引用本文： 劉澤遠, 張文蘋, 黃強開, 李剛, 陳治, 韋健, 梁炳生. 被動運動干預對大鼠失神經萎縮骨骼肌中miRNA-1表達和成肌細胞分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(5): 612-618. doi: 10.7507/1002-1892.20160124 復制
失神經骨骼肌萎縮，尤其是臂叢損傷后手內在肌萎縮的防治是周圍神經領域亟待解決的醫學難題。雖然神經修復技術和顯微外科技術日益成熟，但是對周圍神經損傷后致殘率的改善并不理想。這是由于周圍神經修復后生長速度慢，失神經萎縮的骨骼肌即便重新獲取神經支配，萎縮的骨骼肌也常難以恢復功能。因此延緩失神經骨骼肌萎縮，對于提高周圍神經損傷患者的生活質量和降低致殘率有重要臨床價值。臨床上被動運動作為一種重要的防止或延緩失神經肌萎縮的方法被廣泛應用，但其確切機制仍未完全明確。近年來，研究發現miRNA在許多疾病的發生、發展以及預后過程中，對影響成肌細胞增殖、分化的關鍵性轉錄蛋白起到關鍵調控作用[1]。研究表明[2-3]，運動后肌肉特異性miRNA有不同程度改變，且有氧運動及抗阻運動、時間不同，其改變均有差異；同時，運動可促進肌衛星細胞的增殖及分化[4]。所以我們推測被動運動干預可影響miRNA的表達，進而調控骨骼肌的增殖分化，延緩失神經后骨骼肌萎縮；而且目前鮮有研究證實miRNA-1在失神經骨骼肌肉中的表達與被動運動的相關性。鑒于此，我們擬通過建立大鼠失神經及失神經被動運動模型，比較兩者不同時間點miRNA-1、肌分化因子（myocyte differentiation factor，MyoD）以及腓腸肌萎縮程度的變化，并對三者分別行相關性分析，旨在了解失神經骨骼肌在被動運動干預后腓腸肌萎縮、miRNA-1和MyoD的趨勢變化及三者之間的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年健康SD大鼠27只，雌雄不限，體質量（200±10）g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。
Trizol試劑、All-in-oneTM miRNA first stand cDNA synthesis kit、All-in-oneTM miRNA PCR kit、All-in-oneTM qPCR mix（廣州復能基因有限公司）；小鼠抗大鼠MyoD單抗（Santa Cruz公司，美國）；即用型辣根過氧化物酶試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；IQ-50 RT-PCR儀、GS800 測量密度掃描儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 動物模型制備及實驗分組
將27只SD大鼠隨機分為假手術組（A組，n=3）、失神經組（B組，n=12）和失神經被動運動組（C組，n=12）。所有動物以10%水合氯醛腹腔注射（2?mL/kg）麻醉，于右股外側經皮切開顯露坐骨神經并游離，B、C組切除坐骨神經長約1 cm，A組僅顯露游離神經不切除，然后逐層縫合。術后1 d起，將C組大鼠置于自制網夾內，拉出右后肢，抓住趾部，與脊柱呈45°向后外方牽拉，至右后肢完全伸直，再將右后肢推向身體，使之完全屈曲緊貼身體，每天訓練2次，每次屈伸運動300下，3 min/次。A組于術后6 h，B、C組分別于術后3、7、14、28 d，采用頸椎脫臼法各處死3只大鼠，進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 腓腸肌濕重比測定
將大鼠雙側腓腸肌自股骨內外髁起點至跟骨結節處完整取下，用電子天平準確稱量腓腸肌濕重，計算失神經側與正常側腓腸肌濕重的比值。然后將標本快速液氮冷凍保存于—?80℃冰箱備用。
1.3.2 組織學觀察
切取各組橫切面標本，常規固定、脫水、浸蠟、包埋，5 μm厚連續切片，HE染色后熒光顯微鏡下觀察腓腸肌肌細胞排列及萎縮情況。并采用Olympus圖像分析軟件計算腓腸肌肌細胞直徑，以定量評價腓腸肌萎縮情況。
1.3.3 RT-PCR檢測miRNA-1和MyoD基因表達
采用Trizol法分別提取各組各時間點腓腸肌總RNA，按All-in-oneTM miRNA first stand cDNA synthesis kit試劑盒說明操作，取總RNA 1 μL進行反轉錄，cDNA置于—?80℃保存。PCR擴增反應體系為20?μL：包括5倍稀釋后的cDNA 1 μL、2×All-in-OneTM qPCR mix 10 μL、All-in-OneTM miRNA qPCR Primer 2?μL、Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，用ddH2O補足20 μL。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，退火（退火溫度miRNA-1 40℃、MyoD 57℃）20 s，72℃延伸20 s，40個循環。以管家基因U6為內參，RT-PCR儀讀取Ct值，采用2-ΔΔCt計算目的基因mRNA相對表達量，所有樣本重復3次。