引用本文： 徐練, 李曉龍, 劉印, 孔清泉, 龍丹, 李勝富. miR-93-5p靶向調控Smad5表達抑制小鼠C3H10T1/2細胞成骨分化的研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(10): 1288-1294. doi: 10.7507/1002-1892.20150279 復制
MSCs是一類具有很強自我更新能力及多向分化潛能的干細胞，在適宜條件下可定向分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等多種成熟類型的細胞[1]。其中，成骨細胞是骨組織的重要組成細胞，也是參與骨形成的主要功能細胞；它在骨骼生長發育及骨量維持方面起關鍵作用。因此，研究MSCs定向成骨分化的分子機制，已成為骨組織工程及骨代謝領域的研究重點與熱點之一[2-3]。
微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來發現的一類長度18～25 nt的內源性、非編碼小RNA分子[4]。miRNA廣泛存在于真核生物中，并在進化上高度保守，主要通過與靶基因mRNA 3’-UTR以堿基配對的方式引導沉默復合體降解靶基因或阻礙其翻譯[5]。miRNA被認為是基因表達的重要調節器；據估計，在人類基因組中，盡管miRNA基因僅占整個基因組總數的4%左右，但調控了超過30%編碼基因的表達[6-7]。研究表明，miRNA參與了包括細胞增殖、分化、凋亡以及胚胎或個體的生長發育、組織器官分化、腫瘤的發生發展等幾乎所有生理或病理過程，并在其中發揮了重要的調控作用；其中，miRNA廣泛參與了MSCs定向成骨分化的調控過程[8-12]。
本課題組在前期研究中，通過miRNA芯片及實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）技術檢測發現miR-93-5p在C3H10T1/2細胞成骨分化過程中表達明顯降低，提示其在MSCs成骨分化中可能具有重要的調控作用[13]。隨后，通過綜合應用多種靶基因預測軟件（PicTar/TagetScan/miRanda/miRDB）進行生物信息學分析，發現Smad5可能是miR-93-5p的潛在靶基因。本次研究旨在進一步驗證miR-93-5p是否會通過調節Smad5的表達，影響C3H10T1/2細胞定向成骨分化。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
C3H10T1/2細胞系（美國ATCC細胞庫）；293T細胞（中國科學院上海細胞生物研究所）。H-DMEM培養基、FBS（HyClone公司，美國）；谷氨酰胺（GIBCO公司，美國）；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA、青霉素+鏈霉素雙抗、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、DMSO、ALP染色及定量試劑、茜素紅、PBS（Sigma公司，美國）；pmiR-RB-REPORTTM質粒載體、miR-93-5p mimics及其陰性對照（miRNA mimic negative control #22，NC#22）、miR-93-5p inhibitor及其陰性對照、ribo FECTTM CP轉染試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；大腸桿菌DH5α、質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Lipofectamine 2000、Trizol試劑、OPTI-MEM減血清培養基（Invitrogen公司，美國）；Dual-Glo? Luciferase Assay System（Promega公司，美國）；Smad5及內參GAPDH引物（GeneCopoeia公司，美國）；逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒（Takara公司，日本）；Smad5、β-actin單克隆抗體（Proteintech公司，美國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、考馬斯亮藍染色試劑盒（碧云天生物技術研究所）；SuperSignal? West Femto化學發光試劑盒（Pierce公司，美國）。
YU2200型超凈工作臺（Jouan公司，法國）；CO2培養箱（SANYO公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Eppendorf 5702臺式低溫離心機、核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司，德國）；NanoDrop? 8000分光光度計、NanoDrop ND-2000微量核酸測定儀（Thermo公司，美國）；Mill-Q Biocell超純水處理器（Millipore公司，美國）；圖像處理軟件（Corel公司，加拿大）；iQTM5熒光定量PCR儀、凝膠數字成像系統、水平電泳儀、半干轉膜儀、Quantity one軟件（Bio-Rad公司，美國）；熒光照度計（PE公司，美國）；ABI 7900HT qRT-PCR儀（ABI公司，美國）。引物合成及序列測定由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。
