引用本文： 肖宏濤, 田社民, 查新建, 魏瑩, 黃紅軍, 李允, 楊煥納, 夏成德, 牛希華. 不同交聯劑對脫細胞牛心包膜生物材料改性的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(10): 1301-1306. doi: 10.7507/1002-1892.20150281 復制
牛心包膜的主要成分是Ⅰ型膠原，經脫細胞處理后具有抗原性小、可降解及生物相容性好等優點，是一種理想的生物支架材料，已廣泛用于硬腦膜、人工心臟瓣膜和人工血管等再生醫學領域研究[1-3]。但牛心包膜極易降解，需經過交聯處理，以提高其力學性能和抗酶解能力[4]。戊二醛是經典交聯劑，但因具有較強細胞毒性限制了其廣泛應用[5]。而1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亞胺[1-ethyl-3-（3-dinethylami-nopropyl）carbodimide，EDC]/N-羥基琥珀酸亞胺（N-hydroxysuccininide，NHS）和京尼平細胞毒性低、生物相容性好，因此被認為是理想的交聯劑[6-7]。但目前對于EDC/NHS及京尼平交聯脫細胞牛心包膜的效果比較研究較少，哪個交聯劑效果更佳尚無定論[8-9]。為此，我們進行了相關研究，通過比較交聯后牛心包膜的交聯度、力學性能、抗酶解能力和細胞毒性等指標，分析EDC/NHS及京尼平的交聯效果，為選擇最佳交聯劑提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及試劑、儀器
牛心包膜取自市售健康成年黃牛。人成纖維細胞（美國ATCC細胞庫）。京尼平、EDC、NHS（北京百靈威科技有限公司）；異丙醇、茚三酮（上海國藥集團化學試劑有限公司）；蛋白酶K（北京雷根生物技術有限公司）。氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市環宇科學儀器廠）；數顯測厚儀（上海川陸量具有限公司）；AG-I50AUTOGRAPH材料力學試驗機（島津公司，日本）；204F1型熱變性分析儀（Netzsch公司，德國）；紫外可見分光光度計（Thermo公司，美國）；酶標儀（Bio-Rad公司，美國）；EVO MA 10/LS蔡司多功能掃描電鏡（Zeiss公司，德國）。
1.2 脫細胞牛心包膜制備
采用高/低滲溶液法[10]制備脫細胞牛心包膜。取牛心包膜，刮除脂肪，加入超純水反復清洗至表面無血色。按1∶8（W/V）比例加入異丙醇，室溫下以100 r/min振蕩脫脂18 h后，更換異丙醇再振蕩脫脂6 h。棄去異丙醇，加入超純水，室溫下以100 r/ min振蕩清洗3次，每次10 min。按1∶10（W/ V）比例加入1 mol/L NaOH溶液，室溫靜置1 h后更換超純水，以100 r/min振蕩清洗8次，每次10 min。更換為1 mol/L NaOH溶液，室溫下以100 r/min振蕩6 h。經超純水充分清洗后，即獲得脫細胞牛心包膜，4℃冷藏備用。取脫細胞前后樣品置于10%甲醛中固定，石蠟包埋，切片，片厚4～6 mm，HE染色。光鏡下觀察示，與正常牛心包膜相比，脫細胞牛心包膜基質上無殘留細胞，脫細胞徹底（圖 1）。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為4組，分別為EDC/NHS組、京尼平組、脫細胞組及空白對照組。EDC/NHS組：參照文獻[11-14]方法，用pH5.5的PBS配制交聯液，EDC和NHS濃度分別為0.1 mol/L和0.02 mol/L，牛心包膜與交聯液以8∶1（W/V）比例混合；于20℃，以400 r/min震蕩交聯16 h；然后震蕩清洗8次，每次10 min。京尼平組：參照文獻[15-17]方法，用pH 7.4的PBS配制交聯液，京尼平濃度為0.625%，牛心包膜與交聯液以8∶1（W/V）比例混合；于37℃，以400 r/min震蕩交聯72 h；然后振蕩清洗8次，每次10 min。脫細胞組：單純脫細胞牛心包膜。空白對照組：正常牛心包膜。