引物合成由廣州復能基因有限公司完成，引物序列：miRNA-1 反轉錄5'-UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3'，上游5'-CTGTCACTCGAGCTGCTGGAATG-3'，下游5'-ACCGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-3'；MyoD上游5'-GTGCAAGCGCAAGACCACTAA-3'，下游 5'-TGCAGACCTTCAATGTAGCGG-3'；U6上游5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游5'-CGCTFCACGAATTYGCGTGTCAT- 3'。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察MyoD蛋白表達
取上述部分切片，PBS沖洗，抗原修復，滴加一抗小鼠抗大鼠MyoD單抗（1∶100）4℃過夜；PBS反復沖洗3次，去除多余一抗，加入二抗（1∶2 000）20?min；PBS反復沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；采用Pearson相關分析miRNA-1、MyoD基因相對表達量與腓腸肌濕重比的相關性以及miRNA-1、MyoD基因相對表達量間的相關性；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 腓腸肌濕重比測定
B、C組腓腸肌失神經后均有不同程度萎縮，隨時間延長，腓腸肌濕重比逐漸下降，但C組被動運動可延緩失神經肌萎縮程度。與A組腓腸肌濕重比0.987±0.018相比，B、C組術后各時間點腓腸肌濕重比均小于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間除術后3 d比較差異無統計學意義（P>0.05）外，術后7、14、28 d C組腓腸肌濕重比均大于B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
B、C組大鼠術后各時間點腓腸肌濕重比比較（n=3，2.2 組織學觀察
顯微鏡觀察示，A組肌細胞形態正常，肌纖維排列整齊；B、C組隨失神經時間延長，肌纖維排列逐漸紊亂，肌細胞直徑逐漸減小，失去正常的結構形態，B組較C組變化明顯。見圖 1。
圖1
各組術后各時間點腓腸肌HE染色觀察（倒置顯微鏡×200） ?A組術后6 h ?B組術后3 d ?B組術后7 d ?B組術后14?d ?B組術后28 d ?C組術后3 d ?C組術后7 d ?C組術后14 d ?C組術后28 d
Figure1.
HE staining observation of gastrocnemius in each group at different time points after operation (Inverted microscope×200) ?Group A at 6 hours ?Group B at 3 days ?Group B at 7 days ?Group B at 14 days ?Group B at 28 days ?Group C at 3 days ?Group C at 7?days ?Group C at 14 days ?Group C at 28 days
與A組腓腸肌肌細胞直徑（18.348±0.782）μm相比，B、C組術后各時間點肌細胞直徑均小于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間除術后3、28?d比較差異無統計學意義（P>0.05）外，術后7、14?d C組肌細胞直徑均大于B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
B、C組大鼠術后各時間點腓腸肌肌細胞直徑比較（n=3，μm，2.3 RT-PCR檢測miRNA-1和MyoD基因表達
術后隨時間延長，B、C組miRNA-1和MyoD基因相對表達量呈逐漸升高趨勢，但各時間點均顯著低于A組（miRNA-1和MyoD mRNA相對表達量分別為0.213±0.056、0.130±0.035），差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間除術后3 d比較差異無統計學意義（P>0.05）外，術后7、14、28 d C組miRNA-1和MyoD mRNA相對表達量均高于B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3、4。
表3
B、C組大鼠術后各時間點腓腸肌miRNA-1基因相對表達量比較（n=3，
表4
B、C組大鼠術后各時間點腓腸肌MyoD基因相對表達量比較（n=3，2.4 免疫組織化學染色觀察MyoD蛋白表達
A、B、C組各時間點免疫組織化學染色均可見MyoD呈棕色陽性表達，其中A組陽性表達少于B、C組；B、C組隨失神經時間延長，陽性表達逐漸增多，C組各時間點陽性表達均多于B組。見圖 2。
圖2
各組術后各時間點腓腸肌MyoD免疫組織化學染色觀察（倒置顯微鏡×200） ?A組術后6 h ?B組術后3 d ?B組術后7?d ?B組術后14 d ?B組術后28 d ?C組術后3 d ?C組術后7 d ?C組術后14 d ?C組術后28 d
Figure2.
