引用本文： 張強, 陳匯浩, 劉國輝, 宗海洋, 林浩東, 侯春林. 恒河猴坐骨神經損傷修復后脛神經和腓總神經預后差異的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(5): 608-611. doi: 10.7507/1002-1892.20160123 復制
目前，周圍神經損傷治療效果不理想，可能導致患者畸形、功能障礙，甚至癱瘓[1-2]。影響神經功能恢復的原因較多，如患者年齡、損傷平面、損傷時間及損傷程度等[3-4]。臨床研究發現不同周圍神經損傷后，其再生能力和再生速度存在差異，如坐骨神經損傷后，脛神經功能恢復優于腓總神經[5-6]。本實驗選擇與人相似程度高的恒河猴作為研究對象，于同一平面切斷脛神經和腓總神經，在排除損傷平面、損傷時間等相關因素情況下，探究脛神經和腓總神經損傷修復后功能差異是否與神經纖維退變及再生速度不同有關。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年恒河猴9只，雌雄不限，體質量3.5～4.5 kg，平均4.0 kg，由蘇州西山中科實驗動物有限公司提供。戊巴比妥、Luxol Fast Blue染色液（蘇州西山中科藥物研究開發有限公司）。顯微外科器械（寧波市成和顯微外科器械廠）；手術顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司）；光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）；冰凍切片機（Leica公司，德國）；Keypoint2/4-3.02便攜式電生理儀（Alpine BioMed Aps公司，丹麥）。
1.2 實驗方法
將9只實驗動物以1% 戊巴比妥靜脈注射（30?mg/kg）麻醉后，右后肢備皮。于右臀部至大腿后側作長約5 cm切口，顯露梨狀肌下孔至腘窩部坐骨神經，于坐骨神經發出脛神經和腓總神經的平面切斷，造成離斷損傷。損傷后即刻隨機取3只動物，于損傷平面以遠5 mm處切取長5 mm的脛神經及腓總神經作為正常對照，不作修復處理；其余6只動物采用神經外膜縫合法用9-0無創縫線吻合脛神經遠、近端及腓總神經遠、近端，常規閉合切口。術后給予抗生素預防感染，分別于3、8周隨機各取3只動物進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
觀察修復術后實驗動物存活、切口愈合及后肢運動情況。術后3、8 周取動物同上法麻醉后，沿原切口切開，顯露坐骨神經吻合部，行大體觀察。
1.3.2 神經電生理檢測
術后3、8周大體觀察后，以雙極電極作為刺激電極分別置于神經吻合口近、遠端5 mm處進行刺激，同芯針電極為記錄電極，刺激脛神經時插入小腿腓腸肌，刺激腓總神經時插入脛前肌。刺激神經近、遠端，記錄復合肌肉動作電位（compound muscle action potential，CMAP）波幅。
1.3.3 組織學觀察
術后3、8周神經電生理檢測后，切取吻合口遠端5 mm處長5 mm的脛神經、腓總神經，連同術中切取的正常對照神經組織置于甲醛固定，石蠟包埋、切片，片厚5～8 μm，脫蠟至水，然后行Luxol Fast Blue染色。光鏡下觀察脛神經和腓總神經髓鞘形態。每張切片隨機取3個視野，人工計數每個視野中軸突數目，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析每個視野神經組織面積，取均值。按照以下公式分別計算術中及術后3、8周脛神經和腓總神經的軸突密度，軸突密度=每個視野軸突數目∕每個視野神經組織面積；以及術后3、8周軸突再生率，軸突再生率=術后3周或8周平均軸突密度∕術中平均軸突密度×100%。
2 結果
2.1 大體觀察
神經修復術后動物狀態良好，術后第1天開始進食、水，切口愈合良好，無感染發生，右下肢癱瘓。術后3周右下肢肌肉萎縮，小腿前側萎縮較后側明顯；8周，足趾部出現不同程度潰瘍，癱瘓程度較前減輕。大體觀察見吻合部神經膨大，周圍結締組織增生，粘連明顯，術后3、8周吻合口粘連程度無明顯差異。見圖 1。
圖1
術后3周神經吻合部大體觀察 ? ?圖 2 神經電生理檢測 ?術后3周腓總神經 ?術后3周脛神經 ?術后8周腓總神經 ?術后8周脛神經 ? ?圖 3 各時間點腓總神經組織學觀察（Luxol Fast Blue×400） ?術中 ?術后3周 ?術后8周 ? ?圖 4 各時間點脛神經組織學觀察（Luxol Fast Blue×400） ?術中 ?術后3周 ?術后8周
Figure1.