1.4 檢測指標
1.4.1 掃描電鏡觀察
取各組樣品裁剪成4 mm× 4 mm×2 mm大小，真空噴金，掃描電鏡下觀察表面結構和孔徑變化。
1.4.2 牛心包膜厚度測量
各組取1個樣品，用數顯測厚儀隨機測量10個點厚度，取均值。
1.4.3 交聯度測定
取兩交膠組及脫細胞組樣品0.02 g，分別置于1 mg/mL茚三酮溶液，100℃水浴15 min后，用紫外可見分光光度計于440 nm處測定吸光度（A）值，用牛血清白蛋白作標準曲線，按照公式計算交聯度。交聯度（%）=（交聯前組織中自由氨基酸含量-交聯后組織中自由氨基酸含量）/交聯前組織中自由氨基酸含量×100%；交聯前組織為脫細胞組樣品。實驗重復3次。
1.4.4 變性溫度測定
取各組樣品5 mg，用204F1型熱變性分析儀測量差示掃描量熱（differential scan ning calorimetry，DSC），以樣品吸熱或放熱速率 （即熱流率）為縱坐標，以溫度或時間為橫坐標，繪制DSC曲線，分析樣品變性溫度。升溫范圍為20～160℃，升溫速率為10℃/min。實驗重復3 次。
1.4.5 體外降解觀察
無菌條件下，各組取10 mg樣品，置于濃度為100 μg/mL的蛋白酶K中，于58℃反應48 h，觀察降解情況。分別于2、4、8、12、24、35、48 h取出樣品烘干后稱重，計算樣品降解率；降解率（%）=（總質量－降解后質量）/總質量×100%。實驗重復3次。
1.4.6 力學性能測試
根據國家標準GB/T528-2009，各組取3個樣品制作成4 cm×1 cm的啞鈴狀，用材料力學試驗機固定樣品兩端，以10 mm/ min速度拉伸，測算斷裂應力、斷裂伸長率和彈性模量[18]。
1.4.7 細胞毒性實驗
根據國家標準GB/T16886.5，采用MTT比色法檢測材料細胞毒性。各組取樣品0.2 g，加入2 mL含10%FBS的DMEM培養基，37℃浸提72 h，收集浸提液，過濾除菌備用。將密度為1×104個/mL的人成纖維細胞接種于96孔板，培養24 h后將培養液更換成浸提液繼續培養。分別于3 d和5 d各取8孔加入MTT，用酶標儀在570 nm處測定A值，計算細胞增殖率，并根據細胞增殖率評價材料細胞毒性[18]。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩交聯組交聯度比較采用獨立樣本t檢驗；其余各指標組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 掃描電鏡觀察
空白對照組及脫細胞組膠原纖維完好，排列緊密有序。經京尼平交聯后牛心包膜呈深藍色，EDC/NHS交聯后顏色無改變，兩交聯組膠原纖維結構較前者更緊密有序，呈相互連接、平行排列的多孔網狀結構，孔徑為10～20 μm。見圖 2。
圖1
脫細胞前后牛心包膜組織學觀察（HE×10） ? 脫細胞前 ? 脫細胞后 ? ?2.2 牛心包膜厚度測量
脫細胞組牛心包膜厚度為（0.74±0.07）mm，較空白對照組（0.64±0.07）mm增加，但比較差異無統計學意義（P＞0.05）。EDC/NHS組及京尼平組厚度分別為（1.19±0.084）mm和（1.25±0.097）mm，均較脫細胞組顯著增加，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；但EDC/NHS組及京尼平組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.3 交聯度及變性溫度測定
EDC/NHS組交聯度為81.76%±2.58%，京尼平組為84.03%±2.61%，兩組比較差異無統計學意義（t=0.205，P=0.218）。