The expression of MyoD by immunohistochemistry staining in each group at different time points after operation (Inverted microscope×200) ?Group A at 6 hours ?Group B at 3 days ?Group B at 7 days ?Group B at 14 days ?Group B at 28 days ?Group C at 3 days ?Group C at 7 days ?Group C at 14 days ?Group C at 28 days
2.5 相關性分析
失神經腓腸肌中miRNA-1、MyoD基因相對表達量與腓腸肌濕重比在術后3 d（r=0.030，P=0.955；r=0.019，P=0.971）、7 d（r=0.179，P=0.734；r=0.027，P=0.960）時無相關性；14 d（r=0.816，P=0.039；r=0.753，P=0.047）、28 d（r=0.929，P=0.007；r=0.941，P=0.005）時成正相關。各時間點MyoD與miRNA-1基因相對表達量成正相關（3、7、14、28 d分別為r=0.842，P=0.035；r=0.823，P=0.048；r=0.841，P=0.036；r=0.841，P=0.036）。
3 討論
失神經肌萎縮的治療是周圍神經損傷領域亟待解決的難題。近年來，隨著分子生物學和后基因組學的發展，肌肉特異性miRNA為治療失神經肌萎縮提供了一種新思路。Townley-Tilson等[5]發現，在骨骼肌中存在組織特異性miRNA（miRNA-1、miRNA-133、miRNA-206）參與了肌細胞再生、功能和疾病發生的過程。Koutsoulidou等[6]研究發現人類胚胎發育階段的不同時期，骨骼肌的發生發育過程中miRNA-1、miRNA-133a表達明顯增加。研究證明[7]，miRNA-1、miRNA-133a在肌再生、肌分化過程中對MyoD、血清反應因子（serum response factor，SRF）、肌細胞增強因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）等關鍵蛋白具有重要調節作用，miRNA-1、miRNA-133a通過調節細胞信號通路的某個環節從而參與延緩失神經快、慢肌肌萎縮的過程。離體細胞實驗證明[8]，miRNA-1可促進成肌細胞分化。本實驗結果表明，miRNA-1與MyoD的表達有相關性，說明在活體大鼠骨骼肌內，miRNA-1在骨骼肌失神經萎縮后參與成肌細胞的分化過程。
MyoD是成肌調節因子家族（myogenic regulatory factor，MRF）四成員（MyoD、MRF5、Myogenin、MRF4）之一，成肌細胞激活后即上調MRF家族成員表達。同時實驗證明成肌細胞通過MyoD和/或MRF5信號通路激活并開始成肌分化過程[9]；并且MyoD促進成肌細胞增殖，在細胞修復中起重要作用[10]。研究顯示，小鼠骨骼肌再生時成肌細胞激活早期表達的MyoD和/或MRF5，隨后所有增生的成肌細胞均表達MyoD，說明MyoD對成肌細胞增殖有促進作用，并可作為反映肌肉再生的指標[11]。MyoD調節成肌細胞增殖轉向最終分化，而缺乏MyoD的小鼠則分化延遲[12]。上述MyoD的這些作用不是獨立完成的，其需與MEF2共同作用，進而激活靶基因的啟動子來完成[13]；而SRF則與MyoD基因遠端調節區域中的CArG元件結合，進一步促使MyoD激活骨骼肌成肌細胞和肌衛星細胞[14]。結合本實驗結果，即失神經及被動運動干預后各時間點miRNA-1、MyoD和成肌細胞分化趨勢相應變化，我們推測miRNA-1促進成肌細胞分化可能是通過MEF2和SRF形成負性調節環路來實現的，而在這兩個負性調節環路中MyoD起到十分重要的作用，通過下調MyoD的抑制因子而上調MyoD基因，這種miRNA與成肌轉錄調節因子之間的反饋調節可使平衡向肌分化方向轉化，導致肌細胞永久分化，以延緩或治療失神經骨骼肌萎縮。骨骼肌萎縮在早期（失神經3、7 d時）主要表現為蛋白質分解，因而促成肌細胞分化延緩失神經骨骼肌萎縮的作用不明顯，隨著時間延長，這種作用發揮越來越明顯。
