為了比較兩種基于赫茲模型的原子力顯微鏡(AFM)力-距離分析方法,本研究使用AFM獲取Hela和MCF-7兩種細胞的力-距離曲線。在獲得接觸點的基礎上,采用斜率法和兩點法分別分析計算得到不同壓痕深度下細胞的彈性模量。結果顯示,Hela細胞的楊氏模量高于MCF-7細胞,這與兩種細胞的微絲分布情況一致。研究還發現兩種細胞的彈性模量隨著壓痕深度的增加而減少,但斜率法曲線的變化趨勢平緩,提示斜率法能減少由于接觸點判斷錯誤引起的楊氏模量計算誤差。本研究為AFM力-距離曲線分析方法的選擇提供了參考依據。
引用本文： 王哲, 郝鋒濤, 陳曉虎, 楊周岐, 丁沖, 商澎. 原子力顯微鏡壓痕曲線分析方法的比較研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(5): 1075-1079. doi: 10.7507/1001-5515.20140202 復制
引言
細胞的生物力學特性，如細胞的彈性、黏性及剛度是細胞重要的本質特征，與生物體的生命活動關系密切[1-3]。在不同的生理或病理條件下，如細胞分化、腫瘤轉移、或受到不同的外界刺激(剪切力、生長因子)時，細胞表現出不同的生物物理特性。因此從生物力學的角度來研究和解釋生命活動的現象和進程，已成為當前生物科學領域的一個熱點問題[4-5]。隨著生物技術的發展，目前已經開發出多種用于單細胞生物力學研究的實驗方法和儀器，其中包括微管吮吸術、光鑷或光勢阱、磁鑷和掃描式聲波顯微技術等[6-8]。而原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)由于其pN級的分辨率及微損的檢測方式，被視為一種理想的用于研究細胞力學性質的實驗工具。
赫茲模型是目前分析AFM力-距離曲線最經典的模型。該模型是由赫茲[9]在1882年建立，主要用于彈性材料的力學性能分析。赫茲模型將接觸物體理想化為一個無限尺寸、連續均質且各向同性的彈性體。對細胞而言，在壓載速率足夠低和形變小于細胞高度一半的條件下，細胞的形變規律符合赫茲模型的范圍。
目前使用赫茲模型計算細胞彈性的方法主要有兩點法和斜率法。其中兩點法計算簡單，但是接觸點的判定受到諸多因素影響。斜率法雖然不用尋找接觸點，直接將原始數據乘方線性化得到斜率即可，但無法精確獲得壓痕深度。基于以上兩種方法，本研究選取Hela細胞和MCF-7細胞兩種成熟的細胞力學研究模型，在獲得接觸點后使用兩種分析方法計算了不同壓陷深度下細胞的彈性模量，并比較了兩種分析方法的優缺點。
1 材料和方法
1.1 儀器和試劑
AFM(美國Agilent公司)，型號：PicoPlus；Si3N4探針(日本Olympus公司)，型號：PSA 400，彈性系數0.02 N/m；細胞培養控溫平臺(美國Lakeshore公司)，型號:Lakeshore 321；激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，型號：TCS SP5；RPMI-1640培養基、牛胰島素購自美國Gibco公司；羅丹明標記的鬼筆環肽、DAPI染料、多聚甲醛購自Invitrogen公司；胎牛血清購自Hyclone公司；35 mm培養皿購自Nunc公司。實驗用水為超純水。
1.2 細胞培養
人乳腺癌細胞MCF-7和人宮頸癌Hela細胞購自武漢細胞庫。MCF-7細胞和Hela細胞生長于10%胎牛血清和100 U雙抗(青、鏈霉素)的RPM I- 1640培養液中，置于5% CO2、37 ℃條件下培養。對于MCF-7細胞，培養基中添加10 mg/mL牛胰島素。細胞生長至對數期時用于實驗研究。
1.3 細胞樣品制備
