引用本文： 陳禎煒, 劉垠, 肖敏勤, 肖鴻, 邱煒, 趙亞南. 過表達Smad7基因對瘢痕疙瘩成纖維細胞的影響. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(7): 871-875. doi: 10.7507/1002-1892.20160177 復制
瘢痕疙瘩是指皮膚傷口愈合后在真皮內所形成的過度生長的異常纖維化組織，其組織學特點為大量成纖維細胞增殖，細胞外基質尤其是Ⅰ、Ⅲ型膠原過度沉積，膠原纖維排列紊亂等；形態學上表現為突出于皮膚表面及“腫瘤樣生長”，影響美觀，病變內可產生炎性壞死或液化性壞死，若發生在關節處還可引起活動受限。目前瘢痕疙瘩治療方式多樣，但療效并不確切，一直是整形外科、燒傷科、皮膚科的難題之一[1]。瘢痕疙瘩的形成與許多因素有關，其中TGF-β/Smad信號通路是目前最基礎、最重要的機制。Smad蛋白是該通路中的信號中介分子，它能把TGF-β與其受體結合后產生的信號從細胞質傳導至細胞核內，調節膠原蛋白的合成[2]。其中Smad7蛋白屬于負反饋調節因子，它能夠作用于信號通路中的多個位點發揮抑制作用，最終影響膠原合成。本實驗通過研究瘢痕疙瘩成纖維細胞（keloid fibroblasts，KFb）轉染Smad7基因過表達載體后，對細胞內Smad7、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因、蛋白表達和細胞增殖的影響，探討Smad7蛋白對瘢痕疙瘩生長有無抑制作用。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
標本來源于昆明醫科大學第二附屬醫院整形外科10例男性瘢痕疙瘩患者（排除其他疾病），年齡20～25歲。經患者同意后，取手術切下的瘢痕疙瘩組織，于無菌條件下體外培養KFb[3]，每1～2天換液。
Smad7質粒模板、E.coli DH5α感受態細胞（上海艾博思生物科技有限公司）；XhoⅠ、BamHⅠ（Fermentas公司，美國）；空載體pcDNA3.1（-）（Invitrogen公司，美國）；質粒抽提試劑盒（上海諾倫生物醫藥有限公司）；實時熒光定量PCR試劑盒、Trizol、RNA溶解液（南京百斯凱科技有限公司）；DEPC（北京博奧拓達科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Smad7抗體、Ⅰ型膠原抗體、Ⅲ型膠原抗體（上海艾博抗貿易有限公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體（南京伯利德生物科技有限公司）；β-actin、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（杭州華安生物技術有限公司）；RPMI1640基礎培養基（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；青霉素和鏈霉素混合液（北京夏斯生物科技有限公司）；MTT試劑盒（上海Sigma-aldrich貿易有限公司）。
離心機、PCR儀、實時熒光定量PCR儀（Eppendorf公司，德國）；電泳儀（上海天能科技有限公司）；CO2培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；酶標儀（Thermo公司，美國）。
1.2 Smad7基因過表達載體構建
從GenBank中查詢Smad7基因以及上、下游引物序列，用VectorNTI軟件進行引物設計（上海艾博思生物科技有限公司設計），上游：5'-TACCGGACTCAGATCTCGAGGCCACCATGTTCAGGACCAAACGATCT-3'，下游5'-TTGGTACCGAGCTCGGATCCCCGGCTGTTGAAGATGACC-3'，對Smad7基因進行擴增。PCR反應體系：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）10μL，dNTP Mixture 4μL，上、下游引物各1μL，Smad7質粒模板190 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 5μL，DNA Polymerase 0.5μL，水50μL；反應條件：98℃、10 s，55℃、5 s，72℃、1?min，30個循環。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳并用膠回收Smad7基因片段；用限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ對表達載體進行雙酶切，膠回收得到線性化表達載體。將Smad7基因片段和線性化表達載體以摩爾比2:1加入離心管中進行重組反應，42℃孵育30?min，轉化E.coli DH5α感受態細胞。挑取平板上長出的轉化子重懸于10μL培養液中，取1μL作為模板進行菌落PCR鑒定。PCR反應體系：Permix Taq 25μL，轉化子模板1μL，上、下游引物各1μL，水50μL；反應條件：94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1?min，30個循環。菌落鑒定得到的陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測序驗證，測序通過的陽性克隆進行質粒抽提。