力學刺激是維持細胞生存和生長的重要細胞外刺激，在成肌細胞的激活、增殖與分化中扮演重要角色。目前有研究表明，運動的性質、強度、時間、運動后恢復期的活動形式以及運動營養等，可能對成肌細胞與運動的反應機制有著重要影響[15]；持續重復運動刺激可使活化狀態的衛星細胞募集完成增殖[16]。但上述研究對象是正常人體或動物骨骼肌。本實驗研究對象為失神經萎縮骨骼肌，可進一步為力學刺激或被動運動對骨骼肌或成肌細胞的影響提供實驗依據。隨著研究的深入，成肌細胞活化、增殖及分化過程中新的調控機制不斷被發現，如miRNA、DNA甲基化等調控成肌細胞分化[17-19]。有研究表明[20]，肌肉特異性miRNA與人體伸膝肌肉活動強度成正相關，考慮是由于肌肉特異性miRNA在調節肌肉特定基因表達和蛋白質翻譯過程中起到關鍵作用。本實驗結果顯示，被動運動干預后，miRNA-1表達與失神經組比較有顯著差異，我們推測被動運動的干預可能通過改變細胞微環境或力學刺激骨骼肌，增強miRNA-1的表達，從而促進成肌細胞的分化。
綜上述，被動運動是延緩肌萎縮的一種有效防治方法，它可通過多種作用機制來延緩失神經骨骼肌萎縮，本實驗結果表明miRNA-1促進成肌細胞分化是其一個重要機制。但miRNA-1促進成肌細胞分化在失神經骨骼肌肌萎縮防治中發揮的具體分子機制及通路尚需進一步研究，以便為臨床上miRNA-1治療骨骼肌失神經肌萎縮提供更好的思路及依據。
失神經骨骼肌萎縮，尤其是臂叢損傷后手內在肌萎縮的防治是周圍神經領域亟待解決的醫學難題。雖然神經修復技術和顯微外科技術日益成熟，但是對周圍神經損傷后致殘率的改善并不理想。這是由于周圍神經修復后生長速度慢，失神經萎縮的骨骼肌即便重新獲取神經支配，萎縮的骨骼肌也常難以恢復功能。因此延緩失神經骨骼肌萎縮，對于提高周圍神經損傷患者的生活質量和降低致殘率有重要臨床價值。臨床上被動運動作為一種重要的防止或延緩失神經肌萎縮的方法被廣泛應用，但其確切機制仍未完全明確。近年來，研究發現miRNA在許多疾病的發生、發展以及預后過程中，對影響成肌細胞增殖、分化的關鍵性轉錄蛋白起到關鍵調控作用[1]。研究表明[2-3]，運動后肌肉特異性miRNA有不同程度改變，且有氧運動及抗阻運動、時間不同，其改變均有差異；同時，運動可促進肌衛星細胞的增殖及分化[4]。所以我們推測被動運動干預可影響miRNA的表達，進而調控骨骼肌的增殖分化，延緩失神經后骨骼肌萎縮；而且目前鮮有研究證實miRNA-1在失神經骨骼肌肉中的表達與被動運動的相關性。鑒于此，我們擬通過建立大鼠失神經及失神經被動運動模型，比較兩者不同時間點miRNA-1、肌分化因子（myocyte differentiation factor，MyoD）以及腓腸肌萎縮程度的變化，并對三者分別行相關性分析，旨在了解失神經骨骼肌在被動運動干預后腓腸肌萎縮、miRNA-1和MyoD的趨勢變化及三者之間的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年健康SD大鼠27只，雌雄不限，體質量（200±10）g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。
Trizol試劑、All-in-oneTM miRNA first stand cDNA synthesis kit、All-in-oneTM miRNA PCR kit、All-in-oneTM qPCR mix（廣州復能基因有限公司）；小鼠抗大鼠MyoD單抗（Santa Cruz公司，美國）；即用型辣根過氧化物酶試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；IQ-50 RT-PCR儀、GS800 測量密度掃描儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 動物模型制備及實驗分組
將27只SD大鼠隨機分為假手術組（A組，n=3）、失神經組（B組，n=12）和失神經被動運動組（C組，n=12）。所有動物以10%水合氯醛腹腔注射（2?mL/kg）麻醉，于右股外側經皮切開顯露坐骨神經并游離，B、C組切除坐骨神經長約1 cm，A組僅顯露游離神經不切除，然后逐層縫合。術后1 d起，將C組大鼠置于自制網夾內，拉出右后肢，抓住趾部，與脊柱呈45°向后外方牽拉，至右后肢完全伸直，再將右后肢推向身體，使之完全屈曲緊貼身體，每天訓練2次，每次屈伸運動300下，3 min/次。A組于術后6 h，B、C組分別于術后3、7、14、28 d，采用頸椎脫臼法各處死3只大鼠，進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 腓腸肌濕重比測定
