.2 動物實驗觀察
2.2.1 一般情況
兩組裸鼠均存活至實驗完成。細胞注射及模型制備后裸鼠活動、飲食均正常。
2.2.2 大體觀察
術后隨時間延長，兩組皮膚創面開始結痂，其中實驗組于12～14 d、對照組于14～17?d開始脫痂，故設定第14天開始測量創面愈合率。21 d，實驗組創面較光滑平整，對照組較粗糙。25?d，實驗組創面愈合范圍大于對照組。30 d，實驗組創面基本愈合，無明顯瘢痕；對照組創面亦基本愈合，但仍有一定凹陷。見圖 4。
實驗組術后14、18、21、25、30 d創面愈合率分別為71.57%±3.39%、81.13%±2.75%、85.47%±2.12%、93.47%±4.27%、100%，對照組分別為57.97%±4.82%、72.87%±3.23%、76.57%±3.35%、86.47%±6.46%、97.60%±4.16%。實驗組術后14、18、21 d創面愈合率均明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（t=4.001，P=0.016；t=3.380，P=0.028；t=3.888，P=0.018）；術后25、30?d兩組比較差異無統計學意義（t=1.565，P=0.193；t=1.000，P=0.423）。
2.2.3 組織學及免疫熒光染色觀察
HE染色示，術后1 d，兩組皮膚缺損處均存在大量炎性細胞。7 d，兩組炎性細胞較1 d時減少，其中實驗組缺損部位與正常皮膚組織交界處出現皮膚組織新生趨勢。14 d，實驗組缺損部位各層皮膚均開始修復，并且出現新生皮膚腺體；對照組無腺體新生現象。21 d，實驗組缺損修復區域腺體新生增多；對照組上皮組織增生明顯，但仍未發現腺體。30 d，實驗組缺損部位基本完成修復，炎性反應基本消失，并且新生的皮膚組織具有完整結構以及大量腺體；對照組缺損部位也基本完成皮膚各層修復，但皮膚腺體新生較少，并且表皮細胞呈現多層堆積現象，形成瘢痕組織。見圖 5。
免疫熒光染色示，術后各時間點實驗組均可見人線粒體抗原染色陽性，提示存在人源細胞。見圖 6。
圖2
術后各時間點兩組組織學觀察（HE×50） 虛線框內為缺損修復區域，紅箭頭示新生腺體，綠箭頭示上皮組織增生 從左至右分別為術后1、7、14、21、30 d ?實驗組 ?對照組 ? ?圖 6 術后各時間點實驗組免疫熒光染色觀察 從左至右分別為細胞核DAPI染色、人線粒體抗原染色以及合并圖像 箭頭示人線粒體抗原染色陽性 ?7 d（×50） ?14 d（×100） ?30 d（×100）
Figure2.
Histology observation at different time points after operation (HE×50) The repaired area was in the dotted boxes; red arrow indicated regenerative glands; green arrow indicated the hyperplasia area of epithelial tissue From left to right for the results at 1,7,14,21,and 30 days,respectively ?Experimental group ?Control group ? ?Fig. 6 Immunofluorescence staining observation of experimental group at different time points after operation From left to right for nuclear?staining by DAPI,anti-human mitochondria antibody staining,and merged pictures Arrow indicated anti-human mitochondria antibody positive staining ?At 7 days (×50) ?At 14 days (×100) ?At 30?days (×100)
3 討論
BMSCs是研究最早及最多的MSCs，因其移植后排斥反應小[4]，培養技術簡便，體外增殖迅速，并可冷凍保存，現已作為種子細胞在創傷修復、腫瘤治療、糖尿病、脊髓損傷等部分難治性疾病方面取得了一定治療效果[5-10]。隨著干細胞來源研究的發展，人們在胎盤組織中也成功分離出MSCs，并且其基本生物學特性與BMSCs相似，除同樣具有體外多向分化潛能及免疫調節等特點外，還具有抗炎及抗纖維化等作用[11-12]。此外，胎盤來源MSCs與BMSCs相比，具有以下優勢：①胎盤作為產后“廢棄物”可避免倫理學問題；②與骨髓相比，胎盤來源更充足，并且不增加額外創傷；③胎盤來源MSCs更接近于胚胎干細胞，其增殖能力優于BMSCs[13-15]。
