引用本文： 朱厚毅, 王運濤, 王鋒, 時睿, 宋鵬, 康新貴. 大鼠不同節段椎間盤髓核細胞分離鑒定及生物特性的對比研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(10): 1295-1300. doi: 10.7507/1002-1892.20150280 復制
椎間盤退變是引起下腰痛的主要原因，保守治療及手術治療均以緩解癥狀為主，而相關手術帶來的脊柱力學及解剖結構變化，可能進一步加重椎間盤退變及腰椎不穩[1]。研究發現引起腰椎間盤退變的起因是髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）數量減少及功能下降，進而導致髓核及椎間盤結構和功能的退變[2-3]。因此近年來以逆轉退變椎間盤結構及其生理功能為目的的細胞移植療法逐漸成為治療椎間盤退變的研究熱點[3-5]。NPCs對維持髓核基質成分平衡起到關鍵作用，因此研究NPCs生物學特性，對以NPCs作為種子細胞的細胞移植療法具有重要意義[5-8]。目前已有關于NPCs體外培養條件如pH值、氧濃度、營養狀況等的研究[9-10]，但對其選材部位研究少見報道。本實驗通過對大鼠不同節段椎間盤NPCs分離、培養，比較其活性、生長特性等變化，為選擇恰當細胞進一步研究椎間盤退變奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康8周齡SD大鼠20只，雌雄不限，體質量（200±15）g，由東南大學實驗動物中心提供。
FBS、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（GIBCO公司，美國）；Ⅱ型膠原免疫組織化學試劑盒、衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；DMEM/F12培養基（HyClone公司，美國）；錐蟲藍、甲苯胺藍（Biosharp生物材料公司）；兔抗大鼠Ⅱ型膠原抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。細胞培養箱、超低溫冰箱（Thermo公司，美國）；低速離心機（北京醫用離心機廠）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 NPCs分離培養
取SD大鼠，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉（1 mL/ kg）麻醉。醫用乙醇浸泡消毒3 min，沿背部剪開皮膚至尾尖處，游離整段脊柱，去除附著組織筋膜后，置聚維酮碘溶液中轉移至超凈臺，用無菌PBS沖洗脊柱至沖洗液澄清。按解剖部位不同分為腰段（L1、2～L6、S1）及尾段（C1、2～C17、18）兩組（n=5）。分別取等量節段椎體，切開外層纖維環，顯微鑷將膠凍狀髓核組織完整取出，分別放入盛有PBS的培養皿中。眼科剪將其分別剪至1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊后，收集組織懸液，以300×g離心5 min；棄上清，將沉淀置于5倍體積的0.1%Ⅱ型膠原酶內，37℃恒溫震動消化4 h，100目篩網過濾；收集細胞懸液，300×g離心5 min，棄上清，PBS洗滌1次，最后以完全培養基（含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養基）重懸并計數，以5 000個/cm2接種于25 cm2培養瓶，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養。4 d后首次換液，以后每3天換液1 次。細胞達90%融合后傳代，PBS洗滌1次，0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA室溫消化，待倒置相差顯微鏡下見細胞皺縮變圓漂浮時，立即用等量完全培養基終止消化；滴管輕輕吹打，制成細胞懸液。300×g離心5 min，棄上清，完全培養基重懸后，以1∶2比例傳代接種至新培養瓶，置于培養箱中繼續培養。分別記錄貼壁時間、細胞生長至90%融合的時間。
1.3 不同節段NPCs形態學觀察
1.3.1 組織學觀察
取兩組第2 代NPCs常規爬片，然后去除培養基，PBS沖洗5 min×3 次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗5 min×3次。常規行HE染色及甲苯胺藍染色，光鏡下觀察。