將大鼠雙側腓腸肌自股骨內外髁起點至跟骨結節處完整取下，用電子天平準確稱量腓腸肌濕重，計算失神經側與正常側腓腸肌濕重的比值。然后將標本快速液氮冷凍保存于—?80℃冰箱備用。
1.3.2 組織學觀察
切取各組橫切面標本，常規固定、脫水、浸蠟、包埋，5 μm厚連續切片，HE染色后熒光顯微鏡下觀察腓腸肌肌細胞排列及萎縮情況。并采用Olympus圖像分析軟件計算腓腸肌肌細胞直徑，以定量評價腓腸肌萎縮情況。
1.3.3 RT-PCR檢測miRNA-1和MyoD基因表達
采用Trizol法分別提取各組各時間點腓腸肌總RNA，按All-in-oneTM miRNA first stand cDNA synthesis kit試劑盒說明操作，取總RNA 1 μL進行反轉錄，cDNA置于—?80℃保存。PCR擴增反應體系為20?μL：包括5倍稀釋后的cDNA 1 μL、2×All-in-OneTM qPCR mix 10 μL、All-in-OneTM miRNA qPCR Primer 2?μL、Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，用ddH2O補足20 μL。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，退火（退火溫度miRNA-1 40℃、MyoD 57℃）20 s，72℃延伸20 s，40個循環。以管家基因U6為內參，RT-PCR儀讀取Ct值，采用2-ΔΔCt計算目的基因mRNA相對表達量，所有樣本重復3次。引物合成由廣州復能基因有限公司完成，引物序列：miRNA-1 反轉錄5'-UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3'，上游5'-CTGTCACTCGAGCTGCTGGAATG-3'，下游5'-ACCGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-3'；MyoD上游5'-GTGCAAGCGCAAGACCACTAA-3'，下游 5'-TGCAGACCTTCAATGTAGCGG-3'；U6上游5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游5'-CGCTFCACGAATTYGCGTGTCAT- 3'。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察MyoD蛋白表達
取上述部分切片，PBS沖洗，抗原修復，滴加一抗小鼠抗大鼠MyoD單抗（1∶100）4℃過夜；PBS反復沖洗3次，去除多余一抗，加入二抗（1∶2 000）20?min；PBS反復沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；采用Pearson相關分析miRNA-1、MyoD基因相對表達量與腓腸肌濕重比的相關性以及miRNA-1、MyoD基因相對表達量間的相關性；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 腓腸肌濕重比測定
B、C組腓腸肌失神經后均有不同程度萎縮，隨時間延長，腓腸肌濕重比逐漸下降，但C組被動運動可延緩失神經肌萎縮程度。與A組腓腸肌濕重比0.987±0.018相比，B、C組術后各時間點腓腸肌濕重比均小于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間除術后3 d比較差異無統計學意義（P>0.05）外，術后7、14、28 d C組腓腸肌濕重比均大于B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
B、C組大鼠術后各時間點腓腸肌濕重比比較（n=3，2.2 組織學觀察
顯微鏡觀察示，A組肌細胞形態正常，肌纖維排列整齊；B、C組隨失神經時間延長，肌纖維排列逐漸紊亂，肌細胞直徑逐漸減小，失去正常的結構形態，B組較C組變化明顯。見圖 1。
圖1
各組術后各時間點腓腸肌HE染色觀察（倒置顯微鏡×200） ?A組術后6 h ?B組術后3 d ?B組術后7 d ?B組術后14?d ?B組術后28 d ?C組術后3 d ?C組術后7 d ?C組術后14 d ?C組術后28 d
Figure1.