我們在預實驗中，首先用酶消化法結合密度梯度離心法分離出PDB-MSCs，以探索更適宜的分離條件。我們發現在消化液中加入80?U/L DNA酶將降低消化液的黏稠度，避免吸取過多的消化殘留組織；在消化過程中分兩次加入消化液，間隔20 min，也能有效降低消化液黏稠度且組織消化更完全；另外，細胞接種密度、首次換液時間以及培養液成分等因素同樣對細胞的分離純化有影響，但其最佳培養條件仍需要進一步探討。
Krause等[16]首次將雄性小鼠MSCs注射至免疫缺陷的雌性小鼠體內，結果證實MSCs參與了皮膚形成過程及其穩態的維持。此后，大量動物實驗及臨床研究結果表明，MSCs治療可促進皮膚慢性和急性創面的愈合[17]、降低炎性反應和改善創面愈合質量[18-19]。MSCs修復皮膚創面主要與其分化功能及旁分泌機制有關。在皮膚創面修復的微環境中，MSCs可分化為內皮細胞、角質細胞、周細胞及汗腺細胞、成纖維細胞以及多種皮膚的附屬器官細胞[20]。有研究指出MSCs可通過分泌一系列趨化因子、細胞因子、黏附分子等促進MSCs的趨化、遷移和分化過程，并可減輕炎性反應、抑制凋亡并促進創傷部位新生血管的形成[21]；另外對調節內皮細胞、免疫細胞、纖維細胞和心肌細胞等生物功能以及改善組織再生的內環境也具有重要作用[22-24]。
尾靜脈注射是常用注射方式，細胞可通過體循環進入各組織器官。目前大多數干細胞相關的疾病研究中均采用先制備疾病模型，然后行靜脈注射或局部注射干細胞的方式。而本研究中我們將PDB-MSCs預先注射于裸鼠體內以實現MSCs儲存于裸鼠各組織器官，于3 d后再建立全層皮膚缺損模型，從另外一個角度探究MSCs的預儲存以及儲存細胞在機體內發揮修復作用的機制及效果。結果顯示，所注射的PDB-MSCs有效提高了創面愈合率，且實驗組愈合皮膚組織中表皮修復完整，細胞排列更有序，并可觀察到大量腺體出現，從結構及功能上均能滿足修復需求；而對照組缺損修復部位表皮細胞呈現多層堆積現象，易形成瘢痕組織。通過免疫熒光檢測發現，在缺損修復各時間點，實驗組皮膚組織中均發現了人來源細胞，提示預先注射至裸鼠體內的PDB-MSCs在皮膚出現創傷后，可快速遷移至皮膚缺損部位，并參與創面愈合、缺損皮膚修復以及皮膚腺體的再生。但由于本研究未進行缺損部位PDB-MSCs的進一步分化實驗以及分子學研究，其在修復中的調動機制、修復機制尚有待研究明確。
創傷、大面積燒傷、腫瘤切除后、褥瘡或代謝性疾病（如糖尿病）等均會造成嚴重皮膚軟組織缺損，目前臨床常用自體游離皮片移植、皮瓣移植、同種異體/異種皮移植和人工替代物覆蓋等方法修復，但這些方法存在造成新的創傷、供皮來源有限和免疫排斥等問題。近年來，應用MSCs修復皮膚損傷受到廣泛關注。MSCs是一類來源廣泛且具有多向分化潛能的細胞，研究發現移植的MSCs可在真皮組織中形成成纖維樣及血管內皮樣結構[1]；在表皮組織中可呈角朊細胞表型，促進創面愈合[2]。我們前期研究發現經裸鼠尾靜脈注射人胎盤蛻膜基層來源MSCs（placental decidua basalis derived MSCs，PDB-MSCs）后，細胞主要分布于肺、骨髓、肝臟等組織器官，注射3 d后被大量代謝（90%以上），但在180 d觀察期內仍有部分PDB-MSCs存在于骨髓、肺等組織器官[3]。提示外源性MSCs經靜脈注射后，部分細胞可長期存活并儲存于機體組織器官內，但如何被機體利用并發揮修復作用尚未明確。本研究采用裸鼠全層皮膚缺損模型，進一步探究預先儲存于機體內的PDB-MSCs能否被調動至皮膚缺損部位及其在皮膚全層缺損修復中的修復效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
胎盤組織由四川大學華西第二醫院收治的妊娠38～40周健康產婦自愿捐贈，術后無菌保存。4～5周齡健康雌性BALB/c裸鼠42只，體質量18～22?g，由成都達碩實驗動物有限公司提供。EDTA、H-DMEM（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；抗人CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-DR抗體（BD公司，美國）；抗人線粒體抗體（Abcam公司，英國）；辣根過氧化物酶（基因科技上海有限公司）。水套式CO2細胞培養箱（Thermo公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；流式細胞儀（Beckman公司，美國）。
1.2 PDB-MSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 細胞分離及培養
無菌環境下，將胎盤用PBS（pH7.4）洗凈，剝離胎盤蛻膜基層，剪為1～2?mm3小塊，加入酶混合液（含0.1%Ⅳ型膠原酶、0.5%胰蛋白酶、80 U/mL DNA酶的DMEM），37°C恒溫水浴震搖消化20 min，靜置后收集上清消化液；再次加入酶混合液重復以上步驟。混合2次消化液，移入裝有等體積人外周血淋巴細胞分離液的離心管中，以500×g離心30 min。吸取中間單核細胞層液體，加入等體積DMEM洗滌，250×g離心 5 min后以5 mL完全培養基（含10% FBS的H-DMEM）重懸，接種于T-25培養瓶中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。72?h后PBS清洗未貼壁細胞，之后每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，待生長達約80%融合時，用TNE（0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA-Na2液）消化貼壁細胞，按1∶3比例傳代，取第4代細胞進行后續實驗。