Gross observation at nerve anastomosis site at 3 weeks after repair ? ?Fig. 2 Neural electrophysiological detection ?Common peroneal nerve at 3 weeks after repair ?Tibial nerve at 3 weeks after repair ?Common peroneal nerve at 8 weeks after repair ?Tibial nerve at 8?weeks after repair ? ?Fig. 3 Histological observation of common peroneal nerve (Luxol Fast Blue×400) ?During operation ?At 3 weeks after repair ?At 8 weeks after repair ? ?Fig. 4 Histological observation of tibial nerve (Luxol Fast Blue×400) ?During operation ?At 3 weeks after repair ?At 8 weeks after repair
2.2 神經電生理檢測
術后3周未檢測到脛神經及腓總神經CMAP。術后8周可檢測到脛神經及腓總神經CMAP，3只動物腓總神經CMAP波幅分別為12.0、11.0、12.2 mV，小于脛神經的18.0、19.0、19.7 mV。見圖 2。
2.3 組織學觀察
鏡下觀察示，術中切取的正常神經組織髓鞘呈藍色，軸索不染色，髓鞘呈圓形排列包繞軸索，軸突密度均勻，排列緊密，中間無或僅有少量纖維組織分隔。3只動物脛神經軸突密度分別為2?926、2?630、2?661個/0.1?mm2，平均2?738 個 /0.1?mm2；腓總神經軸突密度分別為2 452、2?781、2?948個/0.1?mm2，平均2 727個/0.1 mm2。
術后3周，髓鞘崩解，無完整髓鞘，變性的軸突殘留“空泡樣”不著色區，在原軸突崩解殘留區可見部分再生髓鞘，呈團狀，未形成包繞軸索的管道樣結構，其間纖維組織增多，分割、包繞神經纖維，此時神經纖維以變性為主，伴少量再生軸突。3只動物脛神經軸突密度分別為1 104、1 032、1 518 個/0.1 mm2，平均1?218個/0.1?mm2；腓總神經軸突密度分別為370、315、398個/0.1 mm2，平均361個/0.1 mm2。腓總神經軸突較脛神經明顯減少，其軸突再生率僅為13.2%，遠低于脛神經的44.5%。
術后8周，腓總神經髓鞘進一步減少，再生髓鞘少，其中僅有少數髓鞘形成包繞軸索的管道樣結構，增生的纖維組織進一步增多；而脛神經再生的髓鞘已部分形成包繞軸索的管道樣結構，神經再生速度較腓總神經快，神經纖維以再生軸突為主。3只動物脛神經軸突密度分別為950、978、970 個 /0.1?mm2，平均966個/0.1 mm2；腓總神經軸突密度分別為305、270、268個/0.1 mm2，平均281 個 /0.1 mm2。腓總神經軸突再生率為10.3%，明顯低于脛神經的35.3%。見圖 3、4。
3 討論
與中樞神經相比，周圍神經再生能力強，損傷修復后功能可得到一定程度恢復，但這種再生能力通常不足以完全修復受損神經[7-8]，如何促進神經纖維再生、提高周圍神經修復效果具有重要意義。臨床上發現，不同周圍神經在同一平面損傷后，其預后也存在明顯差異。早在上世紀，人們已發現采用同樣方法修復脛神經和腓總神經后，脛神經感覺運動功能恢復優于腓總神經 [9-12]。但其原因尚未明確。近年來，坐骨神經損傷發生率逐漸增高，通常伴發于髖臼骨折[13]、髖關節脫位[14]、銳器切割傷、藥物注射損傷等。其中由于解剖因素，腓總神經損傷發生率較脛神經高[15-16]。腓總神經損傷是下肢最常見的神經損傷[17]，因此研究脛神經和腓總神經損傷后功能差異原因，可為提高脛神經和腓總神經的修復效果提供理論依據。
