長鏈非編碼 RNA（lncRNA）Dnm3os 在肌腱周圍組織纖維化和肺纖維化中發揮了重要作用，但其是否參與心肌纖維化過程，目前尚不清楚。為此，本研究利用課題組前期通過胸主動脈縮窄術（TAC）所致的小鼠纖維化模型的心臟組織，以及轉化生長因子-β1（TGF-β1）所誘導的體外心肌成纖維細胞活化模型，采用定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）、蛋白質印跡法 (Western blot) 及膠原凝膠收縮等方法，對心肌成纖維細胞活化表型和 Dnm3os 的表達變化進行鑒定和檢測。并通過 RNA 干擾技術來沉默 Dnm3os，以探究其在心肌成纖維細胞活化過程中的作用。結果表明，Dnm3os 在小鼠纖維化心肌組織和體外培養活化的心肌成纖維細胞中均表達升高，而沉默其表達則可明顯緩解心肌成纖維細胞活化。此外，TGF-β1/Smad2/3 通路在心肌成纖維細胞活化過程中被激活；而沉默 Dnm3os 后，該通路受到抑制。本研究的結果提示，沉默 Dnm3os 可通過抑制 TGF-β1/Smad2/3 信號通路來影響心肌成纖維細胞的活化過程。因此，干預 lncRNA Dnm3os 的表達可能成為治療心肌纖維化的潛在靶點。
引用本文： 孔啟航, 周駿騰, 田格爾, 權月, 吳文超, 劉小菁. 長鏈非編碼RNA Dnm3os在心肌成纖維細胞活化中的作用研究. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(3): 574-582. doi: 10.7507/1001-5515.202102021 復制
引言
心肌纖維化是指壓力超負荷、缺血、炎癥等致病因素導致心肌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）異常增多和過度積聚的病理過程。在此過程中，心肌成纖維細胞會發生表型轉變，活化為肌成纖維細胞[1-3]。心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉換的過程，近年來得到了廣泛關注，但其中具體的機制尚未完全闡明。
長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，可在轉錄調節、分化、細胞重編程等過程中發揮重要作用[4-5]。研究發現，lncRNA 參與了心血管系統調節網絡，其表達異常與心肌肥厚、心力衰竭及心肌梗死等心血管疾病的發生、發展密切相關[6-8]。LncRNA Dnm3os 是動力蛋白（dynamin-3）的反義鏈通過可變剪切產生的 lncRNA 分子[9]。研究顯示，Dnm3os 與多種細胞的增殖、分化相關，包括視網膜母細胞瘤細胞的增殖[10]、上皮細胞-間充質轉化[11]。新近研究表明，lncRNA Dnm3os 通過轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路參與肌腱周圍組織纖維化[12]和肺纖維化[13]的過程；此外，它通過轉錄因子 Twist1、microRNA-214 和結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）構成的信號軸調節了肝纖維化的發展過程[14]。但 Dnm3os 是否參與了心肌纖維化的過程，目前尚未見報道。
因此，本研究旨在觀察 lncRNA Dnm3os 在小鼠纖維化心肌組織和心肌成纖維細胞活化過程中的表達情況，并探索其在心肌成纖維細胞活化過程中的作用，從而為心肌纖維化的診療提供潛在的新靶點。
1 實驗材料與試劑
1.1 實驗動物
本實驗所用動物為 0～1 d 的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級 C57BL/6 乳鼠（SCXK（川）2020-030），購買于四川省達碩實驗動物中心。本實驗經四川大學華西醫院動物倫理委員會批準通過（倫理備案號：2018162A）。
1.2 主要試劑
促纖維化因子 TGF-β1 購自北京神州義翹科技有限公司；轉染試劑 Lipofectamine? RNAiMAX 購自美國 Invitrogen 公司；RNA 提取試劑盒購自北京天漠科技開發有限公司；逆轉錄試劑盒（rever tra ace 組合型）購自日本 Toyobo 公司；熒光定量試劑 SYBR? Green PCR Master Mix 和增強化學發光試劑（electrochemiluminescence，ECL）購自美國 Bio-Rad 公司；Ⅱ型膠原酶購自美國 Worthington 公司；5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）細胞增殖檢測試劑盒（apollo 567）購自廣州銳博生物科技有限公司；兔單克隆抗 α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、兔單克隆抗骨膜素（Periostin）、兔單克隆抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、兔單克隆抗微管蛋白（Tubulin）、兔單克隆抗肌動蛋白（β-actin）和兔多克隆抗結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）購自美國 Abcam 公司；熒光二抗、兔多克隆抗體 Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3 購自美國 CST 公司；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；含 4，6-二氨基－2－苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）的封片劑和 I 型鼠尾膠原購自北京索萊寶公司；細胞通透劑 Triton?X-100 和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）均購自德國 Biofroxx 公司；放射免疫沉淀測定（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液購自上海碧云天生物公司。