1.2.2 細胞鑒定
①成骨誘導：將第4代細胞以3×103個/cm2接種于放置血蓋片的6孔板中，加入3?mL完全培養基。置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，更換為3 mL成骨誘導液[3]進行誘導培養，每3天換液1次。誘導21 d后吸棄培養液，PBS清洗3次，行茜素紅染色觀察。以完全培養基培養的正常細胞作為對照。
②成脂誘導：同成骨誘導方法將第4代細胞接種于6孔板中，培養24 h后更換為成脂誘導液[3]進行誘導培養，每3天換液1次。誘導14 d后吸棄培養液，PBS清洗3次，行油紅O染色觀察。以完全培養基培養的正常細胞作為對照。
③特異性表面抗原表達分析：將第4代細胞以TNE消化洗滌后重懸于PBS中，制成濃度為1×107 個 /mL的單細胞懸液，分別取100 μL加入流式管中，并加入20 μL結合FITC或PE熒光標記的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166及HLA-DR抗體。室溫避光孵育30?min，PBS離心洗滌，棄上清后加入200 μL PBS混勻細胞沉淀，流式細胞儀檢測特異性表面抗原表達情況。
1.3 實驗分組及方法
取42只裸鼠隨機分為實驗組及對照組，每組21只。將第4代細胞經TNE消化后重懸于PBS中，制成濃度為5×106個/mL的單細胞懸液，經尾靜脈注射至實驗組裸鼠體內，每只注射200 μL；對照組同法注射等體積PBS。注射3 d后，兩組裸鼠制備全層皮膚缺損模型，具體方法：實驗動物經腹腔注射10%水合氯醛（5 μL/g）麻醉，背部消毒，用預先制備的硬紙板模型于背部制備1.5?cm×1.5 cm大小的全層皮膚缺損，聚維酮碘溶液消毒，無加壓包扎。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
細胞注射后及模型制備后，觀察兩組裸鼠存活及飲食等情況。
1.4.2 大體觀察
于模型制備后1、2、4、7、14、18、21、25、30?d，兩組大體觀察創面愈合情況。待創面開始脫痂后，兩組各時間點各取3只裸鼠，用透明薄膜覆蓋于創面并勾畫其形狀，通過小方格測量創面面積，并按以下公式計算創面愈合率：（原始創面面積－第n天創面面積）/原始創面面積×100%。
1.4.3 組織學觀察
術后1、7、14、21、30?d兩組各取3只裸鼠，麻醉處死后沿創面邊緣剪取部分創傷組織，4%中性甲醛固定48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋、切片，片厚4 μm。常規HE染色后，光鏡下觀察創面修復情況。
1.4.4 免疫熒光染色觀察
術后7、14、30 d實驗組取裸鼠創面剩余組織進行冰凍切片，4°C丙酮固定10 min，滴加3%H2O2 室溫封閉內源性過氧化物酶。1%牛血清白蛋白封閉60 min后滴加抗人線粒體一抗（鼠抗人單抗），4°C過夜；滴加帶熒光的羊抗鼠結合辣根過氧化物酶二抗，室溫孵育60?min；滴加DAPI染液染色5～10 min。熒光顯微鏡下觀察，藍色熒光為DAPI細胞核染色，紅色熒光為抗人線粒體抗原陽性染色。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，接種72 h后可見少量貼壁細胞，呈長梭形、多角形，平行排列或漩渦樣生長；初次換液4～5 d后開始出現細胞集落，細胞形態趨于均一，多為長梭形成纖維樣細胞；傳至第4代后細胞增殖快，培養細胞可穩定生長。見圖 1。
成骨誘導21 d，茜素紅染色見細胞有紅色鈣結節結構形成（圖 2a）；成脂誘導14 d后，細胞變圓，細胞質內出現顆粒狀脂滴，油紅O染色見細胞質呈紅色（圖 2b）。流式細胞儀檢測示，細胞CD34、CD45、HLA-DR表達呈陰性，CD29、CD73、CD90、CD105及CD166表達呈陽性。見圖 3。提示細胞具有多向分化能力和MSCs免疫組織表型。
圖1
第4代PDB-MSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? ?圖 2 第4代PDB-MSCs成骨、成脂誘導鑒定觀察 ?成骨誘導21 d茜素紅染色（×200） ?成脂誘導14 d油紅O染色（×200） ? ?圖 3 第4代PDB-MSCs特異性表面抗原表達分析 ?CD29 ?CD34 ?CD45 ?HLA-DR ?CD73 ?CD90 ?CD105 ?CD166 ? ?圖 4 兩組術后創面大體觀察 從左至右分別為術后即刻及2、14、21、30 d ?實驗組 ?對照組
Figure1.
