轉移生長因子-β1(TGF-β1)/Smad3信號轉導通路與人類的多種生理病理發生機制相關,但是該信號通路中Smad3被磷酸化的時空信息仍然不完全清楚。為了動態觀察活細胞生理狀態下Smad3被磷酸化的過程,首先進行ECFP-Smad3-Citrine(Smad3 biosensor)融合蛋白表達載體的構建及鑒定;然后轉染293T細胞并觀察轉染效率和融合蛋白表達情況。在熒光顯微鏡下,應用MetaFlour FRET 4.6軟件測量TGF-β1刺激293T細胞前后Smad3 biosensor的熒光能量共振轉移(FRET)的變化情況。結果顯示,Smad3 biosensor轉染效率達40%,融合蛋白表達成功。TGF-β1刺激293T細胞10 min后,監測到胞質內FRET值逐漸減小,青色熒光蛋白(CFP)減弱,黃色熒光蛋白變體(Citrine)增強,歷時約300 s后逐漸恢復。應用FRET技術能使我們在活細胞生理狀態下,實時動態監測TGF-β1/Smad3信號轉導通路的過程。
引用本文： 曹薇薇, 劉偉, 王維山, 陳召, 何仁豪, 何建偉. 利用熒光共振能量轉移技術研究TGF-β/Smad3信號轉導通路. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(5): 1080-1084. doi: 10.7507/1001-5515.20140203 復制
引言
轉移生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是多肽轉移生長因子大家族成員之一。在大多數細胞中，TGF-β1與胞膜受體結合后是通過Smad蛋白介導將胞外信號傳遞到胞質和細胞核中，從而調控著細胞的增殖、分化和細胞凋亡等許多生理和病理過程[1] 。Smad蛋白被分為三類，即受體調節Smads (receptor-regulated Smads,R-Smads)，它可與通用Smads (common-partner Smad，Co-Smad)結合成復合物，第三類Smads是抑制型Smads (inhibitory Smads，I-Smads)[2]。
R-Smads包括了Smad1、Smad2和Smad3，它們具有相似的蛋白結構和功能，均有3個功能域，即MH1區、MH2區和Linker區。當有配體(如TGF-β1)存在時，C端的MH2區含有的保守磷酸化位點SSXS基序可被TGF-β1受體I磷酸化，然后與Smad4結合為二聚體轉位入核[3]。N端的MH1結構域在細胞核中與轉錄輔激活蛋白或輔阻遏物相互作用，結合下游的靶基因，調節基因轉錄[4]。既往研究證實，MH1區和MH2區在Smad3未被活化時相互抑制，磷酸化后構象發生變化，抑制作用解除。Smad3是通過磷酸化前后的構象變化來傳遞TGF-β1信號的，即通過Smad3空間結構變構將Smad 3與受體的作用轉化為Smad3與細胞核的互相作用[5]。但是TGF-β1受體與Smad3相互作用的機制仍然不完全清楚，如：TGF-β1與受體結合后，多長時間、在什么位置Smad3被磷酸化產生空間變構效應？本實驗研究了這一問題。
本研究利用熒光能量共振轉移(flurorescence resonance energy transfer,FRET)技術這一目前研究活體細胞內信號轉導通路最可靠的方法，對TGF-β1/Smad3信號轉導通路作進一步的探討，以期在活細胞生理條件下明確TGF-β1/Smad3信號傳遞過程的時空信息。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 質粒、菌株和細胞
CKAR生物傳感器載體質粒和Smad3-pcDNA3.1載體質粒由美國約翰霍普金斯大學萬梅教授惠贈；FT-T Fast Ligation Kit購自上海依科賽生物制品有限公司；大腸桿菌菌株DH5α、人胚腎上皮293T細胞均由本室保存。
1.1.2 試劑
細胞轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；DNA回收試劑盒、質粒小量制備試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；反轉錄試劑盒、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、核酸分子量Marker等購自Takara公司；無內毒素質粒大提試劑盒購自TianGen生物科技有限公司；細胞培養試劑(DMEM、胎牛血清)為Gibco公司產品；其他試劑為國產分析純級。
1.1.3 熒光成像系統