2 實驗方法
2.1 壓力超負荷所致心肌纖維化小鼠模型的建立
采用胸主動脈縮窄術（thoracic aortic constriction，TAC）建立小鼠壓力超負荷所致的心肌肥厚/纖維化模型，實驗分為進行主動脈弓縮窄的 TAC 組和未進行主動脈弓縮窄的假手術（Sham）組，詳見本實驗室前期報道的文獻[15]。在本實驗中，分別取用 Sham 組和 TAC 組的 6 個 RNA 樣本進行研究。
2.2 小鼠乳鼠心肌成纖維原代細胞培養及細胞活化模型建立
根據實驗室所建立的原代細胞培養方法[15]，將 0～1 d 的 C57BL/6 乳鼠消毒后行頸脫位法，取心臟剪碎，在 0.25% 胰蛋白酶中消化過夜。第二天，使用Ⅱ型膠原酶繼續消化，待組織塊消化干凈后，取濾液至含 10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的改良型 Eagle 培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中終止消化。200 g/min 離心 5 min 后，棄上清，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基重懸細胞沉淀，隨后放置于 37℃，5%CO2 孵箱中進行培養。差速貼壁 0.5 h 后，吸出培養液，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，隨后放入孵箱中繼續培養。待貼壁的心肌成纖維細胞密度達到 95% 左右時，對細胞進行傳代操作，種于 12 孔板中。當細胞融合度達到 65% 左右時，使用 DMEM 培養基饑餓處理細胞 4 h，更換含 10%FBS 的 DMEM 培養基，并加入 TGF-β1（10 ng/mL）進行刺激。實驗分為：對照組（Control），不加入 TGF-β1；實驗組（TGF-β1），加入 TGF-β1 刺激。每組設置 3 個復孔，24 h 后進行后續實驗。
2.3 LncRNA Dnm3os 特異性小干擾 RNA 轉染及實驗分組
將心肌成纖維細胞接種于 12 孔板中，待細胞生長至 50%～60% 融合度時，用轉染試劑 Lipofectamine? RNAiMAX 進行轉染，小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）的序列如表 1 所示。24 h 后，更換新的完全培養基。根據實驗需要，針對不同序列的 siRNA，將實驗分組為：① 非特異性對照（non-special control，NC）的 siRNA 序列（si-NC）組；② si-NC+TGF-β1 組；③ 特異性敲低 Dnm3os 的 siRNA 序列（si-Dnm3os）組；④ si-Dnm3os+TGF-β1 組。每組設置 3 個復孔。
表1
si-Dnm3os 的序列
Table1.
Sequences of si-Dnm3os
2.4 膠原凝膠收縮實驗
膠原凝膠收縮實驗是給細胞提供三維培養環境，維持細胞的生長、黏附和遷移，常用于檢測細胞的收縮活性。根據膠原凝膠收縮實驗常規方法[16]，準備好懸浮于培養液的心肌成纖維細胞，并放置于冰浴中。將 800 μL 鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（5 mg/mL）加到 48 μL 0.1 mol/L NaOH 中，立即混勻。再加入細胞懸浮液，混勻后立即加到 24 孔板中。室溫放置 1 h，待膠原凝結后，將其轉移至含有完全培養基的 12 孔板中，并根據實驗需要，加入濃度為 10 ng/mL 的 TGF-β1 進行刺激。在 37℃，5%CO2 孵箱中孵育 24 h 后，對膠原凝膠進行拍照，并使用圖像處理軟件 Image J（National Institutes of Health，美國）測量每組凝膠的面積。
2.5 EdU 法檢測細胞增殖
按照 EdU 檢測試劑盒說明書的步驟，對處理完畢的心肌成纖維細胞進行增殖活性檢測[17]。第二天，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取每組 15 個視野進行后續的統計分析，即計算各組內處于 S 期的細胞百分比。
2.6 細胞免疫熒光染色
按照實驗室以前報道的細胞免疫熒光染色方法[15]，將心肌成纖維細胞懸液加入到 24 孔板中，待細胞融合度達到 50% 左右時，根據實驗需要，進行轉染操作或 TGF-β1 藥物處理。待細胞處理完畢后，使用 4% 多聚甲醛固定細胞，15 min 后，加入含有 0.5% 細胞通透劑 Triton?X-100 和 1% BSA 的混合液，封閉穿孔 1 h。隨后，加入 α-SMA 抗體溶液，進行 4℃ 孵育過夜處理。第二天，回收 α-SMA 抗體并加入熒光二抗，室溫避光孵育 2 h。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗凈殘余熒光二抗后，用含 DAPI 的封片劑孵育細胞 10 min，后續使用全自動倒置熒光顯微鏡 IX83（Olympus，日本）采集圖像，并采用 Image J 軟件進行半定量分析。
2.7 定量聚合酶鏈式反應檢測基因及 lncRNA Dnm3os 的表達變化
使用 RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA 后，采用逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉錄為 cDNA。之后在定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀 CFX96TM（Bio-Rad，美國）上對目的基因進行熒光定量檢測，以觀察其變化情況，目的基因的引物序列如表 2 所示。
表2
RT-qPCR 反應使用的引物序列
Table2.