1.3.2 Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學染色
同1.3.1方法細胞爬片及固定，PBS沖洗5 min×3次，0.1%Triton X-100/TBST溶液孵育10 min，PBS沖洗5 min×3次，3%H2O2室溫孵育 10 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊血清，室溫下孵育 10 min。去除血清，滴加兔抗大鼠Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體（1∶200），以PBS替代一抗作為陰性對照，置濕盒內4℃過夜。PBS沖洗5 min×3次，滴加辣根過氧物酶標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3 次，滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min×3次；使用DAB顯色試劑盒室溫顯色，光鏡下控制反應時間。蘇木精復染，沖洗，脫水封片，光鏡下觀察。
1.4 不同節段NPCs培養特性檢測
1.4.1 活力測定
分別取兩組第1～5 代NPCs行錐蟲藍染色實驗，測定細胞活力。0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集，PBS洗滌1次，以300×g離心5 min，最后1 mL PBS重懸細胞，調整細胞密度為1×105 個 / mL。取500 μL細胞懸液移入離心管中，加入500 μL 4%錐蟲藍溶液混勻。倒置相差顯微鏡下用細胞計數板分別計數死細胞和活細胞數，死細胞被染成淡藍色，活細胞拒染。計數3次，取均值計算細胞活力，公式為：未藍染細胞/（藍染細胞+未藍染細胞）×100%。
1.4.2 增殖能力測定
分別取兩組接近90%融合的第1代NPCs，0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集，每組取12塊96孔板，以2×103個/孔將細胞接種于孔板中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養。每天取1孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于原培養箱內孵育4 h后，用酶標儀測定其在450 nm處的吸光度（A）值。以培養時間為橫軸，A值為縱軸，繪制細胞生長曲線。
1.4.3 總蛋白合成檢測
分別取兩組第1～5代NPCs計數，按1×105個/mL濃度接種于6 孔板中，培養3 d后，棄培養基，PBS沖洗、瀝干后，細胞裂解液充分裂解，收集蛋白，BCA法測定兩組不同代次總蛋白含量。
1.4.4 衰老相關SA-β-gal染色
分別取兩組第1～5代NPCs，按1.4.3方法培養3 d后，棄培養基，PBS沖洗1次，固定液室溫固定15 min，PBS沖洗3 min×3次，加入1 mL SA-β-gal染色液，37℃孵育過夜。光鏡下隨機選擇10個視野（×100），分別計數藍染陽性細胞及未染色陰性細胞數，計算老化細胞陽性率，公式為：藍染細胞/（藍染細胞+未藍染細胞） ×100%。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用單因素方差分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組NPCs的生長特點
成功分離大鼠腰段及尾段原代NPCs，并連續培養。尾段原代NPCs貼壁時間為（9.4±0.7）h，少于腰段原代NPCs的（14.6±1.8）h，差異有統計學意義（t=2.94，P=0.03）。傳代后腰段NPCs貼壁時間較原代明顯縮短，第1代尾段及腰段NPCs貼壁時間分別為（6.3±0.5）h和（6.6±0.5）h，組間比較差異無統計學意義（t=0.18，P=0.82）。
尾段和腰段原代NPCs生長至90%融合所需時間分別為（13.0±1.6）d和（16.7±0.8）d，差異有統計學意義（t=3.46，P=0.03）；傳代后兩組細胞生長至90%融合所需時間較原代縮短，第1代尾段NPCs所需時間為（8.6±1.5）d，少于腰段的（12.5±1.7）d，組間比較差異有統計學意義（t=4.00，P=0.04）。