1.2 細胞培養與成骨誘導分化實驗
1.2.1 C3H10T1/2細胞培養與傳代
取C3H10T1/2細胞系，加入完全培養液（含90%H-DMEM培養基、10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10 μmol/mL谷氨酰胺），置于37℃、5%CO2及95%飽和濕度恒溫培養箱培養，每2～3天換液1次；待細胞生長至90%～100%匯合度時，吸棄原培養液，PBS清洗2～3次，37℃、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化1～2 min；隨后輕拍培養皿至細胞全部浮起并盡量分散開，加入適量完全培養液終止反應，用移液器反復吹打若干次；室溫下以300×g離心5 min，收集細胞，棄上清后加入完全培養液重懸細胞，按1∶（2～5）比例進行傳代培養。
1.2.2 細胞成骨誘導培養
取第3～5代C3H10T1/2細胞，以1×105個/孔密度接種于6孔板，當細胞生長至80%～85%匯合度時，將培養基更換為成骨誘導培養液（含完全培養液、100 nmol/L地塞米松、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）進行成骨誘導培養，每2～3天換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。誘導7 d后，行成骨早期標志物ALP檢測（ALP染色及定量）；并分別于誘導后7、14、21 d行茜素紅染色，檢測鈣結節形成情況。取未誘導細胞作為對照組進行相關檢測。
1.2.3 ALP染色（偶氮偶聯法）
① 孵育液配制：萘酚AS-BI磷酸鹽20 mg+DMSO 500 μL+0.2 mol/ L巴比妥醋酸緩沖液（pH9.2）50 mL+六偶氮副品紅500 μL。② 染色步驟：洗棄培養液，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定10 min；再用ddH2O沖洗2～3次；每孔加入過濾孵育液300 μL，室溫下作用45 min；去掉孵育液，ddH2O沖洗3次，觀察見細胞內有棕紅色ALP顆粒沉積為陽性染色。
1.2.4 ALP定量（pNPP法）
吸棄培養液，用預冷PBS清洗細胞2～3次，將細胞刮入PBS中，室溫下以300×g離心5 min，棄上清，用300～500 μL ddH2O重懸細胞；隨后將其置于-80℃冰箱30 min后取出，37℃水浴5 min，反復凍融3 次；4℃以12 000×g離心30 min，轉移上清備用。將50 μL pNPP儲備液、100 μL二乙醇胺和50 μL待測蛋白樣品混合，37℃水浴30 min，加入200 μL 3 mol/ L NaOH終止反應，取出200 μL樣品置于96孔板中，酶標儀測定405 nm處吸光度（A）值。
1.2.5 茜素紅染色
吸棄培養液，用PBS清洗2次，95%乙醇固定10 min，ddH2O反復沖洗3次；加入適量0.1%茜素紅染液，置于37℃恒溫箱內孵育20～30 min；去掉茜素紅染液，PBS或ddH2O漂洗2次，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.3 靶基因鑒定實驗
1.3.1 雙熒光素酶報告基因構建
多種靶基因預測軟件（PicTar/TagetScan/miRanda/miRDB）預測出Smad5 mRNA的3’-UTR上776～782 nt為miR-93-5p的結合位點（GCACTTT）。人工合成Smad5 mRNA 3’-UTR區的靶位點序列（WT）以及對WT靶位點進行定點突變（GCACTTT→CGTGAAA）后的序列（Mut）；使用XhoⅠ及NotⅠ限制性內切酶對pmiR-RB-REPORTTM質粒進行酶切，再將人工合成的目的基因片段WT或Mut分別克隆到pmiR-RB-REPORTTM載體中，構建重組質粒pSmad5-WT或pSmad5-Mut；最后通過測序確認重組質粒載體是否構建成功。
1.3.2 雙熒光素酶報告基因檢測
根據轉染的miRNA及重組質粒不同，實驗分為4組：A組轉染miR-93-5p mimics與pSmad5-WT；B組轉染NC#22與pSmad5-WT；C組轉染miR-93-5p mimics與pSmad5-Mut；D組轉染NC#22與pSmad5-Mut。轉染方法：① 取對數生長期293T細胞，以1.5×104個/孔接種于96孔板中（100 μL/孔），于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養24 h。② 取10 μL OPTI-MEM減血清培養基稀釋miR-93-5p mimics或NC#22，15 μL OPTI-MEM減血清培養基稀釋重組質粒pSmad5-WT或pSmad5-Mut，25 μL OPTI-MEM減血清培養基稀釋0.25 μL Lipofectamine 2000，5 min后三者混合，共50 μL，輕輕搖勻，靜置20 min。③ 質粒、miR-93-5p mimics/NC#22加入細胞前，每孔先吸走50 μL培養基，然后再加入上述50 μL混合液，最終每孔總體積100 μL；其中miR-93-5p mimics/NC#22轉染濃度均為50 nmol/L，質粒濃度為100 ng/ 孔，每組設3 個復孔；6 h后再加100 μL新鮮培養基。④ 轉染48 h后進行雙熒光素酶報告基因檢測，并比較A、C組hRluc/hLuc活性（活性由hRluc與hLuc熒光素酶基因相對表達量來表示，通過測量二者熒光值的比值間接反映）。