EDC/NHS組及京尼平組變性溫度分別為（67.69±3.60）、（70.32±5.77） ℃，明顯高于脫細胞組（58.22±3.52） ℃和空白對照組（53.67±3.48） ℃，比較差異有統計學意義（P＜0.05）； EDC/NHS組及京尼平組間差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 體外降解觀察
與兩交聯組相比，空白對照組和脫細胞組材料體外降解快，8 h時即基本降解完成；而EDC/NHS組和京尼平組48 h時仍未完全降解。各時間點兩交聯組降解率均顯著低于空白對照組及脫細胞組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；EDC/NHS組及京尼平組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 3。
2.5 力學性能測試
脫細胞組材料斷裂應力、斷裂伸長率和彈性模量均較空白對照組增加，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。兩交聯組彈性模量和斷裂應力均較脫細胞組顯著下降（P＜0.05），且接近空白對照組（P＞0.05）；兩交聯組間差異無統計學意義（P＞0.05）。兩交聯組斷裂伸長率較空白對照組和脫細胞組均顯著增加，比較差異有統計學意義（P＜0.05），而兩交聯組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 4。
2.6 細胞毒性實驗
培養3 d時，4組細胞毒性均為1級。其中EDC/NHS組、京尼平組和空白對照組細胞增殖率與脫細胞組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；EDC/NHS組及京尼平組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。培養5 d時，脫細胞組及EDC/NHS組細胞毒性達2級，但京尼平組和空白對照組仍為1級。其中，EDC/NHS組細胞增殖率與京尼平組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩交聯組與空白對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組細胞毒性實驗結果比較（n=8）
Table1.
Results of cytotoxicity test of each group（n=8）
3 討論
本研究采用高/低滲溶液法[10]制備脫細胞牛心包膜，經HE染色觀察牛心包膜中的細胞成分徹底除去，提示牛心包膜已失去免疫原性。經掃描電鏡觀察牛心包膜基本的組織結構和超微結構均無明顯改變。經比較，牛心包膜脫細胞處理后厚度略增加，其原因可能是脫細胞去除了纖維間隙中非極性的脂質成分，使纖維之間距離增加[11, 19]。
牛心包膜極易降解，需要經過交聯以提高其力學性能和抗酶解能力[20-21]。常見的化學交聯劑有醛類（如甲醛、戊二醛）、碳化二亞胺類、環氧化物類以及氰異酸鹽等[22]。其中，戊二醛是常用交聯劑，但存在降低膠原支架生物相容性和易導致生物材料鈣化等缺點[5, 15-16]，限制了其臨床應用。碳化二亞胺類，特別是EDC，通過促使天冬氨酸、谷氨酸殘基上的羧基與賴氨酸殘基的氨基形成酰胺基團，從而使膠原發生交聯，然后再由NHS形成更穩定的酯來增強EDC交聯產物的穩定性，研究表明EDC/NHS交聯生物材料效果優于戊二醛[16-17]。京尼平是從梔子中提取的一種環烯醚萜類化合物，屬于天然生物交聯劑[7, 9]。它可與生物組織中賴氨酸、羥賴氨酸及精氨酸等殘基的自由氨基反應，使膠原纖維形成分子內或分子間的環狀交聯，并形成一種藍黑色物質。近年來，國內外學者圍繞京尼平的交聯效率、細胞毒性、抗酶解能力和力學性能等方面開展了大量研究[23]，但有關EDC/NHS和京尼平交聯效果的對比研究較少。