取對數生長期的MCF-7和Hela細胞接種于35 mm培養皿，細胞密度為2×105個/皿，細胞貼壁24 h后用于實驗。在開展AFM探針壓陷實驗時，培養基中加入10 mmol/L的HEPES用于保持培養基pH值。
1.4 AFM力-距離曲線的獲取
首先使用AFM自帶的熱調諧適配器(Themo K)在空氣中精確測量探針的彈性系數。接著將制備好的細胞樣品置于細胞培養控溫平臺并逐漸將探針浸入培養基中，在培養皿底部空白區域獲取力-距離曲線，并測量探針懸臂梁的光學偏轉靈敏度。隨后在光學顯微鏡的幫助下，將探針移動到細胞核上方，對細胞進行壓陷并獲得力-距離曲線。各選取15~20個細胞，每個細胞上重復獲取15條力-距離曲線。最后在培養皿底部空白區域再次測量探針懸臂梁的光學偏轉靈敏度，采用兩次光學偏轉敏感度的均值作為計算參數。所有力-距離曲線的獲取條件完全一致，采樣點20 000個，加載速率4 μm/s。
1.5 力-距離曲線分析和楊氏模量計算
本實驗根據赫茲模型分析探針逼近曲線并計算細胞楊氏模量[10]。 對于錐形探針，赫茲模型滿足以下方程：
| $F=\frac{2}{\pi }~\frac{E}{1-{{v}^{2}}}tan\alpha {{\sigma }^{2}}$ |
可以直接推導出楊氏模量：
| $E=\frac{\pi F(1-{{v}^{2}})}{2tan\alpha {{\sigma }^{2}}}$ |
其中 F為探針對細胞所施加的壓力，E為楊氏模量，v為泊松比，α為探針半開角，δ為壓痕深度。從式(2)可知，如果能在力-距離曲線上找到接觸點及其對應的壓力Fcon和距離Dcon，那么就可以精確計算出細胞在任意壓痕深度下的彈性模量，這也就是常用的兩點法。
Carl等[11]在此基礎上對式(1)進行修改，將公式兩端同時開方并且線性化
| $\frac{2}{\pi }~\frac{E}{1-{{v}^{2}}}tan{{\alpha }^{1/2}}=\frac{\Delta ({{F}^{1/2}})}{\Delta \delta }=slope$ |
發現線性擬合的結果與實驗數據能很好地吻合。由此也推導出：
| $E=\frac{2}{\pi }~\frac{\Delta ({{F}^{1/2}})}{\Delta {{\delta }^{2}}}\frac{1-{{v}^{2}}}{tan\alpha }=\frac{2}{\pi }slop{{e}^{2}}\frac{1-{{v}^{2}}}{tan\alpha }$ |
這就是采用斜率法計算細胞楊氏模量的方法。本研究采用逐點搜尋法[12]，使用Matlab程序自動尋找接觸點，利用式(2)和式(4)分別計算不同壓痕深度下細胞的楊氏模量。
1.6 細胞骨架熒光染色
細胞骨架染色方法參考張維等實驗方法[13]。將細胞按照1×105 個/皿的密度接種于放有蓋玻片的35 mm培養皿中。培養24 h后，棄去培養基，PBS沖洗后使用4%多聚甲醛固定細胞。使用羅丹明標記的鬼筆環肽和DAPI染料對細胞進行復染，加入抗熒光淬滅甘油封片后,使用激光共聚焦顯微鏡進行成像觀察。
1.7 數據處理及統計學分析
使用Prism 5.0軟件進行實驗數據統計分析，數據表達式形式為均數±標準差(
2 結果
2.1 AFM力-距離曲線的獲取
以Hela細胞為例，借助觀察系統將探針移動到細胞正上方，如圖 1(a)所示，探針壓陷細胞獲取力-距離曲線。圖 1(b)為探針在壓陷培養皿基底(藍色曲線)和Hela細胞(紅色曲線)時逼近過程的力-距離曲線，可以看出不同硬度基底上獲取的力-距離曲線趨勢明顯不同。
圖1
力-距離曲線獲取
(a) 選擇探針在細胞上壓陷位置； (b)培養皿和細胞上獲取的力-距離曲線，藍色：聚苯乙烯；紅色：細胞