1.4 功能驗證實驗
1.4.1 轉染及成骨誘導分化培養
取第5代C3H10T1/2細胞，根據轉染的miRNA不同，實驗分為4組：M組（過表達組）轉染 miR-93-5p mimics；MC組（過表達對照組）轉染 NC#22；In組（沉默表達組）轉染 miR-93-5p inhibitor；InC組（沉默表達對照組） 轉染miR-93-5p inhibitor陰性對照。每組均設3個復孔。轉染方法：按照ribo FECTTM CP轉染試劑盒方法進行轉染，轉染濃度M組及MC組為50 nmol/ L，In組及InC組為100 nmol/L。轉染同時對各組進行成骨誘導培養（方法同1.2.2），于誘導培養48 h后，分別行qRT-PCR及Western blot檢測Smad5 mRNA及蛋白表達；14 d后行茜素紅染色，觀察細胞外鈣鹽沉積情況。
1.4.2 qRT-PCR檢測
用Trizol試劑提取細胞總RNA，并進行質量鑒定。Smad5及內參GAPDH引物使用美國GeneCopoeia公司設計合成并經驗證后的特異引物。首先，使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行20.0 μL體系的逆轉錄反應。然后，取2.0 μL逆轉錄產物行PCR反應（按SYBR? Premix Ex TaqTM Kit試劑盒說明操作），反應體系20.0 μL：10.0 μL 5×SYBR Green buffer、1.0 μL上游引物、1.0 μL下游引物、2.0 μL cDNA模板，雙蒸水補足20.0 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。最后，以GAPDH作為內參照，采用SYBR Green Ⅰ染料法，同時擴增待測基因及管家基因。計算2-ΔΔCt，獲得Smad5的mRNA相對表達量，實驗重復3次，取均值，Quantity one軟件分析結果。
1.4.3 Western
blot檢測使用RIPA裂解液裂解細胞后，提取總蛋白；BCA法測定細胞蛋白濃度（按試劑盒說明書進行操作）；取50 μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳；電泳結束后轉移至聚偏氟乙烯膜，經脫脂奶粉封閉后，加入至稀釋的兔抗鼠Smad5及β-actin一抗工作液中（1∶600），4℃過夜，漂洗后轉入稀釋的羊抗兔二抗工作液中（1∶2 000），室溫孵育2 h；化學發光試劑ECL顯色后，拍照并測定內參蛋白及待測蛋白條帶的A值，獲得待測蛋白的相對表達量。Quantity one軟件分析結果。
1.4.4 鈣基質檢測
通過茜素紅染色檢測各組細胞外鈣基質的沉積情況（方法同1.2.5）。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 C3H10T1/2細胞成骨誘導效果檢測
成骨誘導21 d內，細胞形態變化不明顯，但隨誘導時間延長，可見細胞逐漸聚集成團，且部分區域透光性明顯減弱，可能為鈣鹽沉積區。見圖 1。ALP染色示，對照組基本無ALP活性，成骨誘導7 d后誘導組有明顯的ALP活性。見圖 2。ALP定量檢測示，誘導組ALP的相對表達量（0.71±0.07）顯著高于對照組（0.18±0.04），差異有統計學意義（t= -11.608，P=0.000）。成骨誘導7、14、21 d，誘導組茜素紅染色均呈陽性，且逐漸加深；對照組染色均為陰性。見圖 3。
圖1
成骨誘導各時間點細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×200） ? 1 d ? 7 d ? 14 d ? 21 d ? ?2.2 靶基因鑒定
2.2.1 重組質粒載體構建鑒定
測序結果顯示，重組質粒pSmad5-WT及pSmad5-Mut的實際序列與理論序列完全一致，無堿基缺失、替換等，說明攜帶目的基因的雙熒光素酶報告載體構建成功。見圖 4。
2.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測
結果顯示，A、B、C、D組熒光素酶相對表達量分別為0.74±0.25、1.00±0.01、0.91±0.03、1.00±0.01，A組顯著低于B組，差異有統計學意義（t=17.889，P=0.000）；C、D組間差異無統計學意義（t=5.970，P=0.093）。此外，與A組相比，C組hRluc/hLuc活性明顯恢復，差異有統計學意義（t= -8.273，P=0.001）。
2.3 功能驗證實驗
2.3.1 qRT-PCR檢測
結果顯示，轉染后48 h M組、In組、MC組、InC組Smad5 mRNA相對表達量分別為0.88±0.02、1.06±0.76、0.95±0.08、0.95±0.06；M組和In組與對應陰性對照組MC組及InC組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5。
2.3.2 Western
blot檢測結果顯示，轉染后48 h M組、In組、MC組、InC組Smad5蛋白相對表達量分別為0.41±0.03、0.88±0.04、0.69±0.03、0.72±0.03；M組和In組與對應陰性對照組MC組及InC組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。其中，M組Smad5蛋白相對表達量較MC組明顯下調，而In組則較InC組明顯上調。見圖 6。
2.3.3 鈣基質檢測
成骨誘導14 d茜素紅染色示，與對應陰性對照組MC組及InC組相比，M組能顯著減少鈣基質的形成，相反In組鈣基質形成明顯增加。見圖 7、8。