交聯前后比較顯示，交聯后脫細胞牛心包膜厚度增加，其原因可能是交聯劑使膠原分子之間形成分子內和分子間交聯，拉近了膠原分子之間的距離，組織收縮導致厚度增加。交聯度代表組織與交聯劑反應的程度，采用茚三酮法測定交聯前后組織中自由氨基的含量，結果顯示，EDC/NHS和京尼平對脫細胞牛心包膜的交聯度分別為81.76%±2.58%和84.03%±2.61%，兩者交聯效果相當且交聯效果理想。田聰等[18]比較了京尼平和戊二醛對脫細胞牛心包膜支架材料改性后的影響，結果顯示京尼平和戊二醛交聯脫細胞牛心包膜的交聯指數均高達90%，本研究京尼平組交聯度結果較其降低，分析原因可能與京尼平生產廠家不同，純度不同所致。
蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，具有降解天然蛋白質的能力。蛋白酶K的一般工作濃度是50～100 μg/mL，在pH4.0～12.5范圍內均有活性，理想孵育溫度為58℃，理想孵育時間為2 h[14]。本研究采用的蛋白酶K濃度為100 μg/ mL，溫度58℃。體外酶解結果顯示，脫細胞牛心包膜交聯后體外酶解速度明顯降低，EDC/NHS組和京尼平組48 h時仍未降解完全，而空白對照組和脫細胞組已完全降解。分析原因是交聯作用使酶無法和膠原分子充分接觸，酶的分解只能在有限接觸的膠原分子上進行，因此降解率下降。交聯后組織的斷裂應力、斷裂伸長率和彈性模量均較未交聯的脫細胞組增加，且彈性模量和斷裂應力接近空白對照組。盡管EDC/NHS和京尼平交聯的原理不同，但兩者交聯后材料力學性能差異無統計學意義。細胞毒性是衡量材料組織相容性的重要指標。交聯劑的細胞毒性越低，交聯后材料的生物相容性就越好，植入宿主體內所引發的炎性反應就越小，越有利于組織的修復和再生。本研究結果顯示，京尼平交聯的材料細胞毒性為1級，EDC/NHS交聯的材料細胞毒性為1～2 級，略高于京尼平。
綜上述，EDC/NHS和京尼平交聯的脫細胞牛心包膜均具有交聯度和穩定性高、力學性能良好的優點，二者相比無顯著差異。但EDC/NHS交聯的材料細胞毒性略高于京尼平，提示京尼平是一種較理想的交聯劑。
牛心包膜的主要成分是Ⅰ型膠原，經脫細胞處理后具有抗原性小、可降解及生物相容性好等優點，是一種理想的生物支架材料，已廣泛用于硬腦膜、人工心臟瓣膜和人工血管等再生醫學領域研究[1-3]。但牛心包膜極易降解，需經過交聯處理，以提高其力學性能和抗酶解能力[4]。戊二醛是經典交聯劑，但因具有較強細胞毒性限制了其廣泛應用[5]。而1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亞胺[1-ethyl-3-（3-dinethylami-nopropyl）carbodimide，EDC]/N-羥基琥珀酸亞胺（N-hydroxysuccininide，NHS）和京尼平細胞毒性低、生物相容性好，因此被認為是理想的交聯劑[6-7]。但目前對于EDC/NHS及京尼平交聯脫細胞牛心包膜的效果比較研究較少，哪個交聯劑效果更佳尚無定論[8-9]。為此，我們進行了相關研究，通過比較交聯后牛心包膜的交聯度、力學性能、抗酶解能力和細胞毒性等指標，分析EDC/NHS及京尼平的交聯效果，為選擇最佳交聯劑提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及試劑、儀器
牛心包膜取自市售健康成年黃牛。人成纖維細胞（美國ATCC細胞庫）。京尼平、EDC、NHS（北京百靈威科技有限公司）；異丙醇、茚三酮（上海國藥集團化學試劑有限公司）；蛋白酶K（北京雷根生物技術有限公司）。氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市環宇科學儀器廠）；數顯測厚儀（上海川陸量具有限公司）；AG-I50AUTOGRAPH材料力學試驗機（島津公司，日本）；204F1型熱變性分析儀（Netzsch公司，德國）；紫外可見分光光度計（Thermo公司，美國）；酶標儀（Bio-Rad公司，美國）；EVO MA 10/LS蔡司多功能掃描電鏡（Zeiss公司，德國）。