Figure1. Acquisition of AFM force-distance curve(a) move the probe to the cell above the nuclear;(b) Reprehensive force-distance curves obtained from the culture dish (blue) and cell (red)
2.2 力-距離曲線分析及接觸點判定
在Crick等[12]方法的基礎上，修訂了接觸點判定的參數和流程，如圖 2(a)所示。圖 2(b)可以清楚的看到計算所得的接觸點，即直線擬合區域(紅色)和二次曲線擬合區域(綠色)的交界處。
圖2
接觸點的判定
(a) 接觸點判定流程圖；(b) 力-距離曲線上判定接觸點，曲線上紅色區域和綠色區域線條結合處即為接觸點
Figure2. Determination of the contact point(a) Flowchart for assessment of the contact point;(b) the contact point in the force-distance curve,where the red and the green curve meet
2.3 楊氏模量分析
采用兩點法和斜率法計算得到的Hela細胞和MCF-7細胞的楊氏模量以及楊氏模量與壓陷深度的關系圖，如圖 3所示。兩種方法所得曲線的變化趨勢基本相同，楊氏模量都是隨著壓陷深度的增加而減少。兩點法計算所得到的結果稍高于斜率法，但兩者之間沒有顯著差異。
圖3
細胞在不同壓痕深度下的楊氏模量
Figure3.
Cell’s Young’s modulus in different indentation depths
2.4 細胞微絲骨架排布
圖 4是Hela細胞和MCF-7細胞F-actin以及細胞核熒光染色圖片。如圖 4所示，Hela細胞中F-actin分布規律，成束狀排布；而在MCF-7細胞中，絲狀結構較少。同時Hela細胞的應力纖維束要明顯多于MCF-7細胞。
圖4
細胞F-actin骨架排布
Figure4.
Distribution of cell F-actin
3 討論
目前使用AFM研究細胞力學性能經典流程如下：選取合適形狀(錐形或球形等)和力常數的探針壓陷細胞，獲取進針和退針過程中探針的力-距離曲線，然后利用不同的數學模型和方法分析力-距離曲線，最后計算細胞的力學性能參數。在這種研究策略中，數據分析模型的選擇和分析是影響力學性能計算準確性和重復性的關鍵因素之一[14]。
赫茲模型是被廣泛接受的數據分析模型，而接觸點位置的判斷和壓痕深度的選取是影響赫茲模型計算細胞力學性能的兩個重要因素。本研究在優化接觸點判定流程的基礎上，縮小接觸點搜索范圍，采用逐點掃描的方法，能快速地自動計算出細胞的接觸點，如圖 2所示。
楊氏模量是細胞力學性能研究中最常用的參數之一，已有的研究結果顯示采用不同檢測裝置和方法得到的結果存在較大的差異。因此實驗中有必要嚴格選定實驗參數。本文選用兩種常用于細胞力學研究的細胞株，在確定接觸點位置的基礎上，采用兩點法和斜率法兩種方法分析計算了細胞在不同壓痕深度下的楊氏模量。研究顯示，Hela細胞的楊氏模量要遠遠大于MCF-7細胞，這一結果與Leporatti等[15]的研究趨于一致。同時細胞的力學性能與細胞的F-actin的分布結果吻合，Hela細胞中的F-actin纖維束要顯著多于MCF-7細胞。此外本實驗獲得的數據與已發表的研究結果相比，在絕對數值上有一定的差異[15-16] ，這種差異是可能是由于探針形狀、加載速率和測試系統的靈敏性不同等多種因素造成的。但是分析發現，兩種細胞楊氏模量的比值與Leporatti等的結果非常吻合，間接體現了本實驗方法的可靠性和穩定性，這也提示我們在相同儀器和實驗條件下，該方法完全適用于不同類型細胞和不同處理條件下細胞楊氏模量的比較研究。