Zeiss Axiovert 200 M 倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)，配備青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)(BP 436/25,FT455,BP480/40)、黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP) (BP 500/25,FT515,BP535/30)、CFP-YFP-FRET(BP 436/25,FT455,BP535/30)濾光片，MetaFlour軟件。
1.2 ECFP-Smad3-Citrine融合蛋白表達載體的構建及表達鑒定
依據NCBI數據庫中Smad3 mRNA基因序列，用Primer Premier 5.0 軟件設計引物。引入合適的酶切位點和保護堿基備用，下劃線處分別為Sph Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位點。并委托上海生工生物技術公司合成：
P1 5′-ACAT
P2 5′-C
以CKAR生物傳感器載體質粒為起點，通用質粒FT-T為中間載體，依次獲得了多個中間重組子，最后獲得目的重組質粒Smad3-Biosensor(ECFP-Smad3-Citrine-pcDNA3′)。經PCR鑒定、雙酶切鑒定和測序結果均表明成功構建Smad3 Biosensor(見圖 1、2)。
圖1
構建Smad3生物傳感器載體PCR鑒定結果
1：Smad3生物傳感器質粒PCR結果；M：DNA marker Ⅲ標準分子量
Figure1. Identification of constructed Smad3 biosensor vector by PCR1: Smad3 biosensor vector PCR production by electrophoresis; M: DNA marker,marker Ⅲ
圖2
構建Smad3生物傳感器載體雙酶切鑒定結果
1：Smad3生物傳感器載體
1: Smad3 biosensor vector by double restriction enzymes digestion with
1.3 細胞培養和轉染
293T細胞用含10% FBS的DMEM培養基，在37 ℃、 5% CO2培養箱中培養。轉染前1 d，細胞用0.05%胰蛋白酶消化，鋪入Petri皿中，密度為2×104 個/皿。待細胞生長融合至50%～70%時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒操作說明，轉染3 μg Smad3 Biosensor載體質粒,7 μL Lip2000，轉染24 h后，用Zeiss Axiovert 200 M倒置熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達情況。
1.4 熒光成像及FRET檢測
1.4.1 校正因子計算
在Zeiss Axiovert 200 M倒置熒光顯微鏡上，采用1 000倍油鏡。分別選取CFP、YFP、FRET三個濾光片作為供體、受體、FRET三個通道的濾光片。分別用單獨轉染并表達pCFP和pEYFP的細胞來檢測并計算供體的校正因子(correction factor)A和B，MetaFlour FRET軟件計算供體及受體串色常數，得到校正后的FRET。
1.4.2 FRET檢測
將濾光片轉到CFP通道，鏡下確定視野，選定待測細胞，將濾光片轉到FRET通道，拍照獲取單張細胞圖片。對待測細胞圈定幾個感興趣區域(region of interest，ROI)，同時選定1個無細胞的背景區域，用以扣除背景信號。設置實時觀察時間60 min，每間隔1 min采圖一次，共60張。連續采集CFP、YFP和FRET三個通道的圖片；將前面計算出的供體校正因子A和受體校正因子B輸入MetaFlour FRET 4.6軟件自帶公式，運用校正的方法計算出Corrected FRET，并用偽彩標記FRET圖像(pseudoecolored FRET image)顯示FRET效率。確認CFP、YFP、YFP/CFP Ratio三條基線處于平穩狀態后，加入終濃度為1.25 ng/mL的TGF-β1，動態觀察FRET變化。
2 結果
2.1 Smad3 biosensor的表達、FRET值檢測及計算
在488 nm激光激發轉染Smad3 biosensor的293T細胞，用515 nm的綠色熒光蛋白通道觀察發現：細胞可發出較強的綠色熒光，整體細胞轉染率達到40%(見圖 3)。除了能在CFP通道和YFP通道看到均勻分布的青色和黃色熒光外，還可以在FRET通道看到明顯的黃色熒光即FRET現象(見圖 4)。并且用偽彩標記的RRET圖像也顯示有較高的FRET值(數據未顯示)。
圖3
Smad3 biosensor在細胞中的表達情況
Figure3.
Smad3 biosensor fusion protein expression in 293T cells
圖4
Smad3 biosensor在293T細胞中的FRET圖像
Figure4.