Primer sequences of RT-qPCR
2.8 Western blot 檢測蛋白表達
使用 RIPA 裂解液提取藥物處理完畢后的成纖維細胞總蛋白，經過蛋白質定量檢測后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（dodecyl sulfate sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，隨后用 1%BSA 封閉液進行封閉。1 h 后，在 4℃ 冰箱中孵育抗體（1∶1 000）過夜。第二天，回收抗體并在室溫下孵育山羊抗兔二抗（1∶2 000）2 h，緩沖液洗滌后，用 ECL 顯影液進行顯影，采用 Image J 軟件進行半定量分析。
2.9 數據分析
實驗數據采用數據分析軟件 GraphPad Prism 8.0（graphPad Software Inc.，美國）進行統計分析，實驗結果以均數 ± 標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P < 0.05 認為差異具有統計學意義。
3 結果
3.1 LncRNA Dnm3os 在小鼠纖維化心臟組織中表達升高
在本實驗室前期通過 TAC 手術所構建的小鼠纖維化模型中[15]，采用 RT-qPCR 檢測了纖維化心臟組織中 lncRNA Dnm3os 的表達變化，發現其表達水平與 Sham 組相比，明顯升高，如圖 1 所示。
圖1
LncRNA Dnm3os 在小鼠纖維化心臟組織中的表達升高 （n = 6，**P < 0.01）
Figure1.
The expression of lncRNA Dnm3os was increased in myocardial fibrosis tissues（n = 6, **P < 0.01）
3.2 LncRNA Dnm3os 在心肌成纖維細胞活化過程中表達升高
3.2.1 心肌成纖維細胞活化模型的建立與評價
如圖 2 所示，I 型膠原凝膠收縮實驗顯示，與 Control 組相比，TGF-β1 組中細胞與 I 型膠原凝膠混合 24 h 后，凝膠收縮的面積是其 1.22 倍。EdU 實驗結果顯示，TGF-β1 組的細胞增殖率為 Control 組的 3 倍。細胞免疫熒光染色的半定量結果顯示，TGF-β1 組中的心肌成纖維細胞的活化標志物 α-SMA 熒光強度相比于 Control 組增加了約 98%。
圖2
心肌成纖維細胞活化模型的建立與評價（n = 3，**P < 0.01，***P < 0.001）
Figure2.
Establishment and evaluation of cardiac fibroblast activation model（n = 3, **P < 0.01, ***P < 0.001）
3.2.2 LncRNA Dnm3os 在活化的心肌成纖維細胞中表達升高
本實驗用 RT-qPCR 和 Western blot 分別檢測了心肌成纖維細胞活化相關標志物 Periostin、α-SMA、CTGF 的 mRNA 和蛋白水平變化，與 Control 組相比均顯示升高，如圖 3 所示。上述結果表明，TGF-β1 成功誘導了心肌成纖維細胞活化。進一步的實驗結果發現，Dnm3os 在心肌成纖維細胞的活化過程中表達明顯升高。
圖3
LncRNA Dnm3os 在心肌成纖維細胞活化過程中的表達升高（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）
Figure3.
The expression of lncRNA Dnm3os was increased in the process of cardiac fibroblasts activation（n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001）
3.3 敲低 lncRNA Dnm3os 緩解 TGF-β1 誘導的心肌成纖維細胞活化
3.3.1 小干擾 RNA 轉染效率檢測及纖維化表型變化
在轉染 lncRNA Dnm3os 特異性 siRNA 之后，用 TGF-β1 對心肌成纖維細胞進行刺激，以觀察敲低 lncRNA Dnm3os 對心肌成纖維細胞活化的影響。結果顯示，相比于 si-NC 組，在所設計的三條 si-Dnm3os 序列中，si-Dnm3os-1 的敲低效率最高，如圖 4 所示，因此本文使用該序列用于后續的實驗。
圖4
小干擾 RNA 轉染效率檢測及纖維化表型變化（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）
Figure4.
Detection of siRNA transfection efficiency and fibrotic phenotype changes（n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001）
結果發現，si-Dnm3os-1 轉染后，心肌成纖維細胞活化標志物 Periostin、α-SMA 和 CTGF 的 mRNA 水平分別降低了 13%、18% 和 52%，而蛋白表達分別下降了 55%、23% 和 30%。此外，si-Dnm3os-1 轉染明顯抑制了 TGF-β1 誘導的膠原凝膠收縮，如圖 4 所示。
3.3.2 細胞增殖能力和 α-SMA 熒光強度檢測
EdU 增殖實驗和免疫熒光實驗表明，si-Dnm3os-1 轉染能夠降低由 TGF-β1 引起的細胞增殖率和 α-SMA 熒光強度的增加，如圖 5 所示。
圖5
細胞增殖能力和 α-SMA 熒光強度檢測（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01）
Figure5.