周圍神經損傷后再生是一個復雜而協調的過程，在這一過程中最初表現為受損神經遠端軸突和髓鞘變性崩解，發生瓦勒變性，僅留下包裹神經纖維的基膜，之后軸突遠端雪旺細胞增生，在基膜圍成的神經膜管內形成一條實心的細胞索Büngher帶，包繞再生軸突形成髓鞘[18-19]。本實驗采用神經縫合修復坐骨神經后，在術中及術后3、8周取材計算脛神經和腓總神經軸突密度，發現術中切取的正常脛神經和腓總神經軸突密度相似；術后3周脛神經和腓總神經纖維以變性為主，軸突再生率分別為44.5%和13.2%，此時脛神經和腓總神經軸突均較正常神經組織減少，其中腓總神經減少尤其明顯，脛神經和腓總神經CMAP均未測到；術后8周，脛神經和腓總神經得到不同程度再生，軸突再生率分別為35.3%和10.3%，此時可測到脛神經和腓總神經CMAP，但脛神經CMAP波幅較腓總神經大，提示脛神經恢復較快。脛神經在損傷后神經軸突變性較腓總神經慢，而軸突再生又早于腓總神經，兩種神經存在軸突退變與再生時間上的差異可能是導致坐骨神經損傷修復后，脛神經功能恢復優于腓總神經的原因，但有待進一步研究。另外，因恒河猴價格昂貴，觀測樣本量少，觀察指標也較少，這些均需在后期研究中加以完善。
目前，周圍神經損傷治療效果不理想，可能導致患者畸形、功能障礙，甚至癱瘓[1-2]。影響神經功能恢復的原因較多，如患者年齡、損傷平面、損傷時間及損傷程度等[3-4]。臨床研究發現不同周圍神經損傷后，其再生能力和再生速度存在差異，如坐骨神經損傷后，脛神經功能恢復優于腓總神經[5-6]。本實驗選擇與人相似程度高的恒河猴作為研究對象，于同一平面切斷脛神經和腓總神經，在排除損傷平面、損傷時間等相關因素情況下，探究脛神經和腓總神經損傷修復后功能差異是否與神經纖維退變及再生速度不同有關。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年恒河猴9只，雌雄不限，體質量3.5～4.5 kg，平均4.0 kg，由蘇州西山中科實驗動物有限公司提供。戊巴比妥、Luxol Fast Blue染色液（蘇州西山中科藥物研究開發有限公司）。顯微外科器械（寧波市成和顯微外科器械廠）；手術顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司）；光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）；冰凍切片機（Leica公司，德國）；Keypoint2/4-3.02便攜式電生理儀（Alpine BioMed Aps公司，丹麥）。
1.2 實驗方法
將9只實驗動物以1% 戊巴比妥靜脈注射（30?mg/kg）麻醉后，右后肢備皮。于右臀部至大腿后側作長約5 cm切口，顯露梨狀肌下孔至腘窩部坐骨神經，于坐骨神經發出脛神經和腓總神經的平面切斷，造成離斷損傷。損傷后即刻隨機取3只動物，于損傷平面以遠5 mm處切取長5 mm的脛神經及腓總神經作為正常對照，不作修復處理；其余6只動物采用神經外膜縫合法用9-0無創縫線吻合脛神經遠、近端及腓總神經遠、近端，常規閉合切口。術后給予抗生素預防感染，分別于3、8周隨機各取3只動物進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