2.2 兩組NPCs形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，兩組尚未貼壁的NPCs呈圓形，貼壁后NPCs伸出偽足變成類圓形或多角形（圖 1）。HE染色示，經傳代純化后的第2代腰段及尾段NPCs細胞核大而完整、呈卵圓形、均一藍黑色，細胞質呈粉色；腰段NPCs以長梭形為主，尾段NPCs以多角形、不規則形為主（圖 2）。甲苯胺藍染色示細胞質蛋白多糖藍染，越靠近細胞核處染色越深；腰段NPCs為長梭形，尾段NPCs為不規則形（圖 3）。免疫組織化學染色示Ⅱ型膠原蛋白被染成黃褐色顆粒狀，位于細胞質，以核周區較為明顯，蘇木素復染后細胞核呈藍色，兩組顯示出的細胞形態特點與HE染色、甲苯胺藍染色相同（圖 4）。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察腰段NPCs形態（×200） ? 未貼壁細胞 ? 貼壁后細胞 ? ?2.3 兩組NPCs培養特性檢測
2.3.1 活力測定
腰段及尾段兩組間及組內各代次NPCs活力比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
兩組各代NPCs活力比較（n=5，%，2.3.2 增殖能力測定
腰段及尾段兩組NPCs生長曲線均近似S形（圖 5）。腰段細胞接種前3 d增殖相對緩慢，處于潛伏期，于4～5 d開始進入對數生長期，11 d左右進入平臺期；尾段細胞生長停滯期較短，3 d后即進入對數生長期，9 d左右進入平臺期。培養1、2、10、11、12 d兩組細胞A值差異無統計學意義（P＞0.05），3～9 d尾段細胞A值高于腰段，差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.3.3 總蛋白合成檢測
兩組NPCs總蛋白含量組內各代次間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；尾段各代NPCs總蛋白含量均顯著高于同代腰段NPCs，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
兩組各代NPCs總蛋白含量比較（n=5，mg/mL，2.3.4 衰老相關SA-β-gal染色
光鏡下可見經SA-β-gal染色后，陽性細胞胞質呈藍綠色，染色陰性細胞胞質內不著色；衰老NPCs形態不規則，胞體寬大扁平，質核比例增加，細胞質中可見空泡。見圖 6。兩組內各代次間老化細胞陽性率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；兩組間第1、2、3代比較差異無統計學意義（P＞0.05），腰段第4、5代老化細胞陽性率高于同代尾段細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
兩組各代NPCs老化細胞陽性率比較（n=5，%，3 討論
椎間盤是脊柱椎體的連接部分，由髓核、纖維環和軟骨終板組成。椎間盤退變的確切機制仍未完全明確，但大量相關研究表明NPCs在退變中起到核心作用[11-12]。研究顯示，正常椎間盤NPCs含量僅占髓核組織體積的1%，但它們對平衡椎間盤內包括蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白等基質的合成、表達以及維持新陳代謝等卻起著關鍵作用[13]。因此NPCs生物學特性的研究成為探索細胞移植療法治療椎間盤退變的基礎[14]。
目前關于不同種屬NPCs的體外培養研究較多，但少見不同節段NPCs的相關研究。各節段椎間盤髓核組織所承受的壓力、所含細胞數量及細胞增殖能力不同，致使其退變程度不同。因此為了找到更符合實驗要求的取材部位提取細胞，對各個節段NPCs的生物學特性進行研究具有重要意義。國內有學者對兔不同節段椎間盤來源NPCs的生物學特性進行研究，發現與頸段及胸段NPCs相比，兔腰段椎間盤NPCs活力好、貼壁速率快、蛋白分泌量最高，更適宜作為實驗研究的種子細胞[15]。
由于進化原因，大鼠的脊柱解剖及生物力學比較特殊，尤其是尾椎間盤較少受到應力作用。因此尾椎間盤NPCs能較好地反映椎間盤在增齡方面的變化[16]。本實驗選取大鼠腰椎間盤NPCs以及既往較少應用的尾椎間盤NPCs作為研究對象，觀察比較兩處NPCs活性及生長特性等變化。研究結果表明，大鼠原代尾段NPCs貼壁時間、生長達90%融合時間均顯著少于腰段，傳代后尾段NPCs達90%融合時間仍顯著縮短，說明在培養效率方面尾段NPCs具有明顯優勢。而且單只大鼠尾段椎間盤數量遠多于腰段，獲取的髓核組織量較多，因此將尾椎作為NPCs取材部位具有明顯優勢。