Morphology observation of the 4th passage PDB-MSCs (Inverted phase contrast microscope×40) ? ?Fig. 2 Identification of the 4th passage PDB-MSCs ?Alizarin red staining after 21 days of osteogenic induction (×200) ?Oil red O staining after 14 days of adipogenic induction (×200) ? ?Fig. 3 Phenotype analysis of the 4th passage PDB-MSCs ?CD29 ?CD34 ?CD45 ?HLA-DR ?CD73 ?CD90 ?CD105 ?CD166 ? ?Fig. 4 General observation of wounds in 2 groups after operation From left to right for immediate,2,14,21,and 30 days,respectively ?Experimental group ?Control group
2.2 動物實驗觀察
2.2.1 一般情況
兩組裸鼠均存活至實驗完成。細胞注射及模型制備后裸鼠活動、飲食均正常。
2.2.2 大體觀察
術后隨時間延長，兩組皮膚創面開始結痂，其中實驗組于12～14 d、對照組于14～17?d開始脫痂，故設定第14天開始測量創面愈合率。21 d，實驗組創面較光滑平整，對照組較粗糙。25?d，實驗組創面愈合范圍大于對照組。30 d，實驗組創面基本愈合，無明顯瘢痕；對照組創面亦基本愈合，但仍有一定凹陷。見圖 4。
實驗組術后14、18、21、25、30 d創面愈合率分別為71.57%±3.39%、81.13%±2.75%、85.47%±2.12%、93.47%±4.27%、100%，對照組分別為57.97%±4.82%、72.87%±3.23%、76.57%±3.35%、86.47%±6.46%、97.60%±4.16%。實驗組術后14、18、21 d創面愈合率均明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（t=4.001，P=0.016；t=3.380，P=0.028；t=3.888，P=0.018）；術后25、30?d兩組比較差異無統計學意義（t=1.565，P=0.193；t=1.000，P=0.423）。
2.2.3 組織學及免疫熒光染色觀察
HE染色示，術后1 d，兩組皮膚缺損處均存在大量炎性細胞。7 d，兩組炎性細胞較1 d時減少，其中實驗組缺損部位與正常皮膚組織交界處出現皮膚組織新生趨勢。14 d，實驗組缺損部位各層皮膚均開始修復，并且出現新生皮膚腺體；對照組無腺體新生現象。21 d，實驗組缺損修復區域腺體新生增多；對照組上皮組織增生明顯，但仍未發現腺體。30 d，實驗組缺損部位基本完成修復，炎性反應基本消失，并且新生的皮膚組織具有完整結構以及大量腺體；對照組缺損部位也基本完成皮膚各層修復，但皮膚腺體新生較少，并且表皮細胞呈現多層堆積現象，形成瘢痕組織。見圖 5。
免疫熒光染色示，術后各時間點實驗組均可見人線粒體抗原染色陽性，提示存在人源細胞。見圖 6。
圖2
術后各時間點兩組組織學觀察（HE×50） 虛線框內為缺損修復區域，紅箭頭示新生腺體，綠箭頭示上皮組織增生 從左至右分別為術后1、7、14、21、30 d ?實驗組 ?對照組 ? ?圖 6 術后各時間點實驗組免疫熒光染色觀察 從左至右分別為細胞核DAPI染色、人線粒體抗原染色以及合并圖像 箭頭示人線粒體抗原染色陽性 ?7 d（×50） ?14 d（×100） ?30 d（×100）
Figure2.