Detection of cell proliferation ability and α-SMA fluorescence intensity（n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01）
上述結果提示，敲低 Dnm3os 能夠緩解由 TGF-β1 誘導的心肌成纖維細胞活化。
3.4 Dnm3os 通過影響 Smad2/3 通路來調節心肌成纖維細胞的活化
為了進一步探究 Dnm3os 是否通過 Smad2/3 通路來參與心肌成纖維細胞的活化，本研究檢測了 Smad2、Smad3、p-Smad2 和 p-Smad3 的蛋白水平變化。結果顯示，與 Control 組相比，TGF-β1 組中 Smad2/3 的磷酸化水平明顯增加，如圖 6 所示；而用 si-Dnm3os-1 來敲低 Dnm3os 的表達后，能明顯降低由 TGF-β1 誘導的 Smad2/3 磷酸化，如圖 6 所示。
圖6
Dnm3os 影響 Smad2/3 信號通路來調節 TGF-β1 誘導的心肌成纖維細胞活化（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）
Figure6.
Dnm3os regulates Smad2/3 signaling pathway in TGF-β1-induced cardiac fibroblasts activation（n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001）
上述結果表明，Dnm3os 可能通過影響 Smad2/3 信號通路來參與調節 TGF-β1 誘導的心肌成纖維細胞活化。
4 討論
在急性或慢性損傷后，心肌成纖維細胞可轉化為更具合成和收縮力的肌成纖維細胞，進而促進心肌纖維化和心臟重塑過程[18]。研究表明，在壓力超負荷的作用下，左心室中也會出現活化狀態的肌成纖維細胞[19-20]。心肌成纖維細胞的活化導致左心室正常的心肌基質被過量的纖維狀膠原所替代，使心肌僵硬度增加，并隨著壓力超負荷時間的延長，導致心肌纖維化，最終進行性的發展為心力衰竭[21]。
研究顯示，lncRNA 參與到包括心肌纖維化、心力衰竭在內的多種心臟疾病的病理生理過程中[22-23]。在 TAC 模型中，沉默 lncRNA Meg3 可通過下調基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）的表達，從而減少心肌纖維化和改善心臟舒張功能[24]。此外，在小鼠心肌梗死模型和 TGF-β1 誘導的體外心肌成纖維細胞活化模型中，促纖維化的 lncRNA（a pro-fibrotic lncRNA，lncRNA PFL）可通過競爭性結合 microRNA let-7d 的方式上調血小板活化因子受體（platelet activated factor receptor，Ptafr）的表達，進而促進心肌纖維化[25]。最近的研究發現，在心肌成纖維細胞中高表達的 lncRNA 心臟成纖維細胞相關轉錄物（cardiac fibroblast-associated transcript，Cfast），在心肌纖維化過程中發揮了重要作用。LncRNA Cfast 通過競爭性抑制毛狀樣蛋白 COTL1 與 TGF-β 受體相關蛋白（TGF-β receptor 1，Tgfbr1）的相互作用，從而調控 Smad2 /4 復合物的形成，以增強 TGF-β 信號傳導[26]。
LncRNA Dnm3os 在糖尿病[27]、心力衰竭[28]等多種疾病中發揮了重要作用。特別是在纖維化疾病中，有研究表明沉默 Dnm3os 可以阻止 TGF-β1 誘導的肌腱細胞增殖和纖維化相關基因 α-SMA、纖粘連蛋白（fibronectin1，FN1）的表達[12]。在肝臟中，Dnm3os 通過影響肝星狀細胞的激活來調節肝纖維化，其機制是通過調控 microRNA-214 的產生來進一步調控 CTGF 的表達[14]。另外，Dnm3os 還可以通過產生 microRNA-199a-3p/5p 來調控 TGF-β/Smads 信號通路，從而介導肺成纖維細胞活化，進而調控肺纖維化的發生發展過程[13]。
Smad2/3 信號通路參與了多種組織和器官的纖維化過程，如腎纖維化[29]、肝纖維化[30]以及肺纖維化[31]。此外，其在心肌纖維化過程中也發揮了重要作用，研究表明，在血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠心肌纖維化模型中，Smad2/3 的去磷酸化能夠抑制 TGF-β 通路所介導的纖維化過程[32]。而在 TAC 所致的小鼠心肌纖維化模型和 TGF-β 誘導的心肌成纖維活化模型中，Smad2/3 磷酸化水平的降低有效緩解了心肌成纖維細胞活化[33]，上述研究表明 Smad2/3 磷酸化水平的升高與纖維化過程密切相關。
本研究觀察到 Dnm3os 通過 Smad2/3 通路，參與了心肌成纖維細胞的活化，提示其在纖維化疾病的發生發展中可能起著重要作用。然而，Dnm3os 如何通過 Smad2/3 通路來調節心肌纖維化，特別是其直接或間接作用的下游靶基因是什么，有待深入的研究驗證。此外，在體內動物實驗中干擾 Dnm3os 的表達，是否能緩解心肌纖維化的程度，需要進一步的研究。