在大鼠尾椎間盤髓核提取的細胞中含有較多體積大、細胞質內含有大量液泡結構的脊索細胞，而腰段極少，這與大鼠胚胎發育過程中脊索在尾椎大量殘留有關；而來源于內胚層的脊索細胞逐漸減少，被來源于中胚層的軟骨樣細胞所替代，可能是細胞衰老、椎間盤退變的重要病理學基礎[17]。有研究表明脊索細胞可通過表達TGF-β1、金屬蛋白酶組織抑制因子、結締組織生長因子等多種因子修復退變椎間盤，并維持椎間盤的自我更新[18]。同時Gantenbein等[19]研究表明，在脊索細胞培養基（notochordal cells conditioned medium，NCCM）的作用下，NPCs中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因表達會明顯增強；馬凱歌等[20]研究顯示，在NCCM作用下，MSCs的增殖能力明顯升高，并誘導MSCs向類髓核樣分化，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因表達明顯上升。上述結果均提示脊索細胞分泌的細胞外基質對于修復退變椎間盤，維持椎間盤的自我更新有重要作用。Yurube等[21]在退變椎間盤動物模型中觀察到脊索細胞大量凋亡，他們認為脊索細胞在青春期時消失即是椎間盤開始退變的標志。
與人類相比，大鼠的生命周期較短，因此相應NPCs的壽命也顯著縮短。NPCs本身增殖潛能有限，會隨著傳代次數增加呈老化趨勢[22]。本實驗結果顯示腰段NPCs進入衰老狀態的細胞量較尾段多，說明腰段NPCs保持穩定活性的時間較短。不同細胞生長狀態對實驗結果有著重要影響，因此實驗中需要根據不同要求對不同節段及代次的NPCs實驗時間進行考量，以減少實驗誤差。
綜上述，大鼠尾段NPCs貼壁時間短、增殖速度快、分泌功能旺盛，并具有取材簡便、細胞數量相對較多等優點，可作為理想的實驗種子細胞。但由于大鼠脊柱解剖及生物力學特作為點與人類存在差異，故大鼠NPCs的培養特性尚不足以全面評估人NPCs在椎間盤退變過程中所受全部外部因素的影響。因此，關于人類不同節段正常或退變NPCs的培養特性有待進一步探索。
椎間盤退變是引起下腰痛的主要原因，保守治療及手術治療均以緩解癥狀為主，而相關手術帶來的脊柱力學及解剖結構變化，可能進一步加重椎間盤退變及腰椎不穩[1]。研究發現引起腰椎間盤退變的起因是髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）數量減少及功能下降，進而導致髓核及椎間盤結構和功能的退變[2-3]。因此近年來以逆轉退變椎間盤結構及其生理功能為目的的細胞移植療法逐漸成為治療椎間盤退變的研究熱點[3-5]。NPCs對維持髓核基質成分平衡起到關鍵作用，因此研究NPCs生物學特性，對以NPCs作為種子細胞的細胞移植療法具有重要意義[5-8]。目前已有關于NPCs體外培養條件如pH值、氧濃度、營養狀況等的研究[9-10]，但對其選材部位研究少見報道。本實驗通過對大鼠不同節段椎間盤NPCs分離、培養，比較其活性、生長特性等變化，為選擇恰當細胞進一步研究椎間盤退變奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康8周齡SD大鼠20只，雌雄不限，體質量（200±15）g，由東南大學實驗動物中心提供。
FBS、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（GIBCO公司，美國）；Ⅱ型膠原免疫組織化學試劑盒、衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；DMEM/F12培養基（HyClone公司，美國）；錐蟲藍、甲苯胺藍（Biosharp生物材料公司）；兔抗大鼠Ⅱ型膠原抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。細胞培養箱、超低溫冰箱（Thermo公司，美國）；低速離心機（北京醫用離心機廠）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 NPCs分離培養