HE staining observation of gastrocnemius in each group at different time points after operation (Inverted microscope×200) ?Group A at 6 hours ?Group B at 3 days ?Group B at 7 days ?Group B at 14 days ?Group B at 28 days ?Group C at 3 days ?Group C at 7?days ?Group C at 14 days ?Group C at 28 days
與A組腓腸肌肌細胞直徑（18.348±0.782）μm相比，B、C組術后各時間點肌細胞直徑均小于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間除術后3、28?d比較差異無統計學意義（P>0.05）外，術后7、14?d C組肌細胞直徑均大于B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
B、C組大鼠術后各時間點腓腸肌肌細胞直徑比較（n=3，μm，2.3 RT-PCR檢測miRNA-1和MyoD基因表達
術后隨時間延長，B、C組miRNA-1和MyoD基因相對表達量呈逐漸升高趨勢，但各時間點均顯著低于A組（miRNA-1和MyoD mRNA相對表達量分別為0.213±0.056、0.130±0.035），差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間除術后3 d比較差異無統計學意義（P>0.05）外，術后7、14、28 d C組miRNA-1和MyoD mRNA相對表達量均高于B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3、4。
表3
B、C組大鼠術后各時間點腓腸肌miRNA-1基因相對表達量比較（n=3，
表4
B、C組大鼠術后各時間點腓腸肌MyoD基因相對表達量比較（n=3，2.4 免疫組織化學染色觀察MyoD蛋白表達
A、B、C組各時間點免疫組織化學染色均可見MyoD呈棕色陽性表達，其中A組陽性表達少于B、C組；B、C組隨失神經時間延長，陽性表達逐漸增多，C組各時間點陽性表達均多于B組。見圖 2。
圖2
各組術后各時間點腓腸肌MyoD免疫組織化學染色觀察（倒置顯微鏡×200） ?A組術后6 h ?B組術后3 d ?B組術后7?d ?B組術后14 d ?B組術后28 d ?C組術后3 d ?C組術后7 d ?C組術后14 d ?C組術后28 d
Figure2.
The expression of MyoD by immunohistochemistry staining in each group at different time points after operation (Inverted microscope×200) ?Group A at 6 hours ?Group B at 3 days ?Group B at 7 days ?Group B at 14 days ?Group B at 28 days ?Group C at 3 days ?Group C at 7 days ?Group C at 14 days ?Group C at 28 days
2.5 相關性分析
失神經腓腸肌中miRNA-1、MyoD基因相對表達量與腓腸肌濕重比在術后3 d（r=0.030，P=0.955；r=0.019，P=0.971）、7 d（r=0.179，P=0.734；r=0.027，P=0.960）時無相關性；14 d（r=0.816，P=0.039；r=0.753，P=0.047）、28 d（r=0.929，P=0.007；r=0.941，P=0.005）時成正相關。各時間點MyoD與miRNA-1基因相對表達量成正相關（3、7、14、28 d分別為r=0.842，P=0.035；r=0.823，P=0.048；r=0.841，P=0.036；r=0.841，P=0.036）。
3 討論