圖7
成骨誘導14 d各組茜素紅染色觀察從左至右依次為In組、InC組、MC組、M組 ? ?3 討論
miRNA作為一類重要的轉錄后調控因子，廣泛參與了對各種生物學過程的調控。其中，在MSCs定向成骨分化或骨形成過程中，眾多miRNA在其中扮演了重要的調控角色。例如，Luzi等[14]報道miR-26a可通過靶向作用于Smad1抑制人脂肪源性干細胞成骨分化；Zhang等[15]通過一系列體內外實驗研究發現，miR-335-5p可通過抑制Dkk1的表達，促進MSCs成骨分化及骨形成；康夏等[16]研究顯示，miRNA-451可通過靶向抑制鈣結合蛋白39的表達，促進MSCs成骨分化；另據Hwang等[17]報道，miR-140-5p可直接抑制BMP-2的表達，從而負向調控人MSCs成骨分化；此外，Huang等[18]的研究表明，miR-125b可直接下調其靶基因Cbfβ的表達，從而抑制C3H10T1/2細胞成骨分化。以上研究均說明miRNA能影響成骨分化及骨形成過程。但由于miRNA與靶基因之間是“多對多”的關系，即1條miRNA可作用于多個靶基因，而同一靶基因又可能受到多條miRNA的共同調控，因此目前對miRNA調控成骨分化的網絡機制仍未完全闡明，有待進一步研究。
本課題組前期實驗首先通過對C3H10T1/2細胞進行定向成骨誘導，并利用miRNA芯片及qRT-PCR檢測發現，miR-93-5p在成骨分化過程中表達逐漸下調，提示其在MSCs成骨分化中可能具有重要的調控作用；然后，通過應用TargetScan等生物信息學軟件預測發現，Smad5是miR-93-5p的潛在靶基因之一。大量研究表明[19-21]，Smad5是BMPs-Smads信號通路（調控MSCs成骨分化關鍵信號通路）中的重要信號分子，Smad5可在活化的BMPⅠ型受體（BMP receptorⅠ，BMPR-Ⅰ）及BMPR-Ⅱ的共同作用下發生磷酸化而被激活，活化后的Smad5可與另外兩個活化的SMAD家族成員Smad1及Smad8結合并形成復合體p-Smad1/5/8，再通過進一步激活并啟動其下游的信號轉導通路發揮其生物學功能。研究表明[22]，在MSCs定向成骨分化過程中，Smad5可通過促進成骨特異性標志物ALP及骨鈣素的表達，從而發揮其正向調控MSCs成骨分化的作用。據此，我們認為miR-93-5p的作用機制可能是通過靶向抑制Smad5的表達，從而阻礙BMPs-Smads信號通路的激活，并最終抑制MSCs成骨分化。
293T細胞常作為質粒轉染的工具細胞而被廣泛應用于研究miRNA與其靶基因調控關系的實驗中[23]。C3H10T1/2細胞系是一種小鼠胚胎源性MSCs，不但具有多向分化潛能，而且具有易于轉染、轉染效率穩定、較易獲得大量轉染成功的活細胞等諸多優勢，目前已被廣泛用于代表MSCs分化潛能的實驗研究中[24]。因此，本實驗選用了上述兩種細胞分別用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗及MSCs成骨分化的實驗研究中。
為明確Smad5是否為miR-93-5p調控的靶基因，本研究首先通過構建雙熒光素酶報告基因系統，將Smad5 mRNA 3’-UTR的野生序列WT或突變序列Mut分別克隆到pmiR-RB-REPORTTM載體中，構建出重組質粒pSmad5-WT或pSmad5-Mut；然后，將二者分別與miR-93-5p mimics或NC#22共轉入293T細胞進行熒光素酶活性檢測。結果顯示，與NC#22相比，轉染miR-93-5p mimics可抑制pSmad5-WT載體熒光素酶活性，但對pSmad5-Mut載體熒光素酶活性無顯著影響，提示miR-93-5p可與Smad5 mRNA 3’-UTR上的靶序列特異性結合，并抑制其熒光素酶活性。由此表明，Smad5可能是miR-93-5p的靶基因。但由于在生理狀態下，靶基因3’-UTR序列中miRNA的結合位點可能會因其空間構象的影響而被掩蓋，導致該miRNA無法發揮抑制靶基因表達的功能。因此，為了進一步驗證miR-93-5p與Smad5在生理狀態下是否仍具有上述靶向調控關系，本研究通過體外轉染miR-93-5p mimics或inhibitor至C3H10T1/2細胞，構建了miR-93-5p的功能獲得型或功能缺失型模型，然后分別通過qRT-PCR及Western blot檢測，觀察miR-93-5p對Smad5 mRNA及蛋白表達的影響情況。qRT-PCR檢測結果示，在C3H10T1/2細胞成骨分化過程中，miR-93-5p未對Smad5 mRNA的表達產生明顯影響。而Western blot檢測結果則顯示，轉染miR-93-5p mimics后，Smad5的蛋白相對表達量較對照組明顯下調；相反，轉染miR-93-5p inhibitor后，Smad5的蛋白相對表達量則明顯上調，且差異均有統計學意義（P＜0.05）。說明在C3H10T1/2細胞成骨分化過程中，miR-93-5p可在轉錄后水平抑制Smad5蛋白的表達，但不影響Smad5 mRNA的表達，這與miRNA調控靶基因的作用機制相符，進一步表明Smad5是miR-93-5p的靶基因。最后，茜素紅染色檢測顯示，miR-93-5p能夠在C3H10T1/2細胞成骨分化過程中抑制細胞外鈣鹽的沉積，從而抑制成骨分化。
綜上述，本研究結果表明，miR-93-5p可通過靶向抑制Smad5的表達，負向調控C3H10T1/2細胞成骨分化。由于Smad5是BMPs-Smads信號通路中的重要轉導因子，因此miR-93-5p調控成骨分化的作用機制可能是通過抑制Smad5的表達后，阻礙了BMPs-Smads下游信號通路的激活，進而抑制MSCs 的成骨分化。但對于miR-93-5p調控Smad5后所引起的下游反應尚不清楚，有待進一步深入研究。