取SD大鼠，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉（1 mL/ kg）麻醉。醫用乙醇浸泡消毒3 min，沿背部剪開皮膚至尾尖處，游離整段脊柱，去除附著組織筋膜后，置聚維酮碘溶液中轉移至超凈臺，用無菌PBS沖洗脊柱至沖洗液澄清。按解剖部位不同分為腰段（L1、2～L6、S1）及尾段（C1、2～C17、18）兩組（n=5）。分別取等量節段椎體，切開外層纖維環，顯微鑷將膠凍狀髓核組織完整取出，分別放入盛有PBS的培養皿中。眼科剪將其分別剪至1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊后，收集組織懸液，以300×g離心5 min；棄上清，將沉淀置于5倍體積的0.1%Ⅱ型膠原酶內，37℃恒溫震動消化4 h，100目篩網過濾；收集細胞懸液，300×g離心5 min，棄上清，PBS洗滌1次，最后以完全培養基（含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養基）重懸并計數，以5 000個/cm2接種于25 cm2培養瓶，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養。4 d后首次換液，以后每3天換液1 次。細胞達90%融合后傳代，PBS洗滌1次，0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA室溫消化，待倒置相差顯微鏡下見細胞皺縮變圓漂浮時，立即用等量完全培養基終止消化；滴管輕輕吹打，制成細胞懸液。300×g離心5 min，棄上清，完全培養基重懸后，以1∶2比例傳代接種至新培養瓶，置于培養箱中繼續培養。分別記錄貼壁時間、細胞生長至90%融合的時間。
1.3 不同節段NPCs形態學觀察
1.3.1 組織學觀察
取兩組第2 代NPCs常規爬片，然后去除培養基，PBS沖洗5 min×3 次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗5 min×3次。常規行HE染色及甲苯胺藍染色，光鏡下觀察。
1.3.2 Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學染色
同1.3.1方法細胞爬片及固定，PBS沖洗5 min×3次，0.1%Triton X-100/TBST溶液孵育10 min，PBS沖洗5 min×3次，3%H2O2室溫孵育 10 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊血清，室溫下孵育 10 min。去除血清，滴加兔抗大鼠Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體（1∶200），以PBS替代一抗作為陰性對照，置濕盒內4℃過夜。PBS沖洗5 min×3次，滴加辣根過氧物酶標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3 次，滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min×3次；使用DAB顯色試劑盒室溫顯色，光鏡下控制反應時間。蘇木精復染，沖洗，脫水封片，光鏡下觀察。
1.4 不同節段NPCs培養特性檢測
1.4.1 活力測定
分別取兩組第1～5 代NPCs行錐蟲藍染色實驗，測定細胞活力。0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集，PBS洗滌1次，以300×g離心5 min，最后1 mL PBS重懸細胞，調整細胞密度為1×105 個 / mL。取500 μL細胞懸液移入離心管中，加入500 μL 4%錐蟲藍溶液混勻。倒置相差顯微鏡下用細胞計數板分別計數死細胞和活細胞數，死細胞被染成淡藍色，活細胞拒染。計數3次，取均值計算細胞活力，公式為：未藍染細胞/（藍染細胞+未藍染細胞）×100%。
1.4.2 增殖能力測定
分別取兩組接近90%融合的第1代NPCs，0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集，每組取12塊96孔板，以2×103個/孔將細胞接種于孔板中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養。每天取1孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于原培養箱內孵育4 h后，用酶標儀測定其在450 nm處的吸光度（A）值。以培養時間為橫軸，A值為縱軸，繪制細胞生長曲線。