1.2 脫細胞牛心包膜制備
采用高/低滲溶液法[10]制備脫細胞牛心包膜。取牛心包膜，刮除脂肪，加入超純水反復清洗至表面無血色。按1∶8（W/V）比例加入異丙醇，室溫下以100 r/min振蕩脫脂18 h后，更換異丙醇再振蕩脫脂6 h。棄去異丙醇，加入超純水，室溫下以100 r/ min振蕩清洗3次，每次10 min。按1∶10（W/ V）比例加入1 mol/L NaOH溶液，室溫靜置1 h后更換超純水，以100 r/min振蕩清洗8次，每次10 min。更換為1 mol/L NaOH溶液，室溫下以100 r/min振蕩6 h。經超純水充分清洗后，即獲得脫細胞牛心包膜，4℃冷藏備用。取脫細胞前后樣品置于10%甲醛中固定，石蠟包埋，切片，片厚4～6 mm，HE染色。光鏡下觀察示，與正常牛心包膜相比，脫細胞牛心包膜基質上無殘留細胞，脫細胞徹底（圖 1）。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為4組，分別為EDC/NHS組、京尼平組、脫細胞組及空白對照組。EDC/NHS組：參照文獻[11-14]方法，用pH5.5的PBS配制交聯液，EDC和NHS濃度分別為0.1 mol/L和0.02 mol/L，牛心包膜與交聯液以8∶1（W/V）比例混合；于20℃，以400 r/min震蕩交聯16 h；然后震蕩清洗8次，每次10 min。京尼平組：參照文獻[15-17]方法，用pH 7.4的PBS配制交聯液，京尼平濃度為0.625%，牛心包膜與交聯液以8∶1（W/V）比例混合；于37℃，以400 r/min震蕩交聯72 h；然后振蕩清洗8次，每次10 min。脫細胞組：單純脫細胞牛心包膜。空白對照組：正常牛心包膜。
1.4 檢測指標
1.4.1 掃描電鏡觀察
取各組樣品裁剪成4 mm× 4 mm×2 mm大小，真空噴金，掃描電鏡下觀察表面結構和孔徑變化。
1.4.2 牛心包膜厚度測量
各組取1個樣品，用數顯測厚儀隨機測量10個點厚度，取均值。
1.4.3 交聯度測定
取兩交膠組及脫細胞組樣品0.02 g，分別置于1 mg/mL茚三酮溶液，100℃水浴15 min后，用紫外可見分光光度計于440 nm處測定吸光度（A）值，用牛血清白蛋白作標準曲線，按照公式計算交聯度。交聯度（%）=（交聯前組織中自由氨基酸含量-交聯后組織中自由氨基酸含量）/交聯前組織中自由氨基酸含量×100%；交聯前組織為脫細胞組樣品。實驗重復3次。
1.4.4 變性溫度測定
取各組樣品5 mg，用204F1型熱變性分析儀測量差示掃描量熱（differential scan ning calorimetry，DSC），以樣品吸熱或放熱速率 （即熱流率）為縱坐標，以溫度或時間為橫坐標，繪制DSC曲線，分析樣品變性溫度。升溫范圍為20～160℃，升溫速率為10℃/min。實驗重復3 次。
1.4.5 體外降解觀察
無菌條件下，各組取10 mg樣品，置于濃度為100 μg/mL的蛋白酶K中，于58℃反應48 h，觀察降解情況。分別于2、4、8、12、24、35、48 h取出樣品烘干后稱重，計算樣品降解率；降解率（%）=（總質量－降解后質量）/總質量×100%。實驗重復3次。
1.4.6 力學性能測試
根據國家標準GB/T528-2009，各組取3個樣品制作成4 cm×1 cm的啞鈴狀，用材料力學試驗機固定樣品兩端，以10 mm/ min速度拉伸，測算斷裂應力、斷裂伸長率和彈性模量[18]。
1.4.7 細胞毒性實驗
根據國家標準GB/T16886.5，采用MTT比色法檢測材料細胞毒性。各組取樣品0.2 g，加入2 mL含10%FBS的DMEM培養基，37℃浸提72 h，收集浸提液，過濾除菌備用。將密度為1×104個/mL的人成纖維細胞接種于96孔板，培養24 h后將培養液更換成浸提液繼續培養。分別于3 d和5 d各取8孔加入MTT，用酶標儀在570 nm處測定A值，計算細胞增殖率，并根據細胞增殖率評價材料細胞毒性[18]。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩交聯組交聯度比較采用獨立樣本t檢驗；其余各指標組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 掃描電鏡觀察