1.3 實驗分組及觀測指標
1.3.1 實驗分組
取第5代對數生長期KFb分為3組，A組為未轉染組，培養基繼續培養；B組為空載體pcDNA3.1（-）轉染細胞組；C組為Smad7基因過表達載體pcDNA3.1（-）-smad7轉染細胞組。
1.3.2 實時熒光定量PCR檢測KFb Smad7、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因表達
A組于6孔板中培養細胞，待細胞貼壁80%時收集細胞；B、C組取對數生長期細胞接種于6孔板中過夜培養，分別轉染48 h后收集細胞；每組均取3孔。采用Trizol提取各組細胞總RNA后，用Primer5應用軟件設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。各基因引物序列見表 1。采用兩步法，以β-actin為內參，PCR反應體系：上、下游引物各0.4μL，2×Supermix 10μL，PASSIVE DYE 0.4μL，目的基因DNA模板2μL，水6.8μL；反應條件：預變性95℃、3 min，95℃、30 s，55℃、20 s，72℃、20 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算各目的基因mRNA相對表達量。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes
1.3.3 Western blot檢測KFb Smad7、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達
各組同上法培養并收集細胞，每組均取3孔。冰浴PBS清洗細胞2次；以離心半徑20 cm、12?000?r/ min離心15 min，收集細胞，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。總蛋白行SDS-PAGE電泳，結束后轉移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量一抗，4℃冰箱中過夜，常溫下完成二抗雜交，比例為1:2?000～1:5?000，再次洗膜后顯影，將膜放在化學發光儀中收集信號并拍照，Image J軟件測定內參蛋白β-actin及待測蛋白條帶的灰度分析值，以待測蛋白與內參蛋白灰度分析值比值作為其相對表達量。
1.3.4 MTT法檢測KFb增殖能力
各組細胞同上法培養，A組細胞繼續培養，B、C組細胞轉染24 h后，加入胰蛋白酶消化細胞，以5 000個/孔密度接種于96孔板，每孔設3個復孔。于培養24、48、72 h后各組加入10μL 5 g/L MTT溶液，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養4 h，加入150μL DMSO，震蕩10 min，用酶標儀測定波長595 nm處的吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實時熒光定量PCR檢測
C組Smad7 mRNA相對表達量顯著高于A、B組，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA相對表達量顯著低于A、B組，差異均有統計學意義（P < 0.01）。A、B組間比較Smad7 mRNA相對表達量差異無統計學意義（P > 0.05）；B組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA相對表達量高于A組，差異有統計學意義（P < 0.01）。見表 2。
表2
實時熒光定量PCR檢測各組各基因相對表達量（n=3，2.2 Western blot檢測
C組Smad7蛋白相對表達量顯著高于A、B組，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白相對表達量顯著低于A、B組，差異均有統計學意義（P < 0.01）；B組Smad7、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白相對表達量均低于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.01）。見圖 1、表 3。