1.4.3 總蛋白合成檢測
分別取兩組第1～5代NPCs計數，按1×105個/mL濃度接種于6 孔板中，培養3 d后，棄培養基，PBS沖洗、瀝干后，細胞裂解液充分裂解，收集蛋白，BCA法測定兩組不同代次總蛋白含量。
1.4.4 衰老相關SA-β-gal染色
分別取兩組第1～5代NPCs，按1.4.3方法培養3 d后，棄培養基，PBS沖洗1次，固定液室溫固定15 min，PBS沖洗3 min×3次，加入1 mL SA-β-gal染色液，37℃孵育過夜。光鏡下隨機選擇10個視野（×100），分別計數藍染陽性細胞及未染色陰性細胞數，計算老化細胞陽性率，公式為：藍染細胞/（藍染細胞+未藍染細胞） ×100%。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用單因素方差分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組NPCs的生長特點
成功分離大鼠腰段及尾段原代NPCs，并連續培養。尾段原代NPCs貼壁時間為（9.4±0.7）h，少于腰段原代NPCs的（14.6±1.8）h，差異有統計學意義（t=2.94，P=0.03）。傳代后腰段NPCs貼壁時間較原代明顯縮短，第1代尾段及腰段NPCs貼壁時間分別為（6.3±0.5）h和（6.6±0.5）h，組間比較差異無統計學意義（t=0.18，P=0.82）。
尾段和腰段原代NPCs生長至90%融合所需時間分別為（13.0±1.6）d和（16.7±0.8）d，差異有統計學意義（t=3.46，P=0.03）；傳代后兩組細胞生長至90%融合所需時間較原代縮短，第1代尾段NPCs所需時間為（8.6±1.5）d，少于腰段的（12.5±1.7）d，組間比較差異有統計學意義（t=4.00，P=0.04）。
2.2 兩組NPCs形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，兩組尚未貼壁的NPCs呈圓形，貼壁后NPCs伸出偽足變成類圓形或多角形（圖 1）。HE染色示，經傳代純化后的第2代腰段及尾段NPCs細胞核大而完整、呈卵圓形、均一藍黑色，細胞質呈粉色；腰段NPCs以長梭形為主，尾段NPCs以多角形、不規則形為主（圖 2）。甲苯胺藍染色示細胞質蛋白多糖藍染，越靠近細胞核處染色越深；腰段NPCs為長梭形，尾段NPCs為不規則形（圖 3）。免疫組織化學染色示Ⅱ型膠原蛋白被染成黃褐色顆粒狀，位于細胞質，以核周區較為明顯，蘇木素復染后細胞核呈藍色，兩組顯示出的細胞形態特點與HE染色、甲苯胺藍染色相同（圖 4）。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察腰段NPCs形態（×200） ? 未貼壁細胞 ? 貼壁后細胞 ? ?2.3 兩組NPCs培養特性檢測
2.3.1 活力測定
腰段及尾段兩組間及組內各代次NPCs活力比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
兩組各代NPCs活力比較（n=5，%，2.3.2 增殖能力測定
腰段及尾段兩組NPCs生長曲線均近似S形（圖 5）。腰段細胞接種前3 d增殖相對緩慢，處于潛伏期，于4～5 d開始進入對數生長期，11 d左右進入平臺期；尾段細胞生長停滯期較短，3 d后即進入對數生長期，9 d左右進入平臺期。培養1、2、10、11、12 d兩組細胞A值差異無統計學意義（P＞0.05），3～9 d尾段細胞A值高于腰段，差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.3.3 總蛋白合成檢測
兩組NPCs總蛋白含量組內各代次間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；尾段各代NPCs總蛋白含量均顯著高于同代腰段NPCs，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
兩組各代NPCs總蛋白含量比較（n=5，mg/mL，2.3.4 衰老相關SA-β-gal染色