空白對照組及脫細胞組膠原纖維完好，排列緊密有序。經京尼平交聯后牛心包膜呈深藍色，EDC/NHS交聯后顏色無改變，兩交聯組膠原纖維結構較前者更緊密有序，呈相互連接、平行排列的多孔網狀結構，孔徑為10～20 μm。見圖 2。
圖1
脫細胞前后牛心包膜組織學觀察（HE×10） ? 脫細胞前 ? 脫細胞后 ? ?2.2 牛心包膜厚度測量
脫細胞組牛心包膜厚度為（0.74±0.07）mm，較空白對照組（0.64±0.07）mm增加，但比較差異無統計學意義（P＞0.05）。EDC/NHS組及京尼平組厚度分別為（1.19±0.084）mm和（1.25±0.097）mm，均較脫細胞組顯著增加，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；但EDC/NHS組及京尼平組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.3 交聯度及變性溫度測定
EDC/NHS組交聯度為81.76%±2.58%，京尼平組為84.03%±2.61%，兩組比較差異無統計學意義（t=0.205，P=0.218）。
EDC/NHS組及京尼平組變性溫度分別為（67.69±3.60）、（70.32±5.77） ℃，明顯高于脫細胞組（58.22±3.52） ℃和空白對照組（53.67±3.48） ℃，比較差異有統計學意義（P＜0.05）； EDC/NHS組及京尼平組間差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 體外降解觀察
與兩交聯組相比，空白對照組和脫細胞組材料體外降解快，8 h時即基本降解完成；而EDC/NHS組和京尼平組48 h時仍未完全降解。各時間點兩交聯組降解率均顯著低于空白對照組及脫細胞組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；EDC/NHS組及京尼平組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 3。
2.5 力學性能測試
脫細胞組材料斷裂應力、斷裂伸長率和彈性模量均較空白對照組增加，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。兩交聯組彈性模量和斷裂應力均較脫細胞組顯著下降（P＜0.05），且接近空白對照組（P＞0.05）；兩交聯組間差異無統計學意義（P＞0.05）。兩交聯組斷裂伸長率較空白對照組和脫細胞組均顯著增加，比較差異有統計學意義（P＜0.05），而兩交聯組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 4。
2.6 細胞毒性實驗
培養3 d時，4組細胞毒性均為1級。其中EDC/NHS組、京尼平組和空白對照組細胞增殖率與脫細胞組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；EDC/NHS組及京尼平組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。培養5 d時，脫細胞組及EDC/NHS組細胞毒性達2級，但京尼平組和空白對照組仍為1級。其中，EDC/NHS組細胞增殖率與京尼平組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩交聯組與空白對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組細胞毒性實驗結果比較（n=8）
Table1.