失神經肌萎縮的治療是周圍神經損傷領域亟待解決的難題。近年來，隨著分子生物學和后基因組學的發展，肌肉特異性miRNA為治療失神經肌萎縮提供了一種新思路。Townley-Tilson等[5]發現，在骨骼肌中存在組織特異性miRNA（miRNA-1、miRNA-133、miRNA-206）參與了肌細胞再生、功能和疾病發生的過程。Koutsoulidou等[6]研究發現人類胚胎發育階段的不同時期，骨骼肌的發生發育過程中miRNA-1、miRNA-133a表達明顯增加。研究證明[7]，miRNA-1、miRNA-133a在肌再生、肌分化過程中對MyoD、血清反應因子（serum response factor，SRF）、肌細胞增強因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）等關鍵蛋白具有重要調節作用，miRNA-1、miRNA-133a通過調節細胞信號通路的某個環節從而參與延緩失神經快、慢肌肌萎縮的過程。離體細胞實驗證明[8]，miRNA-1可促進成肌細胞分化。本實驗結果表明，miRNA-1與MyoD的表達有相關性，說明在活體大鼠骨骼肌內，miRNA-1在骨骼肌失神經萎縮后參與成肌細胞的分化過程。
MyoD是成肌調節因子家族（myogenic regulatory factor，MRF）四成員（MyoD、MRF5、Myogenin、MRF4）之一，成肌細胞激活后即上調MRF家族成員表達。同時實驗證明成肌細胞通過MyoD和/或MRF5信號通路激活并開始成肌分化過程[9]；并且MyoD促進成肌細胞增殖，在細胞修復中起重要作用[10]。研究顯示，小鼠骨骼肌再生時成肌細胞激活早期表達的MyoD和/或MRF5，隨后所有增生的成肌細胞均表達MyoD，說明MyoD對成肌細胞增殖有促進作用，并可作為反映肌肉再生的指標[11]。MyoD調節成肌細胞增殖轉向最終分化，而缺乏MyoD的小鼠則分化延遲[12]。上述MyoD的這些作用不是獨立完成的，其需與MEF2共同作用，進而激活靶基因的啟動子來完成[13]；而SRF則與MyoD基因遠端調節區域中的CArG元件結合，進一步促使MyoD激活骨骼肌成肌細胞和肌衛星細胞[14]。結合本實驗結果，即失神經及被動運動干預后各時間點miRNA-1、MyoD和成肌細胞分化趨勢相應變化，我們推測miRNA-1促進成肌細胞分化可能是通過MEF2和SRF形成負性調節環路來實現的，而在這兩個負性調節環路中MyoD起到十分重要的作用，通過下調MyoD的抑制因子而上調MyoD基因，這種miRNA與成肌轉錄調節因子之間的反饋調節可使平衡向肌分化方向轉化，導致肌細胞永久分化，以延緩或治療失神經骨骼肌萎縮。骨骼肌萎縮在早期（失神經3、7 d時）主要表現為蛋白質分解，因而促成肌細胞分化延緩失神經骨骼肌萎縮的作用不明顯，隨著時間延長，這種作用發揮越來越明顯。
力學刺激是維持細胞生存和生長的重要細胞外刺激，在成肌細胞的激活、增殖與分化中扮演重要角色。目前有研究表明，運動的性質、強度、時間、運動后恢復期的活動形式以及運動營養等，可能對成肌細胞與運動的反應機制有著重要影響[15]；持續重復運動刺激可使活化狀態的衛星細胞募集完成增殖[16]。但上述研究對象是正常人體或動物骨骼肌。本實驗研究對象為失神經萎縮骨骼肌，可進一步為力學刺激或被動運動對骨骼肌或成肌細胞的影響提供實驗依據。隨著研究的深入，成肌細胞活化、增殖及分化過程中新的調控機制不斷被發現，如miRNA、DNA甲基化等調控成肌細胞分化[17-19]。有研究表明[20]，肌肉特異性miRNA與人體伸膝肌肉活動強度成正相關，考慮是由于肌肉特異性miRNA在調節肌肉特定基因表達和蛋白質翻譯過程中起到關鍵作用。本實驗結果顯示，被動運動干預后，miRNA-1表達與失神經組比較有顯著差異，我們推測被動運動的干預可能通過改變細胞微環境或力學刺激骨骼肌，增強miRNA-1的表達，從而促進成肌細胞的分化。
綜上述，被動運動是延緩肌萎縮的一種有效防治方法，它可通過多種作用機制來延緩失神經骨骼肌萎縮，本實驗結果表明miRNA-1促進成肌細胞分化是其一個重要機制。但miRNA-1促進成肌細胞分化在失神經骨骼肌肌萎縮防治中發揮的具體分子機制及通路尚需進一步研究，以便為臨床上miRNA-1治療骨骼肌失神經肌萎縮提供更好的思路及依據。