光鏡下可見經SA-β-gal染色后，陽性細胞胞質呈藍綠色，染色陰性細胞胞質內不著色；衰老NPCs形態不規則，胞體寬大扁平，質核比例增加，細胞質中可見空泡。見圖 6。兩組內各代次間老化細胞陽性率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；兩組間第1、2、3代比較差異無統計學意義（P＞0.05），腰段第4、5代老化細胞陽性率高于同代尾段細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
兩組各代NPCs老化細胞陽性率比較（n=5，%，3 討論
椎間盤是脊柱椎體的連接部分，由髓核、纖維環和軟骨終板組成。椎間盤退變的確切機制仍未完全明確，但大量相關研究表明NPCs在退變中起到核心作用[11-12]。研究顯示，正常椎間盤NPCs含量僅占髓核組織體積的1%，但它們對平衡椎間盤內包括蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白等基質的合成、表達以及維持新陳代謝等卻起著關鍵作用[13]。因此NPCs生物學特性的研究成為探索細胞移植療法治療椎間盤退變的基礎[14]。
目前關于不同種屬NPCs的體外培養研究較多，但少見不同節段NPCs的相關研究。各節段椎間盤髓核組織所承受的壓力、所含細胞數量及細胞增殖能力不同，致使其退變程度不同。因此為了找到更符合實驗要求的取材部位提取細胞，對各個節段NPCs的生物學特性進行研究具有重要意義。國內有學者對兔不同節段椎間盤來源NPCs的生物學特性進行研究，發現與頸段及胸段NPCs相比，兔腰段椎間盤NPCs活力好、貼壁速率快、蛋白分泌量最高，更適宜作為實驗研究的種子細胞[15]。
由于進化原因，大鼠的脊柱解剖及生物力學比較特殊，尤其是尾椎間盤較少受到應力作用。因此尾椎間盤NPCs能較好地反映椎間盤在增齡方面的變化[16]。本實驗選取大鼠腰椎間盤NPCs以及既往較少應用的尾椎間盤NPCs作為研究對象，觀察比較兩處NPCs活性及生長特性等變化。研究結果表明，大鼠原代尾段NPCs貼壁時間、生長達90%融合時間均顯著少于腰段，傳代后尾段NPCs達90%融合時間仍顯著縮短，說明在培養效率方面尾段NPCs具有明顯優勢。而且單只大鼠尾段椎間盤數量遠多于腰段，獲取的髓核組織量較多，因此將尾椎作為NPCs取材部位具有明顯優勢。
在大鼠尾椎間盤髓核提取的細胞中含有較多體積大、細胞質內含有大量液泡結構的脊索細胞，而腰段極少，這與大鼠胚胎發育過程中脊索在尾椎大量殘留有關；而來源于內胚層的脊索細胞逐漸減少，被來源于中胚層的軟骨樣細胞所替代，可能是細胞衰老、椎間盤退變的重要病理學基礎[17]。有研究表明脊索細胞可通過表達TGF-β1、金屬蛋白酶組織抑制因子、結締組織生長因子等多種因子修復退變椎間盤，并維持椎間盤的自我更新[18]。同時Gantenbein等[19]研究表明，在脊索細胞培養基（notochordal cells conditioned medium，NCCM）的作用下，NPCs中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因表達會明顯增強；馬凱歌等[20]研究顯示，在NCCM作用下，MSCs的增殖能力明顯升高，并誘導MSCs向類髓核樣分化，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因表達明顯上升。上述結果均提示脊索細胞分泌的細胞外基質對于修復退變椎間盤，維持椎間盤的自我更新有重要作用。Yurube等[21]在退變椎間盤動物模型中觀察到脊索細胞大量凋亡，他們認為脊索細胞在青春期時消失即是椎間盤開始退變的標志。
與人類相比，大鼠的生命周期較短，因此相應NPCs的壽命也顯著縮短。NPCs本身增殖潛能有限，會隨著傳代次數增加呈老化趨勢[22]。本實驗結果顯示腰段NPCs進入衰老狀態的細胞量較尾段多，說明腰段NPCs保持穩定活性的時間較短。不同細胞生長狀態對實驗結果有著重要影響，因此實驗中需要根據不同要求對不同節段及代次的NPCs實驗時間進行考量，以減少實驗誤差。
綜上述，大鼠尾段NPCs貼壁時間短、增殖速度快、分泌功能旺盛，并具有取材簡便、細胞數量相對較多等優點，可作為理想的實驗種子細胞。但由于大鼠脊柱解剖及生物力學特作為點與人類存在差異，故大鼠NPCs的培養特性尚不足以全面評估人NPCs在椎間盤退變過程中所受全部外部因素的影響。因此，關于人類不同節段正常或退變NPCs的培養特性有待進一步探索。