圖1
Western blot檢測各組各蛋白表達
1：A組2：B組3：C組
Figure1. Protein expression detection by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group
表3
Western blot檢測各組各蛋白相對表達量（n=3，2.3 MTT法檢測KFb增殖能力
培養各時間點C組細胞增殖能力均小于A、B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、B組間差異均無統計學意義（P > 0.05）。隨培養時間延長，C組細胞增殖能力逐漸降低，A、B組逐漸升高，各組間比較差異均有統計學意義（P < 0.01）。見表 4。
表4
MTT法檢測各組細胞增殖能力（n=3，3 討論
瘢痕疙瘩的形成主要與遺傳、免疫、細胞因子、成纖維細胞凋亡異常等有關，其中TGF-β/Smad信號通路是目前研究熱點，對瘢痕疙瘩的形成起重要作用。TGF-β在哺乳動物中有3種亞型，即TGF-β1、β2、β3。夏鵬等[4]發現在創傷初期TGF-β1即開始增高，在創傷修復過程中持續高表達。有學者利用沙利度胺和他克莫司抑制瘢痕疙瘩TGF-β1的作用，發現成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成也受到明顯抑制[5-6]。大量研究證實TGF-β1在信號通路中的重要性，它可以刺激成纖維細胞增生，提高Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-平滑肌肌動蛋白的表達，促進成纖維細胞表型轉換[7-9]。
TGF-β信號對成纖維細胞產生效應必須經過細胞內Smad蛋白分子的轉導和一系列復雜的正、負反饋調節機制，正、負反饋調節的失衡對瘢痕疙瘩的發生和發展起著重要作用。當細胞外的TGF信號分子到達細胞膜與Ⅰ型受體結合后，細胞質內的Smad蛋白發揮信號轉導中介的作用，將信號通過異源三聚體的形式轉運至細胞核內，激活靶基因的啟動子。Smad蛋白共有9種類型（Smad1～9），其中發揮負調控作用的核心分子主要是作為抑制型Smad（I-Smad）的Smad7，Smad7的特異性抑制作用主要體現在競爭性結合細胞膜表面TGF-βⅠ型受體，阻止Smad2、3的激活和磷酸化，未磷酸化的Smad2、3不能與Smad4結合形成異源復合物，進而不能轉位到細胞核調控靶基因的轉錄[10-11]。本實驗發現過表達KFb中Smad7基因，能有效降低細胞外基質的主要成分Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的mRNA和蛋白質水平，說明Smad7能抑制瘢痕疙瘩的生長。此外，我們預期A、B組間各項指標差異應均無統計學意義，但本研究實時熒光定量PCR和Western?blot結果顯示，B組KFb轉染空載體pcDNA3.1（-）后，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的基因表達水平高于A組，而各蛋白表達水平低于A組，出現該結果可能與轉染的空載體特性有關，這也是本研究的不足之處。
Smad7與許多疾病的發生有著密切關系。李春輝等[12]發現胃癌組織中Smad7 mRNA呈高表達水平，提示Smad7有助于惡性腫瘤的發生；而Smad7的低表達水平能促進肝星狀細胞發生纖維化[13]。1999年，Brodin等[14]發現在閹割后的小鼠前列腺上皮細胞內Smad7表達增高，并出現凋亡小體的形成和染色體凝聚現象，提示Smad7與細胞凋亡有關。2000年，Landstr?m等[15]將Smad7基因轉染至人前列腺癌細胞后發生細胞凋亡，同時發現降低Smad7表達水平能阻止與TGF-β信號通路有關的細胞凋亡。近來研究顯示，Smad7生物學作用的發揮也可以與TGF-β無關[16]。細胞凋亡相關基因如cmy-c、bcl-2、p53等的調節異常，是導致瘢痕疙瘩的一個重要原因[17-18]。Crowston等[19]改變Fas蛋白的表達量，發現KFb發生了細胞凋亡。劉永波等[20]利用聚合酶鏈反應單鏈構象多態性和基因測序技術，發現瘢痕疙瘩p53基因外顯子4、5、6存在基因突變，而增生性瘢痕和正常皮膚組織未發現突變。本研究MTT法檢測示，C組轉染Smad7基因過表達載體后KFb數量逐漸降低，進一步提示Smad7能促進細胞凋亡。根據上述文獻及本研究結果，我們設想Smad7可能通過增強或減弱細胞凋亡相關基因的表達，從而引起凋亡調控的異常，但其具體發生機制及是否依靠TGF-β途徑還需進一步研究。
綜上述，將Smad7過表達載體轉染至KFb后，細胞內Smad7基因轉錄水平和蛋白表達水平顯著提高，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因轉錄水平和蛋白表達水平則顯著降低，成纖維細胞增殖受到明顯抑制。進一步闡明了Smad7通過加強TGF-β/Smad信號通路中負調控機制而發揮抗瘢痕作用，為瘢痕疙瘩的基因水平治療提供了思路，有望在臨床中得到驗證。