綜上所述，LncRNA Dnm3os 通過 Smad2/3 通路介導了心肌成纖維細胞的活化；而干預 lncRNA Dnm3os 的表達可能成為治療心肌纖維化的潛在靶點。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
心肌纖維化是指壓力超負荷、缺血、炎癥等致病因素導致心肌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）異常增多和過度積聚的病理過程。在此過程中，心肌成纖維細胞會發生表型轉變，活化為肌成纖維細胞[1-3]。心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉換的過程，近年來得到了廣泛關注，但其中具體的機制尚未完全闡明。
長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，可在轉錄調節、分化、細胞重編程等過程中發揮重要作用[4-5]。研究發現，lncRNA 參與了心血管系統調節網絡，其表達異常與心肌肥厚、心力衰竭及心肌梗死等心血管疾病的發生、發展密切相關[6-8]。LncRNA Dnm3os 是動力蛋白（dynamin-3）的反義鏈通過可變剪切產生的 lncRNA 分子[9]。研究顯示，Dnm3os 與多種細胞的增殖、分化相關，包括視網膜母細胞瘤細胞的增殖[10]、上皮細胞-間充質轉化[11]。新近研究表明，lncRNA Dnm3os 通過轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路參與肌腱周圍組織纖維化[12]和肺纖維化[13]的過程；此外，它通過轉錄因子 Twist1、microRNA-214 和結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）構成的信號軸調節了肝纖維化的發展過程[14]。但 Dnm3os 是否參與了心肌纖維化的過程，目前尚未見報道。
因此，本研究旨在觀察 lncRNA Dnm3os 在小鼠纖維化心肌組織和心肌成纖維細胞活化過程中的表達情況，并探索其在心肌成纖維細胞活化過程中的作用，從而為心肌纖維化的診療提供潛在的新靶點。
1 實驗材料與試劑
1.1 實驗動物
本實驗所用動物為 0～1 d 的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級 C57BL/6 乳鼠（SCXK（川）2020-030），購買于四川省達碩實驗動物中心。本實驗經四川大學華西醫院動物倫理委員會批準通過（倫理備案號：2018162A）。
1.2 主要試劑
促纖維化因子 TGF-β1 購自北京神州義翹科技有限公司；轉染試劑 Lipofectamine? RNAiMAX 購自美國 Invitrogen 公司；RNA 提取試劑盒購自北京天漠科技開發有限公司；逆轉錄試劑盒（rever tra ace 組合型）購自日本 Toyobo 公司；熒光定量試劑 SYBR? Green PCR Master Mix 和增強化學發光試劑（electrochemiluminescence，ECL）購自美國 Bio-Rad 公司；Ⅱ型膠原酶購自美國 Worthington 公司；5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）細胞增殖檢測試劑盒（apollo 567）購自廣州銳博生物科技有限公司；兔單克隆抗 α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、兔單克隆抗骨膜素（Periostin）、兔單克隆抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、兔單克隆抗微管蛋白（Tubulin）、兔單克隆抗肌動蛋白（β-actin）和兔多克隆抗結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）購自美國 Abcam 公司；熒光二抗、兔多克隆抗體 Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3 購自美國 CST 公司；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；含 4，6-二氨基－2－苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）的封片劑和 I 型鼠尾膠原購自北京索萊寶公司；細胞通透劑 Triton?X-100 和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）均購自德國 Biofroxx 公司；放射免疫沉淀測定（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液購自上海碧云天生物公司。
2 實驗方法
2.1 壓力超負荷所致心肌纖維化小鼠模型的建立
采用胸主動脈縮窄術（thoracic aortic constriction，TAC）建立小鼠壓力超負荷所致的心肌肥厚/纖維化模型，實驗分為進行主動脈弓縮窄的 TAC 組和未進行主動脈弓縮窄的假手術（Sham）組，詳見本實驗室前期報道的文獻[15]。在本實驗中，分別取用 Sham 組和 TAC 組的 6 個 RNA 樣本進行研究。
2.2 小鼠乳鼠心肌成纖維原代細胞培養及細胞活化模型建立