MSCs是一類具有很強自我更新能力及多向分化潛能的干細胞，在適宜條件下可定向分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等多種成熟類型的細胞[1]。其中，成骨細胞是骨組織的重要組成細胞，也是參與骨形成的主要功能細胞；它在骨骼生長發育及骨量維持方面起關鍵作用。因此，研究MSCs定向成骨分化的分子機制，已成為骨組織工程及骨代謝領域的研究重點與熱點之一[2-3]。
微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來發現的一類長度18～25 nt的內源性、非編碼小RNA分子[4]。miRNA廣泛存在于真核生物中，并在進化上高度保守，主要通過與靶基因mRNA 3’-UTR以堿基配對的方式引導沉默復合體降解靶基因或阻礙其翻譯[5]。miRNA被認為是基因表達的重要調節器；據估計，在人類基因組中，盡管miRNA基因僅占整個基因組總數的4%左右，但調控了超過30%編碼基因的表達[6-7]。研究表明，miRNA參與了包括細胞增殖、分化、凋亡以及胚胎或個體的生長發育、組織器官分化、腫瘤的發生發展等幾乎所有生理或病理過程，并在其中發揮了重要的調控作用；其中，miRNA廣泛參與了MSCs定向成骨分化的調控過程[8-12]。
本課題組在前期研究中，通過miRNA芯片及實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）技術檢測發現miR-93-5p在C3H10T1/2細胞成骨分化過程中表達明顯降低，提示其在MSCs成骨分化中可能具有重要的調控作用[13]。隨后，通過綜合應用多種靶基因預測軟件（PicTar/TagetScan/miRanda/miRDB）進行生物信息學分析，發現Smad5可能是miR-93-5p的潛在靶基因。本次研究旨在進一步驗證miR-93-5p是否會通過調節Smad5的表達，影響C3H10T1/2細胞定向成骨分化。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
C3H10T1/2細胞系（美國ATCC細胞庫）；293T細胞（中國科學院上海細胞生物研究所）。H-DMEM培養基、FBS（HyClone公司，美國）；谷氨酰胺（GIBCO公司，美國）；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA、青霉素+鏈霉素雙抗、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、DMSO、ALP染色及定量試劑、茜素紅、PBS（Sigma公司，美國）；pmiR-RB-REPORTTM質粒載體、miR-93-5p mimics及其陰性對照（miRNA mimic negative control #22，NC#22）、miR-93-5p inhibitor及其陰性對照、ribo FECTTM CP轉染試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；大腸桿菌DH5α、質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Lipofectamine 2000、Trizol試劑、OPTI-MEM減血清培養基（Invitrogen公司，美國）；Dual-Glo? Luciferase Assay System（Promega公司，美國）；Smad5及內參GAPDH引物（GeneCopoeia公司，美國）；逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒（Takara公司，日本）；Smad5、β-actin單克隆抗體（Proteintech公司，美國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、考馬斯亮藍染色試劑盒（碧云天生物技術研究所）；SuperSignal? West Femto化學發光試劑盒（Pierce公司，美國）。
YU2200型超凈工作臺（Jouan公司，法國）；CO2培養箱（SANYO公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Eppendorf 5702臺式低溫離心機、核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司，德國）；NanoDrop? 8000分光光度計、NanoDrop ND-2000微量核酸測定儀（Thermo公司，美國）；Mill-Q Biocell超純水處理器（Millipore公司，美國）；圖像處理軟件（Corel公司，加拿大）；iQTM5熒光定量PCR儀、凝膠數字成像系統、水平電泳儀、半干轉膜儀、Quantity one軟件（Bio-Rad公司，美國）；熒光照度計（PE公司，美國）；ABI 7900HT qRT-PCR儀（ABI公司，美國）。引物合成及序列測定由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。
1.2 細胞培養與成骨誘導分化實驗
1.2.1 C3H10T1/2細胞培養與傳代