Histology observation at different time points after operation (HE×50) The repaired area was in the dotted boxes; red arrow indicated regenerative glands; green arrow indicated the hyperplasia area of epithelial tissue From left to right for the results at 1,7,14,21,and 30 days,respectively ?Experimental group ?Control group ? ?Fig. 6 Immunofluorescence staining observation of experimental group at different time points after operation From left to right for nuclear?staining by DAPI,anti-human mitochondria antibody staining,and merged pictures Arrow indicated anti-human mitochondria antibody positive staining ?At 7 days (×50) ?At 14 days (×100) ?At 30?days (×100)
3 討論
BMSCs是研究最早及最多的MSCs，因其移植后排斥反應小[4]，培養技術簡便，體外增殖迅速，并可冷凍保存，現已作為種子細胞在創傷修復、腫瘤治療、糖尿病、脊髓損傷等部分難治性疾病方面取得了一定治療效果[5-10]。隨著干細胞來源研究的發展，人們在胎盤組織中也成功分離出MSCs，并且其基本生物學特性與BMSCs相似，除同樣具有體外多向分化潛能及免疫調節等特點外，還具有抗炎及抗纖維化等作用[11-12]。此外，胎盤來源MSCs與BMSCs相比，具有以下優勢：①胎盤作為產后“廢棄物”可避免倫理學問題；②與骨髓相比，胎盤來源更充足，并且不增加額外創傷；③胎盤來源MSCs更接近于胚胎干細胞，其增殖能力優于BMSCs[13-15]。
我們在預實驗中，首先用酶消化法結合密度梯度離心法分離出PDB-MSCs，以探索更適宜的分離條件。我們發現在消化液中加入80?U/L DNA酶將降低消化液的黏稠度，避免吸取過多的消化殘留組織；在消化過程中分兩次加入消化液，間隔20 min，也能有效降低消化液黏稠度且組織消化更完全；另外，細胞接種密度、首次換液時間以及培養液成分等因素同樣對細胞的分離純化有影響，但其最佳培養條件仍需要進一步探討。
Krause等[16]首次將雄性小鼠MSCs注射至免疫缺陷的雌性小鼠體內，結果證實MSCs參與了皮膚形成過程及其穩態的維持。此后，大量動物實驗及臨床研究結果表明，MSCs治療可促進皮膚慢性和急性創面的愈合[17]、降低炎性反應和改善創面愈合質量[18-19]。MSCs修復皮膚創面主要與其分化功能及旁分泌機制有關。在皮膚創面修復的微環境中，MSCs可分化為內皮細胞、角質細胞、周細胞及汗腺細胞、成纖維細胞以及多種皮膚的附屬器官細胞[20]。有研究指出MSCs可通過分泌一系列趨化因子、細胞因子、黏附分子等促進MSCs的趨化、遷移和分化過程，并可減輕炎性反應、抑制凋亡并促進創傷部位新生血管的形成[21]；另外對調節內皮細胞、免疫細胞、纖維細胞和心肌細胞等生物功能以及改善組織再生的內環境也具有重要作用[22-24]。
尾靜脈注射是常用注射方式，細胞可通過體循環進入各組織器官。目前大多數干細胞相關的疾病研究中均采用先制備疾病模型，然后行靜脈注射或局部注射干細胞的方式。而本研究中我們將PDB-MSCs預先注射于裸鼠體內以實現MSCs儲存于裸鼠各組織器官，于3 d后再建立全層皮膚缺損模型，從另外一個角度探究MSCs的預儲存以及儲存細胞在機體內發揮修復作用的機制及效果。結果顯示，所注射的PDB-MSCs有效提高了創面愈合率，且實驗組愈合皮膚組織中表皮修復完整，細胞排列更有序，并可觀察到大量腺體出現，從結構及功能上均能滿足修復需求；而對照組缺損修復部位表皮細胞呈現多層堆積現象，易形成瘢痕組織。通過免疫熒光檢測發現，在缺損修復各時間點，實驗組皮膚組織中均發現了人來源細胞，提示預先注射至裸鼠體內的PDB-MSCs在皮膚出現創傷后，可快速遷移至皮膚缺損部位，并參與創面愈合、缺損皮膚修復以及皮膚腺體的再生。但由于本研究未進行缺損部位PDB-MSCs的進一步分化實驗以及分子學研究，其在修復中的調動機制、修復機制尚有待研究明確。