根據實驗室所建立的原代細胞培養方法[15]，將 0～1 d 的 C57BL/6 乳鼠消毒后行頸脫位法，取心臟剪碎，在 0.25% 胰蛋白酶中消化過夜。第二天，使用Ⅱ型膠原酶繼續消化，待組織塊消化干凈后，取濾液至含 10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的改良型 Eagle 培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中終止消化。200 g/min 離心 5 min 后，棄上清，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基重懸細胞沉淀，隨后放置于 37℃，5%CO2 孵箱中進行培養。差速貼壁 0.5 h 后，吸出培養液，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，隨后放入孵箱中繼續培養。待貼壁的心肌成纖維細胞密度達到 95% 左右時，對細胞進行傳代操作，種于 12 孔板中。當細胞融合度達到 65% 左右時，使用 DMEM 培養基饑餓處理細胞 4 h，更換含 10%FBS 的 DMEM 培養基，并加入 TGF-β1（10 ng/mL）進行刺激。實驗分為：對照組（Control），不加入 TGF-β1；實驗組（TGF-β1），加入 TGF-β1 刺激。每組設置 3 個復孔，24 h 后進行后續實驗。
2.3 LncRNA Dnm3os 特異性小干擾 RNA 轉染及實驗分組
將心肌成纖維細胞接種于 12 孔板中，待細胞生長至 50%～60% 融合度時，用轉染試劑 Lipofectamine? RNAiMAX 進行轉染，小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）的序列如表 1 所示。24 h 后，更換新的完全培養基。根據實驗需要，針對不同序列的 siRNA，將實驗分組為：① 非特異性對照（non-special control，NC）的 siRNA 序列（si-NC）組；② si-NC+TGF-β1 組；③ 特異性敲低 Dnm3os 的 siRNA 序列（si-Dnm3os）組；④ si-Dnm3os+TGF-β1 組。每組設置 3 個復孔。
表1
si-Dnm3os 的序列
Table1.
Sequences of si-Dnm3os
2.4 膠原凝膠收縮實驗
膠原凝膠收縮實驗是給細胞提供三維培養環境，維持細胞的生長、黏附和遷移，常用于檢測細胞的收縮活性。根據膠原凝膠收縮實驗常規方法[16]，準備好懸浮于培養液的心肌成纖維細胞，并放置于冰浴中。將 800 μL 鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（5 mg/mL）加到 48 μL 0.1 mol/L NaOH 中，立即混勻。再加入細胞懸浮液，混勻后立即加到 24 孔板中。室溫放置 1 h，待膠原凝結后，將其轉移至含有完全培養基的 12 孔板中，并根據實驗需要，加入濃度為 10 ng/mL 的 TGF-β1 進行刺激。在 37℃，5%CO2 孵箱中孵育 24 h 后，對膠原凝膠進行拍照，并使用圖像處理軟件 Image J（National Institutes of Health，美國）測量每組凝膠的面積。
2.5 EdU 法檢測細胞增殖
按照 EdU 檢測試劑盒說明書的步驟，對處理完畢的心肌成纖維細胞進行增殖活性檢測[17]。第二天，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取每組 15 個視野進行后續的統計分析，即計算各組內處于 S 期的細胞百分比。
2.6 細胞免疫熒光染色
按照實驗室以前報道的細胞免疫熒光染色方法[15]，將心肌成纖維細胞懸液加入到 24 孔板中，待細胞融合度達到 50% 左右時，根據實驗需要，進行轉染操作或 TGF-β1 藥物處理。待細胞處理完畢后，使用 4% 多聚甲醛固定細胞，15 min 后，加入含有 0.5% 細胞通透劑 Triton?X-100 和 1% BSA 的混合液，封閉穿孔 1 h。隨后，加入 α-SMA 抗體溶液，進行 4℃ 孵育過夜處理。第二天，回收 α-SMA 抗體并加入熒光二抗，室溫避光孵育 2 h。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗凈殘余熒光二抗后，用含 DAPI 的封片劑孵育細胞 10 min，后續使用全自動倒置熒光顯微鏡 IX83（Olympus，日本）采集圖像，并采用 Image J 軟件進行半定量分析。
2.7 定量聚合酶鏈式反應檢測基因及 lncRNA Dnm3os 的表達變化
使用 RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA 后，采用逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉錄為 cDNA。之后在定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀 CFX96TM（Bio-Rad，美國）上對目的基因進行熒光定量檢測，以觀察其變化情況，目的基因的引物序列如表 2 所示。
表2
RT-qPCR 反應使用的引物序列
Table2.