瘢痕疙瘩是指皮膚傷口愈合后在真皮內所形成的過度生長的異常纖維化組織，其組織學特點為大量成纖維細胞增殖，細胞外基質尤其是Ⅰ、Ⅲ型膠原過度沉積，膠原纖維排列紊亂等；形態學上表現為突出于皮膚表面及“腫瘤樣生長”，影響美觀，病變內可產生炎性壞死或液化性壞死，若發生在關節處還可引起活動受限。目前瘢痕疙瘩治療方式多樣，但療效并不確切，一直是整形外科、燒傷科、皮膚科的難題之一[1]。瘢痕疙瘩的形成與許多因素有關，其中TGF-β/Smad信號通路是目前最基礎、最重要的機制。Smad蛋白是該通路中的信號中介分子，它能把TGF-β與其受體結合后產生的信號從細胞質傳導至細胞核內，調節膠原蛋白的合成[2]。其中Smad7蛋白屬于負反饋調節因子，它能夠作用于信號通路中的多個位點發揮抑制作用，最終影響膠原合成。本實驗通過研究瘢痕疙瘩成纖維細胞（keloid fibroblasts，KFb）轉染Smad7基因過表達載體后，對細胞內Smad7、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因、蛋白表達和細胞增殖的影響，探討Smad7蛋白對瘢痕疙瘩生長有無抑制作用。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
標本來源于昆明醫科大學第二附屬醫院整形外科10例男性瘢痕疙瘩患者（排除其他疾病），年齡20～25歲。經患者同意后，取手術切下的瘢痕疙瘩組織，于無菌條件下體外培養KFb[3]，每1～2天換液。
Smad7質粒模板、E.coli DH5α感受態細胞（上海艾博思生物科技有限公司）；XhoⅠ、BamHⅠ（Fermentas公司，美國）；空載體pcDNA3.1（-）（Invitrogen公司，美國）；質粒抽提試劑盒（上海諾倫生物醫藥有限公司）；實時熒光定量PCR試劑盒、Trizol、RNA溶解液（南京百斯凱科技有限公司）；DEPC（北京博奧拓達科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Smad7抗體、Ⅰ型膠原抗體、Ⅲ型膠原抗體（上海艾博抗貿易有限公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體（南京伯利德生物科技有限公司）；β-actin、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（杭州華安生物技術有限公司）；RPMI1640基礎培養基（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；青霉素和鏈霉素混合液（北京夏斯生物科技有限公司）；MTT試劑盒（上海Sigma-aldrich貿易有限公司）。
離心機、PCR儀、實時熒光定量PCR儀（Eppendorf公司，德國）；電泳儀（上海天能科技有限公司）；CO2培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；酶標儀（Thermo公司，美國）。
1.2 Smad7基因過表達載體構建
從GenBank中查詢Smad7基因以及上、下游引物序列，用VectorNTI軟件進行引物設計（上海艾博思生物科技有限公司設計），上游：5'-TACCGGACTCAGATCTCGAGGCCACCATGTTCAGGACCAAACGATCT-3'，下游5'-TTGGTACCGAGCTCGGATCCCCGGCTGTTGAAGATGACC-3'，對Smad7基因進行擴增。PCR反應體系：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）10μL，dNTP Mixture 4μL，上、下游引物各1μL，Smad7質粒模板190 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 5μL，DNA Polymerase 0.5μL，水50μL；反應條件：98℃、10 s，55℃、5 s，72℃、1?min，30個循環。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳并用膠回收Smad7基因片段；用限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ對表達載體進行雙酶切，膠回收得到線性化表達載體。將Smad7基因片段和線性化表達載體以摩爾比2:1加入離心管中進行重組反應，42℃孵育30?min，轉化E.coli DH5α感受態細胞。挑取平板上長出的轉化子重懸于10μL培養液中，取1μL作為模板進行菌落PCR鑒定。PCR反應體系：Permix Taq 25μL，轉化子模板1μL，上、下游引物各1μL，水50μL；反應條件：94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1?min，30個循環。菌落鑒定得到的陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測序驗證，測序通過的陽性克隆進行質粒抽提。