FRET image of Smad3 biosensor fusion protein expression in 293T cells
2.2 TGF-β1誘導Smad3融合蛋白的動力學研究
為了能在293T細胞中實時動態觀察到TGF-β1誘導的Smad3被激活的生理過程，我們將293T細胞轉染了Smad3 biosensor質粒，表達24 h后，觀察TGF-β1誘導處理前后，Smad3融合蛋白的FRET現象的變化情況。細胞分為對照組(n=3)和實驗組(n=3)，對照組加入PBS液，實驗組加入TGF-β1液(濃度1.25 ng/mL)。結果顯示：對照組在實驗記錄時間內，YFP和CFP的熒光強度沒有任何變化；實驗組(見圖 5、6)中，經過TGF-β1處理后，可以看到前10 min左右CFP、Citrine的熒光強度沒有變化，這段無反應期之后，出現了CFP熒光強度明顯增強而Citrine的熒光強度明顯減弱的現象，Citrine/CFP的強度也明顯減弱，變化持續時間約300 s，之后600 s Citrine/CFP的強度逐漸恢復。用PBS沖洗，30 min后，重復上述實驗有時還可以出現上述FRET改變的現象。綜上所述，基于FRET原理，通過定量分析對照組和實驗組的Citrine和CFP熒光強度隨時間變化的比率，證實Smad3蛋白在TGF-β1誘導下被激活并發生了空間構象的改變，歷時約300 s，而293T細胞在TGF-β1誘導下TGF-β1/Smad3信號轉導有一定滯后時間，約10 min。
圖5
TGF-β1與293T細胞共孵育前后15 min三個通道的熒光圖像和偽彩FRET圖像
上排：加入TGF-
Upper line: before adding TGF-
圖6
用計算機分析轉染Smad3 biosensor 的293T細胞在TGF-β1刺激下的FRET現象
Figure6.
Computerized analysis of FRET in a single 293T cell transfected with Smad3 biosensor after incubation with the ligand of TGF-β1
3 討論
FRET現象是指當兩個熒光基團足夠近時(通常在10 nm以內)，激發供體熒光基團，能量將轉移到受體熒光基團，使受體發射出熒光，FRET現象是一個距離依賴性的物理過程，其效率與供體和受體熒光基團之間距離的六次方成反比。由于其能量傳遞與供受體之間的距離的高度依賴性，使得人們可以利用FRET現象來分析兩個分子間的相互作用或者同一分子間構象的變化[6]。根據這一原理，將目標蛋白與熒光蛋白融合表達，運用FRET技術在活細胞中可用于可視化檢測細胞內信號轉導機制的研究[7]。CFP和YFP是最常用的一對用于FRET研究的熒光基團。但是YFP易于受到細胞中酸堿度和氯離子的影響，有學者將YFP置換為更穩定的黃色熒光蛋白變體--Citrine，從而大大提高了FRET的效率[8]。本實驗所用的一對熒光蛋白就是CFP和Citrine，在Zeiss Axiovert 200 M倒置熒光顯微鏡下觀察到了FRET現象，說明Smad3 biosensor融合蛋白表達成功，熒光蛋白產生的FRET的效率較高。
本實驗TGF-β1與293T細胞共孵育10 min后，Smad3的融合蛋白的FRET現象才發生改變，這一段無反應時間是什么因素造成的，或者說TGF-β1/Smad3信號轉導通路的限速反應步驟是什么，這是一個值得研究的問題。既往研究證實，TGF-β1能與細胞表面密布的TGF-β1受體迅速結合，親和力很強，信號轉導速度應該很快[9]。有研究也證實，Smad3在胞質中彌散速度很快，能很快接受TGF-β1受體磷酸化[10]。我們考慮以下步驟可以影響TGF-β1/Smad3信號轉導通路的反應速度，如TGF-β1與受體結合后TGF-β1受體入胞作用的速度[11]，還有Smad3被TGF-β1受體磷酸化后脫落的速度也會影響到其他Smad3繼續被TGF-β1受體磷酸化的速度。上述因素均可延遲TGF-β1/Smad3信號轉導通路的反應時間。
Smad3被磷酸化后，其MH2區產生了空間結構改變，與MH1區像雙臂一樣打開，使得Smad3融合蛋白兩端的CFP和Citrine熒光蛋白的FRET效率減低，FRET變化過程提示，上述Smad3被磷酸化并產生變構的過程歷時約300 s。從區域上看，靠近胞膜的胞質中產生FRET現象較明顯，提示了反應的位置。FRET現象產生變化的時間反映了細胞內Smad3被磷酸化的過程，使我們在時間和空間二維層次上認識了TGF-β1/Smad3信號轉導通路在活細胞中的傳遞過程。