觀察修復術后實驗動物存活、切口愈合及后肢運動情況。術后3、8 周取動物同上法麻醉后，沿原切口切開，顯露坐骨神經吻合部，行大體觀察。
1.3.2 神經電生理檢測
術后3、8周大體觀察后，以雙極電極作為刺激電極分別置于神經吻合口近、遠端5 mm處進行刺激，同芯針電極為記錄電極，刺激脛神經時插入小腿腓腸肌，刺激腓總神經時插入脛前肌。刺激神經近、遠端，記錄復合肌肉動作電位（compound muscle action potential，CMAP）波幅。
1.3.3 組織學觀察
術后3、8周神經電生理檢測后，切取吻合口遠端5 mm處長5 mm的脛神經、腓總神經，連同術中切取的正常對照神經組織置于甲醛固定，石蠟包埋、切片，片厚5～8 μm，脫蠟至水，然后行Luxol Fast Blue染色。光鏡下觀察脛神經和腓總神經髓鞘形態。每張切片隨機取3個視野，人工計數每個視野中軸突數目，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析每個視野神經組織面積，取均值。按照以下公式分別計算術中及術后3、8周脛神經和腓總神經的軸突密度，軸突密度=每個視野軸突數目∕每個視野神經組織面積；以及術后3、8周軸突再生率，軸突再生率=術后3周或8周平均軸突密度∕術中平均軸突密度×100%。
2 結果
2.1 大體觀察
神經修復術后動物狀態良好，術后第1天開始進食、水，切口愈合良好，無感染發生，右下肢癱瘓。術后3周右下肢肌肉萎縮，小腿前側萎縮較后側明顯；8周，足趾部出現不同程度潰瘍，癱瘓程度較前減輕。大體觀察見吻合部神經膨大，周圍結締組織增生，粘連明顯，術后3、8周吻合口粘連程度無明顯差異。見圖 1。
圖1
術后3周神經吻合部大體觀察 ? ?圖 2 神經電生理檢測 ?術后3周腓總神經 ?術后3周脛神經 ?術后8周腓總神經 ?術后8周脛神經 ? ?圖 3 各時間點腓總神經組織學觀察（Luxol Fast Blue×400） ?術中 ?術后3周 ?術后8周 ? ?圖 4 各時間點脛神經組織學觀察（Luxol Fast Blue×400） ?術中 ?術后3周 ?術后8周
Figure1.
Gross observation at nerve anastomosis site at 3 weeks after repair ? ?Fig. 2 Neural electrophysiological detection ?Common peroneal nerve at 3 weeks after repair ?Tibial nerve at 3 weeks after repair ?Common peroneal nerve at 8 weeks after repair ?Tibial nerve at 8?weeks after repair ? ?Fig. 3 Histological observation of common peroneal nerve (Luxol Fast Blue×400) ?During operation ?At 3 weeks after repair ?At 8 weeks after repair ? ?Fig. 4 Histological observation of tibial nerve (Luxol Fast Blue×400) ?During operation ?At 3 weeks after repair ?At 8 weeks after repair
2.2 神經電生理檢測
術后3周未檢測到脛神經及腓總神經CMAP。術后8周可檢測到脛神經及腓總神經CMAP，3只動物腓總神經CMAP波幅分別為12.0、11.0、12.2 mV，小于脛神經的18.0、19.0、19.7 mV。見圖 2。