1.3 實驗分組及觀測指標
1.3.1 實驗分組
取第5代對數生長期KFb分為3組，A組為未轉染組，培養基繼續培養；B組為空載體pcDNA3.1（-）轉染細胞組；C組為Smad7基因過表達載體pcDNA3.1（-）-smad7轉染細胞組。
1.3.2 實時熒光定量PCR檢測KFb Smad7、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因表達
A組于6孔板中培養細胞，待細胞貼壁80%時收集細胞；B、C組取對數生長期細胞接種于6孔板中過夜培養，分別轉染48 h后收集細胞；每組均取3孔。采用Trizol提取各組細胞總RNA后，用Primer5應用軟件設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。各基因引物序列見表 1。采用兩步法，以β-actin為內參，PCR反應體系：上、下游引物各0.4μL，2×Supermix 10μL，PASSIVE DYE 0.4μL，目的基因DNA模板2μL，水6.8μL；反應條件：預變性95℃、3 min，95℃、30 s，55℃、20 s，72℃、20 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算各目的基因mRNA相對表達量。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes
1.3.3 Western blot檢測KFb Smad7、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達
各組同上法培養并收集細胞，每組均取3孔。冰浴PBS清洗細胞2次；以離心半徑20 cm、12?000?r/ min離心15 min，收集細胞，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。總蛋白行SDS-PAGE電泳，結束后轉移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量一抗，4℃冰箱中過夜，常溫下完成二抗雜交，比例為1:2?000～1:5?000，再次洗膜后顯影，將膜放在化學發光儀中收集信號并拍照，Image J軟件測定內參蛋白β-actin及待測蛋白條帶的灰度分析值，以待測蛋白與內參蛋白灰度分析值比值作為其相對表達量。
1.3.4 MTT法檢測KFb增殖能力
各組細胞同上法培養，A組細胞繼續培養，B、C組細胞轉染24 h后，加入胰蛋白酶消化細胞，以5 000個/孔密度接種于96孔板，每孔設3個復孔。于培養24、48、72 h后各組加入10μL 5 g/L MTT溶液，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養4 h，加入150μL DMSO，震蕩10 min，用酶標儀測定波長595 nm處的吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實時熒光定量PCR檢測
C組Smad7 mRNA相對表達量顯著高于A、B組，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA相對表達量顯著低于A、B組，差異均有統計學意義（P < 0.01）。A、B組間比較Smad7 mRNA相對表達量差異無統計學意義（P > 0.05）；B組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA相對表達量高于A組，差異有統計學意義（P < 0.01）。見表 2。
表2
實時熒光定量PCR檢測各組各基因相對表達量（n=3，2.2 Western blot檢測
C組Smad7蛋白相對表達量顯著高于A、B組，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白相對表達量顯著低于A、B組，差異均有統計學意義（P < 0.01）；B組Smad7、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白相對表達量均低于A組，比較差異均有統計學意義（P < 0.01）。見圖 1、表 3。
圖1
Western blot檢測各組各蛋白表達
1：A組2：B組3：C組