最近有研究表明，Smad3蛋白的基因突變和缺失與乳腺癌[12]和胃癌[13]有關。我們相信本實驗中的Smad3 biosensor將能作為一種抗腫瘤藥物的高通量篩選工具和藥效評價工具，為腫瘤臨床的分子靶向治療提供可靠理論依據。
引言
轉移生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是多肽轉移生長因子大家族成員之一。在大多數細胞中，TGF-β1與胞膜受體結合后是通過Smad蛋白介導將胞外信號傳遞到胞質和細胞核中，從而調控著細胞的增殖、分化和細胞凋亡等許多生理和病理過程[1] 。Smad蛋白被分為三類，即受體調節Smads (receptor-regulated Smads,R-Smads)，它可與通用Smads (common-partner Smad，Co-Smad)結合成復合物，第三類Smads是抑制型Smads (inhibitory Smads，I-Smads)[2]。
R-Smads包括了Smad1、Smad2和Smad3，它們具有相似的蛋白結構和功能，均有3個功能域，即MH1區、MH2區和Linker區。當有配體(如TGF-β1)存在時，C端的MH2區含有的保守磷酸化位點SSXS基序可被TGF-β1受體I磷酸化，然后與Smad4結合為二聚體轉位入核[3]。N端的MH1結構域在細胞核中與轉錄輔激活蛋白或輔阻遏物相互作用，結合下游的靶基因，調節基因轉錄[4]。既往研究證實，MH1區和MH2區在Smad3未被活化時相互抑制，磷酸化后構象發生變化，抑制作用解除。Smad3是通過磷酸化前后的構象變化來傳遞TGF-β1信號的，即通過Smad3空間結構變構將Smad 3與受體的作用轉化為Smad3與細胞核的互相作用[5]。但是TGF-β1受體與Smad3相互作用的機制仍然不完全清楚，如：TGF-β1與受體結合后，多長時間、在什么位置Smad3被磷酸化產生空間變構效應？本實驗研究了這一問題。
本研究利用熒光能量共振轉移(flurorescence resonance energy transfer,FRET)技術這一目前研究活體細胞內信號轉導通路最可靠的方法，對TGF-β1/Smad3信號轉導通路作進一步的探討，以期在活細胞生理條件下明確TGF-β1/Smad3信號傳遞過程的時空信息。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 質粒、菌株和細胞
CKAR生物傳感器載體質粒和Smad3-pcDNA3.1載體質粒由美國約翰霍普金斯大學萬梅教授惠贈；FT-T Fast Ligation Kit購自上海依科賽生物制品有限公司；大腸桿菌菌株DH5α、人胚腎上皮293T細胞均由本室保存。
1.1.2 試劑
細胞轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；DNA回收試劑盒、質粒小量制備試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；反轉錄試劑盒、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、核酸分子量Marker等購自Takara公司；無內毒素質粒大提試劑盒購自TianGen生物科技有限公司；細胞培養試劑(DMEM、胎牛血清)為Gibco公司產品；其他試劑為國產分析純級。
1.1.3 熒光成像系統
Zeiss Axiovert 200 M 倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)，配備青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)(BP 436/25,FT455,BP480/40)、黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP) (BP 500/25,FT515,BP535/30)、CFP-YFP-FRET(BP 436/25,FT455,BP535/30)濾光片，MetaFlour軟件。
1.2 ECFP-Smad3-Citrine融合蛋白表達載體的構建及表達鑒定