Primer sequences of RT-qPCR
2.8 Western blot 檢測蛋白表達
使用 RIPA 裂解液提取藥物處理完畢后的成纖維細胞總蛋白，經過蛋白質定量檢測后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（dodecyl sulfate sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，隨后用 1%BSA 封閉液進行封閉。1 h 后，在 4℃ 冰箱中孵育抗體（1∶1 000）過夜。第二天，回收抗體并在室溫下孵育山羊抗兔二抗（1∶2 000）2 h，緩沖液洗滌后，用 ECL 顯影液進行顯影，采用 Image J 軟件進行半定量分析。
2.9 數據分析
實驗數據采用數據分析軟件 GraphPad Prism 8.0（graphPad Software Inc.，美國）進行統計分析，實驗結果以均數 ± 標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P < 0.05 認為差異具有統計學意義。
3 結果
3.1 LncRNA Dnm3os 在小鼠纖維化心臟組織中表達升高
在本實驗室前期通過 TAC 手術所構建的小鼠纖維化模型中[15]，采用 RT-qPCR 檢測了纖維化心臟組織中 lncRNA Dnm3os 的表達變化，發現其表達水平與 Sham 組相比，明顯升高，如圖 1 所示。
圖1
LncRNA Dnm3os 在小鼠纖維化心臟組織中的表達升高 （n = 6，**P < 0.01）
Figure1.
The expression of lncRNA Dnm3os was increased in myocardial fibrosis tissues（n = 6, **P < 0.01）
3.2 LncRNA Dnm3os 在心肌成纖維細胞活化過程中表達升高
3.2.1 心肌成纖維細胞活化模型的建立與評價
如圖 2 所示，I 型膠原凝膠收縮實驗顯示，與 Control 組相比，TGF-β1 組中細胞與 I 型膠原凝膠混合 24 h 后，凝膠收縮的面積是其 1.22 倍。EdU 實驗結果顯示，TGF-β1 組的細胞增殖率為 Control 組的 3 倍。細胞免疫熒光染色的半定量結果顯示，TGF-β1 組中的心肌成纖維細胞的活化標志物 α-SMA 熒光強度相比于 Control 組增加了約 98%。
圖2
心肌成纖維細胞活化模型的建立與評價（n = 3，**P < 0.01，***P < 0.001）
Figure2.
Establishment and evaluation of cardiac fibroblast activation model（n = 3, **P < 0.01, ***P < 0.001）
3.2.2 LncRNA Dnm3os 在活化的心肌成纖維細胞中表達升高
本實驗用 RT-qPCR 和 Western blot 分別檢測了心肌成纖維細胞活化相關標志物 Periostin、α-SMA、CTGF 的 mRNA 和蛋白水平變化，與 Control 組相比均顯示升高，如圖 3 所示。上述結果表明，TGF-β1 成功誘導了心肌成纖維細胞活化。進一步的實驗結果發現，Dnm3os 在心肌成纖維細胞的活化過程中表達明顯升高。
圖3
LncRNA Dnm3os 在心肌成纖維細胞活化過程中的表達升高（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）
Figure3.
The expression of lncRNA Dnm3os was increased in the process of cardiac fibroblasts activation（n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001）
3.3 敲低 lncRNA Dnm3os 緩解 TGF-β1 誘導的心肌成纖維細胞活化
3.3.1 小干擾 RNA 轉染效率檢測及纖維化表型變化
在轉染 lncRNA Dnm3os 特異性 siRNA 之后，用 TGF-β1 對心肌成纖維細胞進行刺激，以觀察敲低 lncRNA Dnm3os 對心肌成纖維細胞活化的影響。結果顯示，相比于 si-NC 組，在所設計的三條 si-Dnm3os 序列中，si-Dnm3os-1 的敲低效率最高，如圖 4 所示，因此本文使用該序列用于后續的實驗。
圖4
小干擾 RNA 轉染效率檢測及纖維化表型變化（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）
Figure4.
Detection of siRNA transfection efficiency and fibrotic phenotype changes（n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001）
結果發現，si-Dnm3os-1 轉染后，心肌成纖維細胞活化標志物 Periostin、α-SMA 和 CTGF 的 mRNA 水平分別降低了 13%、18% 和 52%，而蛋白表達分別下降了 55%、23% 和 30%。此外，si-Dnm3os-1 轉染明顯抑制了 TGF-β1 誘導的膠原凝膠收縮，如圖 4 所示。
3.3.2 細胞增殖能力和 α-SMA 熒光強度檢測
EdU 增殖實驗和免疫熒光實驗表明，si-Dnm3os-1 轉染能夠降低由 TGF-β1 引起的細胞增殖率和 α-SMA 熒光強度的增加，如圖 5 所示。
圖5
細胞增殖能力和 α-SMA 熒光強度檢測（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01）
Figure5.