Results of cytotoxicity test of each group（n=8）
3 討論
本研究采用高/低滲溶液法[10]制備脫細胞牛心包膜，經HE染色觀察牛心包膜中的細胞成分徹底除去，提示牛心包膜已失去免疫原性。經掃描電鏡觀察牛心包膜基本的組織結構和超微結構均無明顯改變。經比較，牛心包膜脫細胞處理后厚度略增加，其原因可能是脫細胞去除了纖維間隙中非極性的脂質成分，使纖維之間距離增加[11, 19]。
牛心包膜極易降解，需要經過交聯以提高其力學性能和抗酶解能力[20-21]。常見的化學交聯劑有醛類（如甲醛、戊二醛）、碳化二亞胺類、環氧化物類以及氰異酸鹽等[22]。其中，戊二醛是常用交聯劑，但存在降低膠原支架生物相容性和易導致生物材料鈣化等缺點[5, 15-16]，限制了其臨床應用。碳化二亞胺類，特別是EDC，通過促使天冬氨酸、谷氨酸殘基上的羧基與賴氨酸殘基的氨基形成酰胺基團，從而使膠原發生交聯，然后再由NHS形成更穩定的酯來增強EDC交聯產物的穩定性，研究表明EDC/NHS交聯生物材料效果優于戊二醛[16-17]。京尼平是從梔子中提取的一種環烯醚萜類化合物，屬于天然生物交聯劑[7, 9]。它可與生物組織中賴氨酸、羥賴氨酸及精氨酸等殘基的自由氨基反應，使膠原纖維形成分子內或分子間的環狀交聯，并形成一種藍黑色物質。近年來，國內外學者圍繞京尼平的交聯效率、細胞毒性、抗酶解能力和力學性能等方面開展了大量研究[23]，但有關EDC/NHS和京尼平交聯效果的對比研究較少。
交聯前后比較顯示，交聯后脫細胞牛心包膜厚度增加，其原因可能是交聯劑使膠原分子之間形成分子內和分子間交聯，拉近了膠原分子之間的距離，組織收縮導致厚度增加。交聯度代表組織與交聯劑反應的程度，采用茚三酮法測定交聯前后組織中自由氨基的含量，結果顯示，EDC/NHS和京尼平對脫細胞牛心包膜的交聯度分別為81.76%±2.58%和84.03%±2.61%，兩者交聯效果相當且交聯效果理想。田聰等[18]比較了京尼平和戊二醛對脫細胞牛心包膜支架材料改性后的影響，結果顯示京尼平和戊二醛交聯脫細胞牛心包膜的交聯指數均高達90%，本研究京尼平組交聯度結果較其降低，分析原因可能與京尼平生產廠家不同，純度不同所致。
蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，具有降解天然蛋白質的能力。蛋白酶K的一般工作濃度是50～100 μg/mL，在pH4.0～12.5范圍內均有活性，理想孵育溫度為58℃，理想孵育時間為2 h[14]。本研究采用的蛋白酶K濃度為100 μg/ mL，溫度58℃。體外酶解結果顯示，脫細胞牛心包膜交聯后體外酶解速度明顯降低，EDC/NHS組和京尼平組48 h時仍未降解完全，而空白對照組和脫細胞組已完全降解。分析原因是交聯作用使酶無法和膠原分子充分接觸，酶的分解只能在有限接觸的膠原分子上進行，因此降解率下降。交聯后組織的斷裂應力、斷裂伸長率和彈性模量均較未交聯的脫細胞組增加，且彈性模量和斷裂應力接近空白對照組。盡管EDC/NHS和京尼平交聯的原理不同，但兩者交聯后材料力學性能差異無統計學意義。細胞毒性是衡量材料組織相容性的重要指標。交聯劑的細胞毒性越低，交聯后材料的生物相容性就越好，植入宿主體內所引發的炎性反應就越小，越有利于組織的修復和再生。本研究結果顯示，京尼平交聯的材料細胞毒性為1級，EDC/NHS交聯的材料細胞毒性為1～2 級，略高于京尼平。
綜上述，EDC/NHS和京尼平交聯的脫細胞牛心包膜均具有交聯度和穩定性高、力學性能良好的優點，二者相比無顯著差異。但EDC/NHS交聯的材料細胞毒性略高于京尼平，提示京尼平是一種較理想的交聯劑。