取C3H10T1/2細胞系，加入完全培養液（含90%H-DMEM培養基、10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10 μmol/mL谷氨酰胺），置于37℃、5%CO2及95%飽和濕度恒溫培養箱培養，每2～3天換液1次；待細胞生長至90%～100%匯合度時，吸棄原培養液，PBS清洗2～3次，37℃、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化1～2 min；隨后輕拍培養皿至細胞全部浮起并盡量分散開，加入適量完全培養液終止反應，用移液器反復吹打若干次；室溫下以300×g離心5 min，收集細胞，棄上清后加入完全培養液重懸細胞，按1∶（2～5）比例進行傳代培養。
1.2.2 細胞成骨誘導培養
取第3～5代C3H10T1/2細胞，以1×105個/孔密度接種于6孔板，當細胞生長至80%～85%匯合度時，將培養基更換為成骨誘導培養液（含完全培養液、100 nmol/L地塞米松、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）進行成骨誘導培養，每2～3天換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。誘導7 d后，行成骨早期標志物ALP檢測（ALP染色及定量）；并分別于誘導后7、14、21 d行茜素紅染色，檢測鈣結節形成情況。取未誘導細胞作為對照組進行相關檢測。
1.2.3 ALP染色（偶氮偶聯法）
① 孵育液配制：萘酚AS-BI磷酸鹽20 mg+DMSO 500 μL+0.2 mol/ L巴比妥醋酸緩沖液（pH9.2）50 mL+六偶氮副品紅500 μL。② 染色步驟：洗棄培養液，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定10 min；再用ddH2O沖洗2～3次；每孔加入過濾孵育液300 μL，室溫下作用45 min；去掉孵育液，ddH2O沖洗3次，觀察見細胞內有棕紅色ALP顆粒沉積為陽性染色。
1.2.4 ALP定量（pNPP法）
吸棄培養液，用預冷PBS清洗細胞2～3次，將細胞刮入PBS中，室溫下以300×g離心5 min，棄上清，用300～500 μL ddH2O重懸細胞；隨后將其置于-80℃冰箱30 min后取出，37℃水浴5 min，反復凍融3 次；4℃以12 000×g離心30 min，轉移上清備用。將50 μL pNPP儲備液、100 μL二乙醇胺和50 μL待測蛋白樣品混合，37℃水浴30 min，加入200 μL 3 mol/ L NaOH終止反應，取出200 μL樣品置于96孔板中，酶標儀測定405 nm處吸光度（A）值。
1.2.5 茜素紅染色
吸棄培養液，用PBS清洗2次，95%乙醇固定10 min，ddH2O反復沖洗3次；加入適量0.1%茜素紅染液，置于37℃恒溫箱內孵育20～30 min；去掉茜素紅染液，PBS或ddH2O漂洗2次，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.3 靶基因鑒定實驗
1.3.1 雙熒光素酶報告基因構建
多種靶基因預測軟件（PicTar/TagetScan/miRanda/miRDB）預測出Smad5 mRNA的3’-UTR上776～782 nt為miR-93-5p的結合位點（GCACTTT）。人工合成Smad5 mRNA 3’-UTR區的靶位點序列（WT）以及對WT靶位點進行定點突變（GCACTTT→CGTGAAA）后的序列（Mut）；使用XhoⅠ及NotⅠ限制性內切酶對pmiR-RB-REPORTTM質粒進行酶切，再將人工合成的目的基因片段WT或Mut分別克隆到pmiR-RB-REPORTTM載體中，構建重組質粒pSmad5-WT或pSmad5-Mut；最后通過測序確認重組質粒載體是否構建成功。
1.3.2 雙熒光素酶報告基因檢測
根據轉染的miRNA及重組質粒不同，實驗分為4組：A組轉染miR-93-5p mimics與pSmad5-WT；B組轉染NC#22與pSmad5-WT；C組轉染miR-93-5p mimics與pSmad5-Mut；D組轉染NC#22與pSmad5-Mut。轉染方法：① 取對數生長期293T細胞，以1.5×104個/孔接種于96孔板中（100 μL/孔），于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養24 h。② 取10 μL OPTI-MEM減血清培養基稀釋miR-93-5p mimics或NC#22，15 μL OPTI-MEM減血清培養基稀釋重組質粒pSmad5-WT或pSmad5-Mut，25 μL OPTI-MEM減血清培養基稀釋0.25 μL Lipofectamine 2000，5 min后三者混合，共50 μL，輕輕搖勻，靜置20 min。③ 質粒、miR-93-5p mimics/NC#22加入細胞前，每孔先吸走50 μL培養基，然后再加入上述50 μL混合液，最終每孔總體積100 μL；其中miR-93-5p mimics/NC#22轉染濃度均為50 nmol/L，質粒濃度為100 ng/ 孔，每組設3 個復孔；6 h后再加100 μL新鮮培養基。④ 轉染48 h后進行雙熒光素酶報告基因檢測，并比較A、C組hRluc/hLuc活性（活性由hRluc與hLuc熒光素酶基因相對表達量來表示，通過測量二者熒光值的比值間接反映）。
1.4 功能驗證實驗
1.4.1 轉染及成骨誘導分化培養