Figure1. Protein expression detection by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group
表3
Western blot檢測各組各蛋白相對表達量（n=3，2.3 MTT法檢測KFb增殖能力
培養各時間點C組細胞增殖能力均小于A、B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、B組間差異均無統計學意義（P > 0.05）。隨培養時間延長，C組細胞增殖能力逐漸降低，A、B組逐漸升高，各組間比較差異均有統計學意義（P < 0.01）。見表 4。
表4
MTT法檢測各組細胞增殖能力（n=3，3 討論
瘢痕疙瘩的形成主要與遺傳、免疫、細胞因子、成纖維細胞凋亡異常等有關，其中TGF-β/Smad信號通路是目前研究熱點，對瘢痕疙瘩的形成起重要作用。TGF-β在哺乳動物中有3種亞型，即TGF-β1、β2、β3。夏鵬等[4]發現在創傷初期TGF-β1即開始增高，在創傷修復過程中持續高表達。有學者利用沙利度胺和他克莫司抑制瘢痕疙瘩TGF-β1的作用，發現成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成也受到明顯抑制[5-6]。大量研究證實TGF-β1在信號通路中的重要性，它可以刺激成纖維細胞增生，提高Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-平滑肌肌動蛋白的表達，促進成纖維細胞表型轉換[7-9]。
TGF-β信號對成纖維細胞產生效應必須經過細胞內Smad蛋白分子的轉導和一系列復雜的正、負反饋調節機制，正、負反饋調節的失衡對瘢痕疙瘩的發生和發展起著重要作用。當細胞外的TGF信號分子到達細胞膜與Ⅰ型受體結合后，細胞質內的Smad蛋白發揮信號轉導中介的作用，將信號通過異源三聚體的形式轉運至細胞核內，激活靶基因的啟動子。Smad蛋白共有9種類型（Smad1～9），其中發揮負調控作用的核心分子主要是作為抑制型Smad（I-Smad）的Smad7，Smad7的特異性抑制作用主要體現在競爭性結合細胞膜表面TGF-βⅠ型受體，阻止Smad2、3的激活和磷酸化，未磷酸化的Smad2、3不能與Smad4結合形成異源復合物，進而不能轉位到細胞核調控靶基因的轉錄[10-11]。本實驗發現過表達KFb中Smad7基因，能有效降低細胞外基質的主要成分Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的mRNA和蛋白質水平，說明Smad7能抑制瘢痕疙瘩的生長。此外，我們預期A、B組間各項指標差異應均無統計學意義，但本研究實時熒光定量PCR和Western?blot結果顯示，B組KFb轉染空載體pcDNA3.1（-）后，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的基因表達水平高于A組，而各蛋白表達水平低于A組，出現該結果可能與轉染的空載體特性有關，這也是本研究的不足之處。
Smad7與許多疾病的發生有著密切關系。李春輝等[12]發現胃癌組織中Smad7 mRNA呈高表達水平，提示Smad7有助于惡性腫瘤的發生；而Smad7的低表達水平能促進肝星狀細胞發生纖維化[13]。1999年，Brodin等[14]發現在閹割后的小鼠前列腺上皮細胞內Smad7表達增高，并出現凋亡小體的形成和染色體凝聚現象，提示Smad7與細胞凋亡有關。2000年，Landstr?m等[15]將Smad7基因轉染至人前列腺癌細胞后發生細胞凋亡，同時發現降低Smad7表達水平能阻止與TGF-β信號通路有關的細胞凋亡。近來研究顯示，Smad7生物學作用的發揮也可以與TGF-β無關[16]。細胞凋亡相關基因如cmy-c、bcl-2、p53等的調節異常，是導致瘢痕疙瘩的一個重要原因[17-18]。Crowston等[19]改變Fas蛋白的表達量，發現KFb發生了細胞凋亡。劉永波等[20]利用聚合酶鏈反應單鏈構象多態性和基因測序技術，發現瘢痕疙瘩p53基因外顯子4、5、6存在基因突變，而增生性瘢痕和正常皮膚組織未發現突變。本研究MTT法檢測示，C組轉染Smad7基因過表達載體后KFb數量逐漸降低，進一步提示Smad7能促進細胞凋亡。根據上述文獻及本研究結果，我們設想Smad7可能通過增強或減弱細胞凋亡相關基因的表達，從而引起凋亡調控的異常，但其具體發生機制及是否依靠TGF-β途徑還需進一步研究。
綜上述，將Smad7過表達載體轉染至KFb后，細胞內Smad7基因轉錄水平和蛋白表達水平顯著提高，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因轉錄水平和蛋白表達水平則顯著降低，成纖維細胞增殖受到明顯抑制。進一步闡明了Smad7通過加強TGF-β/Smad信號通路中負調控機制而發揮抗瘢痕作用，為瘢痕疙瘩的基因水平治療提供了思路，有望在臨床中得到驗證。