Detection of cell proliferation ability and α-SMA fluorescence intensity（n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01）
上述結果提示，敲低 Dnm3os 能夠緩解由 TGF-β1 誘導的心肌成纖維細胞活化。
3.4 Dnm3os 通過影響 Smad2/3 通路來調節心肌成纖維細胞的活化
為了進一步探究 Dnm3os 是否通過 Smad2/3 通路來參與心肌成纖維細胞的活化，本研究檢測了 Smad2、Smad3、p-Smad2 和 p-Smad3 的蛋白水平變化。結果顯示，與 Control 組相比，TGF-β1 組中 Smad2/3 的磷酸化水平明顯增加，如圖 6 所示；而用 si-Dnm3os-1 來敲低 Dnm3os 的表達后，能明顯降低由 TGF-β1 誘導的 Smad2/3 磷酸化，如圖 6 所示。
圖6
Dnm3os 影響 Smad2/3 信號通路來調節 TGF-β1 誘導的心肌成纖維細胞活化（n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）
Figure6.
Dnm3os regulates Smad2/3 signaling pathway in TGF-β1-induced cardiac fibroblasts activation（n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001）
上述結果表明，Dnm3os 可能通過影響 Smad2/3 信號通路來參與調節 TGF-β1 誘導的心肌成纖維細胞活化。
4 討論
在急性或慢性損傷后，心肌成纖維細胞可轉化為更具合成和收縮力的肌成纖維細胞，進而促進心肌纖維化和心臟重塑過程[18]。研究表明，在壓力超負荷的作用下，左心室中也會出現活化狀態的肌成纖維細胞[19-20]。心肌成纖維細胞的活化導致左心室正常的心肌基質被過量的纖維狀膠原所替代，使心肌僵硬度增加，并隨著壓力超負荷時間的延長，導致心肌纖維化，最終進行性的發展為心力衰竭[21]。
研究顯示，lncRNA 參與到包括心肌纖維化、心力衰竭在內的多種心臟疾病的病理生理過程中[22-23]。在 TAC 模型中，沉默 lncRNA Meg3 可通過下調基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）的表達，從而減少心肌纖維化和改善心臟舒張功能[24]。此外，在小鼠心肌梗死模型和 TGF-β1 誘導的體外心肌成纖維細胞活化模型中，促纖維化的 lncRNA（a pro-fibrotic lncRNA，lncRNA PFL）可通過競爭性結合 microRNA let-7d 的方式上調血小板活化因子受體（platelet activated factor receptor，Ptafr）的表達，進而促進心肌纖維化[25]。最近的研究發現，在心肌成纖維細胞中高表達的 lncRNA 心臟成纖維細胞相關轉錄物（cardiac fibroblast-associated transcript，Cfast），在心肌纖維化過程中發揮了重要作用。LncRNA Cfast 通過競爭性抑制毛狀樣蛋白 COTL1 與 TGF-β 受體相關蛋白（TGF-β receptor 1，Tgfbr1）的相互作用，從而調控 Smad2 /4 復合物的形成，以增強 TGF-β 信號傳導[26]。
LncRNA Dnm3os 在糖尿病[27]、心力衰竭[28]等多種疾病中發揮了重要作用。特別是在纖維化疾病中，有研究表明沉默 Dnm3os 可以阻止 TGF-β1 誘導的肌腱細胞增殖和纖維化相關基因 α-SMA、纖粘連蛋白（fibronectin1，FN1）的表達[12]。在肝臟中，Dnm3os 通過影響肝星狀細胞的激活來調節肝纖維化，其機制是通過調控 microRNA-214 的產生來進一步調控 CTGF 的表達[14]。另外，Dnm3os 還可以通過產生 microRNA-199a-3p/5p 來調控 TGF-β/Smads 信號通路，從而介導肺成纖維細胞活化，進而調控肺纖維化的發生發展過程[13]。
Smad2/3 信號通路參與了多種組織和器官的纖維化過程，如腎纖維化[29]、肝纖維化[30]以及肺纖維化[31]。此外，其在心肌纖維化過程中也發揮了重要作用，研究表明，在血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠心肌纖維化模型中，Smad2/3 的去磷酸化能夠抑制 TGF-β 通路所介導的纖維化過程[32]。而在 TAC 所致的小鼠心肌纖維化模型和 TGF-β 誘導的心肌成纖維活化模型中，Smad2/3 磷酸化水平的降低有效緩解了心肌成纖維細胞活化[33]，上述研究表明 Smad2/3 磷酸化水平的升高與纖維化過程密切相關。
本研究觀察到 Dnm3os 通過 Smad2/3 通路，參與了心肌成纖維細胞的活化，提示其在纖維化疾病的發生發展中可能起著重要作用。然而，Dnm3os 如何通過 Smad2/3 通路來調節心肌纖維化，特別是其直接或間接作用的下游靶基因是什么，有待深入的研究驗證。此外，在體內動物實驗中干擾 Dnm3os 的表達，是否能緩解心肌纖維化的程度，需要進一步的研究。
綜上所述，LncRNA Dnm3os 通過 Smad2/3 通路介導了心肌成纖維細胞的活化；而干預 lncRNA Dnm3os 的表達可能成為治療心肌纖維化的潛在靶點。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