依據NCBI數據庫中Smad3 mRNA基因序列，用Primer Premier 5.0 軟件設計引物。引入合適的酶切位點和保護堿基備用，下劃線處分別為Sph Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位點。并委托上海生工生物技術公司合成：
P1 5′-ACAT
P2 5′-C
以CKAR生物傳感器載體質粒為起點，通用質粒FT-T為中間載體，依次獲得了多個中間重組子，最后獲得目的重組質粒Smad3-Biosensor(ECFP-Smad3-Citrine-pcDNA3′)。經PCR鑒定、雙酶切鑒定和測序結果均表明成功構建Smad3 Biosensor(見圖 1、2)。
圖1
構建Smad3生物傳感器載體PCR鑒定結果
1：Smad3生物傳感器質粒PCR結果；M：DNA marker Ⅲ標準分子量
Figure1. Identification of constructed Smad3 biosensor vector by PCR1: Smad3 biosensor vector PCR production by electrophoresis; M: DNA marker,marker Ⅲ
圖2
構建Smad3生物傳感器載體雙酶切鑒定結果
1：Smad3生物傳感器載體
1: Smad3 biosensor vector by double restriction enzymes digestion with
1.3 細胞培養和轉染
293T細胞用含10% FBS的DMEM培養基，在37 ℃、 5% CO2培養箱中培養。轉染前1 d，細胞用0.05%胰蛋白酶消化，鋪入Petri皿中，密度為2×104 個/皿。待細胞生長融合至50%～70%時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒操作說明，轉染3 μg Smad3 Biosensor載體質粒,7 μL Lip2000，轉染24 h后，用Zeiss Axiovert 200 M倒置熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達情況。
1.4 熒光成像及FRET檢測
1.4.1 校正因子計算
在Zeiss Axiovert 200 M倒置熒光顯微鏡上，采用1 000倍油鏡。分別選取CFP、YFP、FRET三個濾光片作為供體、受體、FRET三個通道的濾光片。分別用單獨轉染并表達pCFP和pEYFP的細胞來檢測并計算供體的校正因子(correction factor)A和B，MetaFlour FRET軟件計算供體及受體串色常數，得到校正后的FRET。
1.4.2 FRET檢測
將濾光片轉到CFP通道，鏡下確定視野，選定待測細胞，將濾光片轉到FRET通道，拍照獲取單張細胞圖片。對待測細胞圈定幾個感興趣區域(region of interest，ROI)，同時選定1個無細胞的背景區域，用以扣除背景信號。設置實時觀察時間60 min，每間隔1 min采圖一次，共60張。連續采集CFP、YFP和FRET三個通道的圖片；將前面計算出的供體校正因子A和受體校正因子B輸入MetaFlour FRET 4.6軟件自帶公式，運用校正的方法計算出Corrected FRET，并用偽彩標記FRET圖像(pseudoecolored FRET image)顯示FRET效率。確認CFP、YFP、YFP/CFP Ratio三條基線處于平穩狀態后，加入終濃度為1.25 ng/mL的TGF-β1，動態觀察FRET變化。
2 結果
2.1 Smad3 biosensor的表達、FRET值檢測及計算
在488 nm激光激發轉染Smad3 biosensor的293T細胞，用515 nm的綠色熒光蛋白通道觀察發現：細胞可發出較強的綠色熒光，整體細胞轉染率達到40%(見圖 3)。除了能在CFP通道和YFP通道看到均勻分布的青色和黃色熒光外，還可以在FRET通道看到明顯的黃色熒光即FRET現象(見圖 4)。并且用偽彩標記的RRET圖像也顯示有較高的FRET值(數據未顯示)。
圖3
Smad3 biosensor在細胞中的表達情況
Figure3.
Smad3 biosensor fusion protein expression in 293T cells
圖4
Smad3 biosensor在293T細胞中的FRET圖像
Figure4.