2.3 組織學觀察
鏡下觀察示，術中切取的正常神經組織髓鞘呈藍色，軸索不染色，髓鞘呈圓形排列包繞軸索，軸突密度均勻，排列緊密，中間無或僅有少量纖維組織分隔。3只動物脛神經軸突密度分別為2?926、2?630、2?661個/0.1?mm2，平均2?738 個 /0.1?mm2；腓總神經軸突密度分別為2 452、2?781、2?948個/0.1?mm2，平均2 727個/0.1 mm2。
術后3周，髓鞘崩解，無完整髓鞘，變性的軸突殘留“空泡樣”不著色區，在原軸突崩解殘留區可見部分再生髓鞘，呈團狀，未形成包繞軸索的管道樣結構，其間纖維組織增多，分割、包繞神經纖維，此時神經纖維以變性為主，伴少量再生軸突。3只動物脛神經軸突密度分別為1 104、1 032、1 518 個/0.1 mm2，平均1?218個/0.1?mm2；腓總神經軸突密度分別為370、315、398個/0.1 mm2，平均361個/0.1 mm2。腓總神經軸突較脛神經明顯減少，其軸突再生率僅為13.2%，遠低于脛神經的44.5%。
術后8周，腓總神經髓鞘進一步減少，再生髓鞘少，其中僅有少數髓鞘形成包繞軸索的管道樣結構，增生的纖維組織進一步增多；而脛神經再生的髓鞘已部分形成包繞軸索的管道樣結構，神經再生速度較腓總神經快，神經纖維以再生軸突為主。3只動物脛神經軸突密度分別為950、978、970 個 /0.1?mm2，平均966個/0.1 mm2；腓總神經軸突密度分別為305、270、268個/0.1 mm2，平均281 個 /0.1 mm2。腓總神經軸突再生率為10.3%，明顯低于脛神經的35.3%。見圖 3、4。
3 討論
與中樞神經相比，周圍神經再生能力強，損傷修復后功能可得到一定程度恢復，但這種再生能力通常不足以完全修復受損神經[7-8]，如何促進神經纖維再生、提高周圍神經修復效果具有重要意義。臨床上發現，不同周圍神經在同一平面損傷后，其預后也存在明顯差異。早在上世紀，人們已發現采用同樣方法修復脛神經和腓總神經后，脛神經感覺運動功能恢復優于腓總神經 [9-12]。但其原因尚未明確。近年來，坐骨神經損傷發生率逐漸增高，通常伴發于髖臼骨折[13]、髖關節脫位[14]、銳器切割傷、藥物注射損傷等。其中由于解剖因素，腓總神經損傷發生率較脛神經高[15-16]。腓總神經損傷是下肢最常見的神經損傷[17]，因此研究脛神經和腓總神經損傷后功能差異原因，可為提高脛神經和腓總神經的修復效果提供理論依據。
周圍神經損傷后再生是一個復雜而協調的過程，在這一過程中最初表現為受損神經遠端軸突和髓鞘變性崩解，發生瓦勒變性，僅留下包裹神經纖維的基膜，之后軸突遠端雪旺細胞增生，在基膜圍成的神經膜管內形成一條實心的細胞索Büngher帶，包繞再生軸突形成髓鞘[18-19]。本實驗采用神經縫合修復坐骨神經后，在術中及術后3、8周取材計算脛神經和腓總神經軸突密度，發現術中切取的正常脛神經和腓總神經軸突密度相似；術后3周脛神經和腓總神經纖維以變性為主，軸突再生率分別為44.5%和13.2%，此時脛神經和腓總神經軸突均較正常神經組織減少，其中腓總神經減少尤其明顯，脛神經和腓總神經CMAP均未測到；術后8周，脛神經和腓總神經得到不同程度再生，軸突再生率分別為35.3%和10.3%，此時可測到脛神經和腓總神經CMAP，但脛神經CMAP波幅較腓總神經大，提示脛神經恢復較快。脛神經在損傷后神經軸突變性較腓總神經慢，而軸突再生又早于腓總神經，兩種神經存在軸突退變與再生時間上的差異可能是導致坐骨神經損傷修復后，脛神經功能恢復優于腓總神經的原因，但有待進一步研究。另外，因恒河猴價格昂貴，觀測樣本量少，觀察指標也較少，這些均需在后期研究中加以完善。