取第5代C3H10T1/2細胞，根據轉染的miRNA不同，實驗分為4組：M組（過表達組）轉染 miR-93-5p mimics；MC組（過表達對照組）轉染 NC#22；In組（沉默表達組）轉染 miR-93-5p inhibitor；InC組（沉默表達對照組） 轉染miR-93-5p inhibitor陰性對照。每組均設3個復孔。轉染方法：按照ribo FECTTM CP轉染試劑盒方法進行轉染，轉染濃度M組及MC組為50 nmol/ L，In組及InC組為100 nmol/L。轉染同時對各組進行成骨誘導培養（方法同1.2.2），于誘導培養48 h后，分別行qRT-PCR及Western blot檢測Smad5 mRNA及蛋白表達；14 d后行茜素紅染色，觀察細胞外鈣鹽沉積情況。
1.4.2 qRT-PCR檢測
用Trizol試劑提取細胞總RNA，并進行質量鑒定。Smad5及內參GAPDH引物使用美國GeneCopoeia公司設計合成并經驗證后的特異引物。首先，使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行20.0 μL體系的逆轉錄反應。然后，取2.0 μL逆轉錄產物行PCR反應（按SYBR? Premix Ex TaqTM Kit試劑盒說明操作），反應體系20.0 μL：10.0 μL 5×SYBR Green buffer、1.0 μL上游引物、1.0 μL下游引物、2.0 μL cDNA模板，雙蒸水補足20.0 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。最后，以GAPDH作為內參照，采用SYBR Green Ⅰ染料法，同時擴增待測基因及管家基因。計算2-ΔΔCt，獲得Smad5的mRNA相對表達量，實驗重復3次，取均值，Quantity one軟件分析結果。
1.4.3 Western
blot檢測使用RIPA裂解液裂解細胞后，提取總蛋白；BCA法測定細胞蛋白濃度（按試劑盒說明書進行操作）；取50 μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳；電泳結束后轉移至聚偏氟乙烯膜，經脫脂奶粉封閉后，加入至稀釋的兔抗鼠Smad5及β-actin一抗工作液中（1∶600），4℃過夜，漂洗后轉入稀釋的羊抗兔二抗工作液中（1∶2 000），室溫孵育2 h；化學發光試劑ECL顯色后，拍照并測定內參蛋白及待測蛋白條帶的A值，獲得待測蛋白的相對表達量。Quantity one軟件分析結果。
1.4.4 鈣基質檢測
通過茜素紅染色檢測各組細胞外鈣基質的沉積情況（方法同1.2.5）。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 C3H10T1/2細胞成骨誘導效果檢測
成骨誘導21 d內，細胞形態變化不明顯，但隨誘導時間延長，可見細胞逐漸聚集成團，且部分區域透光性明顯減弱，可能為鈣鹽沉積區。見圖 1。ALP染色示，對照組基本無ALP活性，成骨誘導7 d后誘導組有明顯的ALP活性。見圖 2。ALP定量檢測示，誘導組ALP的相對表達量（0.71±0.07）顯著高于對照組（0.18±0.04），差異有統計學意義（t= -11.608，P=0.000）。成骨誘導7、14、21 d，誘導組茜素紅染色均呈陽性，且逐漸加深；對照組染色均為陰性。見圖 3。
圖1
成骨誘導各時間點細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×200） ? 1 d ? 7 d ? 14 d ? 21 d ? ?2.2 靶基因鑒定
2.2.1 重組質粒載體構建鑒定
測序結果顯示，重組質粒pSmad5-WT及pSmad5-Mut的實際序列與理論序列完全一致，無堿基缺失、替換等，說明攜帶目的基因的雙熒光素酶報告載體構建成功。見圖 4。
2.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測
結果顯示，A、B、C、D組熒光素酶相對表達量分別為0.74±0.25、1.00±0.01、0.91±0.03、1.00±0.01，A組顯著低于B組，差異有統計學意義（t=17.889，P=0.000）；C、D組間差異無統計學意義（t=5.970，P=0.093）。此外，與A組相比，C組hRluc/hLuc活性明顯恢復，差異有統計學意義（t= -8.273，P=0.001）。
2.3 功能驗證實驗
2.3.1 qRT-PCR檢測
結果顯示，轉染后48 h M組、In組、MC組、InC組Smad5 mRNA相對表達量分別為0.88±0.02、1.06±0.76、0.95±0.08、0.95±0.06；M組和In組與對應陰性對照組MC組及InC組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5。
2.3.2 Western
blot檢測結果顯示，轉染后48 h M組、In組、MC組、InC組Smad5蛋白相對表達量分別為0.41±0.03、0.88±0.04、0.69±0.03、0.72±0.03；M組和In組與對應陰性對照組MC組及InC組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。其中，M組Smad5蛋白相對表達量較MC組明顯下調，而In組則較InC組明顯上調。見圖 6。
2.3.3 鈣基質檢測
成骨誘導14 d茜素紅染色示，與對應陰性對照組MC組及InC組相比，M組能顯著減少鈣基質的形成，相反In組鈣基質形成明顯增加。見圖 7、8。
圖7
成骨誘導14 d各組茜素紅染色觀察從左至右依次為In組、InC組、MC組、M組 ? ?3 討論