FRET image of Smad3 biosensor fusion protein expression in 293T cells
2.2 TGF-β1誘導Smad3融合蛋白的動力學研究
為了能在293T細胞中實時動態觀察到TGF-β1誘導的Smad3被激活的生理過程，我們將293T細胞轉染了Smad3 biosensor質粒，表達24 h后，觀察TGF-β1誘導處理前后，Smad3融合蛋白的FRET現象的變化情況。細胞分為對照組(n=3)和實驗組(n=3)，對照組加入PBS液，實驗組加入TGF-β1液(濃度1.25 ng/mL)。結果顯示：對照組在實驗記錄時間內，YFP和CFP的熒光強度沒有任何變化；實驗組(見圖 5、6)中，經過TGF-β1處理后，可以看到前10 min左右CFP、Citrine的熒光強度沒有變化，這段無反應期之后，出現了CFP熒光強度明顯增強而Citrine的熒光強度明顯減弱的現象，Citrine/CFP的強度也明顯減弱，變化持續時間約300 s，之后600 s Citrine/CFP的強度逐漸恢復。用PBS沖洗，30 min后，重復上述實驗有時還可以出現上述FRET改變的現象。綜上所述，基于FRET原理，通過定量分析對照組和實驗組的Citrine和CFP熒光強度隨時間變化的比率，證實Smad3蛋白在TGF-β1誘導下被激活并發生了空間構象的改變，歷時約300 s，而293T細胞在TGF-β1誘導下TGF-β1/Smad3信號轉導有一定滯后時間，約10 min。
圖5
TGF-β1與293T細胞共孵育前后15 min三個通道的熒光圖像和偽彩FRET圖像
上排：加入TGF-
Upper line: before adding TGF-
圖6
用計算機分析轉染Smad3 biosensor 的293T細胞在TGF-β1刺激下的FRET現象
Figure6.
Computerized analysis of FRET in a single 293T cell transfected with Smad3 biosensor after incubation with the ligand of TGF-β1
3 討論
FRET現象是指當兩個熒光基團足夠近時(通常在10 nm以內)，激發供體熒光基團，能量將轉移到受體熒光基團，使受體發射出熒光，FRET現象是一個距離依賴性的物理過程，其效率與供體和受體熒光基團之間距離的六次方成反比。由于其能量傳遞與供受體之間的距離的高度依賴性，使得人們可以利用FRET現象來分析兩個分子間的相互作用或者同一分子間構象的變化[6]。根據這一原理，將目標蛋白與熒光蛋白融合表達，運用FRET技術在活細胞中可用于可視化檢測細胞內信號轉導機制的研究[7]。CFP和YFP是最常用的一對用于FRET研究的熒光基團。但是YFP易于受到細胞中酸堿度和氯離子的影響，有學者將YFP置換為更穩定的黃色熒光蛋白變體--Citrine，從而大大提高了FRET的效率[8]。本實驗所用的一對熒光蛋白就是CFP和Citrine，在Zeiss Axiovert 200 M倒置熒光顯微鏡下觀察到了FRET現象，說明Smad3 biosensor融合蛋白表達成功，熒光蛋白產生的FRET的效率較高。
本實驗TGF-β1與293T細胞共孵育10 min后，Smad3的融合蛋白的FRET現象才發生改變，這一段無反應時間是什么因素造成的，或者說TGF-β1/Smad3信號轉導通路的限速反應步驟是什么，這是一個值得研究的問題。既往研究證實，TGF-β1能與細胞表面密布的TGF-β1受體迅速結合，親和力很強，信號轉導速度應該很快[9]。有研究也證實，Smad3在胞質中彌散速度很快，能很快接受TGF-β1受體磷酸化[10]。我們考慮以下步驟可以影響TGF-β1/Smad3信號轉導通路的反應速度，如TGF-β1與受體結合后TGF-β1受體入胞作用的速度[11]，還有Smad3被TGF-β1受體磷酸化后脫落的速度也會影響到其他Smad3繼續被TGF-β1受體磷酸化的速度。上述因素均可延遲TGF-β1/Smad3信號轉導通路的反應時間。
Smad3被磷酸化后，其MH2區產生了空間結構改變，與MH1區像雙臂一樣打開，使得Smad3融合蛋白兩端的CFP和Citrine熒光蛋白的FRET效率減低，FRET變化過程提示，上述Smad3被磷酸化并產生變構的過程歷時約300 s。從區域上看，靠近胞膜的胞質中產生FRET現象較明顯，提示了反應的位置。FRET現象產生變化的時間反映了細胞內Smad3被磷酸化的過程，使我們在時間和空間二維層次上認識了TGF-β1/Smad3信號轉導通路在活細胞中的傳遞過程。
最近有研究表明，Smad3蛋白的基因突變和缺失與乳腺癌[12]和胃癌[13]有關。我們相信本實驗中的Smad3 biosensor將能作為一種抗腫瘤藥物的高通量篩選工具和藥效評價工具，為腫瘤臨床的分子靶向治療提供可靠理論依據。