miRNA作為一類重要的轉錄后調控因子，廣泛參與了對各種生物學過程的調控。其中，在MSCs定向成骨分化或骨形成過程中，眾多miRNA在其中扮演了重要的調控角色。例如，Luzi等[14]報道miR-26a可通過靶向作用于Smad1抑制人脂肪源性干細胞成骨分化；Zhang等[15]通過一系列體內外實驗研究發現，miR-335-5p可通過抑制Dkk1的表達，促進MSCs成骨分化及骨形成；康夏等[16]研究顯示，miRNA-451可通過靶向抑制鈣結合蛋白39的表達，促進MSCs成骨分化；另據Hwang等[17]報道，miR-140-5p可直接抑制BMP-2的表達，從而負向調控人MSCs成骨分化；此外，Huang等[18]的研究表明，miR-125b可直接下調其靶基因Cbfβ的表達，從而抑制C3H10T1/2細胞成骨分化。以上研究均說明miRNA能影響成骨分化及骨形成過程。但由于miRNA與靶基因之間是“多對多”的關系，即1條miRNA可作用于多個靶基因，而同一靶基因又可能受到多條miRNA的共同調控，因此目前對miRNA調控成骨分化的網絡機制仍未完全闡明，有待進一步研究。
本課題組前期實驗首先通過對C3H10T1/2細胞進行定向成骨誘導，并利用miRNA芯片及qRT-PCR檢測發現，miR-93-5p在成骨分化過程中表達逐漸下調，提示其在MSCs成骨分化中可能具有重要的調控作用；然后，通過應用TargetScan等生物信息學軟件預測發現，Smad5是miR-93-5p的潛在靶基因之一。大量研究表明[19-21]，Smad5是BMPs-Smads信號通路（調控MSCs成骨分化關鍵信號通路）中的重要信號分子，Smad5可在活化的BMPⅠ型受體（BMP receptorⅠ，BMPR-Ⅰ）及BMPR-Ⅱ的共同作用下發生磷酸化而被激活，活化后的Smad5可與另外兩個活化的SMAD家族成員Smad1及Smad8結合并形成復合體p-Smad1/5/8，再通過進一步激活并啟動其下游的信號轉導通路發揮其生物學功能。研究表明[22]，在MSCs定向成骨分化過程中，Smad5可通過促進成骨特異性標志物ALP及骨鈣素的表達，從而發揮其正向調控MSCs成骨分化的作用。據此，我們認為miR-93-5p的作用機制可能是通過靶向抑制Smad5的表達，從而阻礙BMPs-Smads信號通路的激活，并最終抑制MSCs成骨分化。
293T細胞常作為質粒轉染的工具細胞而被廣泛應用于研究miRNA與其靶基因調控關系的實驗中[23]。C3H10T1/2細胞系是一種小鼠胚胎源性MSCs，不但具有多向分化潛能，而且具有易于轉染、轉染效率穩定、較易獲得大量轉染成功的活細胞等諸多優勢，目前已被廣泛用于代表MSCs分化潛能的實驗研究中[24]。因此，本實驗選用了上述兩種細胞分別用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗及MSCs成骨分化的實驗研究中。
為明確Smad5是否為miR-93-5p調控的靶基因，本研究首先通過構建雙熒光素酶報告基因系統，將Smad5 mRNA 3’-UTR的野生序列WT或突變序列Mut分別克隆到pmiR-RB-REPORTTM載體中，構建出重組質粒pSmad5-WT或pSmad5-Mut；然后，將二者分別與miR-93-5p mimics或NC#22共轉入293T細胞進行熒光素酶活性檢測。結果顯示，與NC#22相比，轉染miR-93-5p mimics可抑制pSmad5-WT載體熒光素酶活性，但對pSmad5-Mut載體熒光素酶活性無顯著影響，提示miR-93-5p可與Smad5 mRNA 3’-UTR上的靶序列特異性結合，并抑制其熒光素酶活性。由此表明，Smad5可能是miR-93-5p的靶基因。但由于在生理狀態下，靶基因3’-UTR序列中miRNA的結合位點可能會因其空間構象的影響而被掩蓋，導致該miRNA無法發揮抑制靶基因表達的功能。因此，為了進一步驗證miR-93-5p與Smad5在生理狀態下是否仍具有上述靶向調控關系，本研究通過體外轉染miR-93-5p mimics或inhibitor至C3H10T1/2細胞，構建了miR-93-5p的功能獲得型或功能缺失型模型，然后分別通過qRT-PCR及Western blot檢測，觀察miR-93-5p對Smad5 mRNA及蛋白表達的影響情況。qRT-PCR檢測結果示，在C3H10T1/2細胞成骨分化過程中，miR-93-5p未對Smad5 mRNA的表達產生明顯影響。而Western blot檢測結果則顯示，轉染miR-93-5p mimics后，Smad5的蛋白相對表達量較對照組明顯下調；相反，轉染miR-93-5p inhibitor后，Smad5的蛋白相對表達量則明顯上調，且差異均有統計學意義（P＜0.05）。說明在C3H10T1/2細胞成骨分化過程中，miR-93-5p可在轉錄后水平抑制Smad5蛋白的表達，但不影響Smad5 mRNA的表達，這與miRNA調控靶基因的作用機制相符，進一步表明Smad5是miR-93-5p的靶基因。最后，茜素紅染色檢測顯示，miR-93-5p能夠在C3H10T1/2細胞成骨分化過程中抑制細胞外鈣鹽的沉積，從而抑制成骨分化。
綜上述，本研究結果表明，miR-93-5p可通過靶向抑制Smad5的表達，負向調控C3H10T1/2細胞成骨分化。由于Smad5是BMPs-Smads信號通路中的重要轉導因子，因此miR-93-5p調控成骨分化的作用機制可能是通過抑制Smad5的表達后，阻礙了BMPs-Smads下游信號通路的激活，進而抑制MSCs 的成骨分化。但對于miR-93-5p調控Smad5后所引起的下游反應尚不清楚，有待進一步深入研究。