此外，本文中的兩種計算方法都可以在準確的壓痕深度下獲得細胞的彈性模量。結果顯示兩種細胞的彈性模量隨著壓痕深度的增加而降低，且變化趨勢一致。當壓痕深度大于400 nm后，細胞的楊氏模量保持穩定，與Guo等[17]在對成骨細胞進行的研究中獲得的數據變化趨勢基本一致。需要指出的是，采用斜率法計算獲得的楊氏模量隨壓痕深度曲線變化的趨勢相對平緩，說明斜率法對接觸的依賴性較小，這也體現出斜率法固有的優點。這提示了在接觸點判斷有誤的情況下，斜率法計算獲得的楊氏模量與真實值的誤差要小于兩點法。因此，對于較難判定接觸點位置的力-距離曲線，采用斜率法分析會獲得相對準確的楊氏模量值。
4 結論
細胞的生物物理性質在生物體生命活動中起著非常重要的作用。目前細胞力學領域已取得了許多突破性的進展，已成為生物研究中的一個熱點問題。本研究采用AFM分析了Hela和MCF-7細胞的楊氏模量，比較兩點法和斜率法這兩種基于赫茲模型的力-距離曲線分析方法的優缺點，發現斜率法能減少由于接觸點判斷錯誤引起的楊氏模量計算誤差。本研究為AFM檢測細胞彈性模量中力-距離曲線分析方法的選擇提供了參考依據。
引言
細胞的生物力學特性，如細胞的彈性、黏性及剛度是細胞重要的本質特征，與生物體的生命活動關系密切[1-3]。在不同的生理或病理條件下，如細胞分化、腫瘤轉移、或受到不同的外界刺激(剪切力、生長因子)時，細胞表現出不同的生物物理特性。因此從生物力學的角度來研究和解釋生命活動的現象和進程，已成為當前生物科學領域的一個熱點問題[4-5]。隨著生物技術的發展，目前已經開發出多種用于單細胞生物力學研究的實驗方法和儀器，其中包括微管吮吸術、光鑷或光勢阱、磁鑷和掃描式聲波顯微技術等[6-8]。而原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)由于其pN級的分辨率及微損的檢測方式，被視為一種理想的用于研究細胞力學性質的實驗工具。
赫茲模型是目前分析AFM力-距離曲線最經典的模型。該模型是由赫茲[9]在1882年建立，主要用于彈性材料的力學性能分析。赫茲模型將接觸物體理想化為一個無限尺寸、連續均質且各向同性的彈性體。對細胞而言，在壓載速率足夠低和形變小于細胞高度一半的條件下，細胞的形變規律符合赫茲模型的范圍。
目前使用赫茲模型計算細胞彈性的方法主要有兩點法和斜率法。其中兩點法計算簡單，但是接觸點的判定受到諸多因素影響。斜率法雖然不用尋找接觸點，直接將原始數據乘方線性化得到斜率即可，但無法精確獲得壓痕深度。基于以上兩種方法，本研究選取Hela細胞和MCF-7細胞兩種成熟的細胞力學研究模型，在獲得接觸點后使用兩種分析方法計算了不同壓陷深度下細胞的彈性模量，并比較了兩種分析方法的優缺點。
1 材料和方法
1.1 儀器和試劑
AFM(美國Agilent公司)，型號：PicoPlus；Si3N4探針(日本Olympus公司)，型號：PSA 400，彈性系數0.02 N/m；細胞培養控溫平臺(美國Lakeshore公司)，型號:Lakeshore 321；激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，型號：TCS SP5；RPMI-1640培養基、牛胰島素購自美國Gibco公司；羅丹明標記的鬼筆環肽、DAPI染料、多聚甲醛購自Invitrogen公司；胎牛血清購自Hyclone公司；35 mm培養皿購自Nunc公司。實驗用水為超純水。
1.2 細胞培養
人乳腺癌細胞MCF-7和人宮頸癌Hela細胞購自武漢細胞庫。MCF-7細胞和Hela細胞生長于10%胎牛血清和100 U雙抗(青、鏈霉素)的RPM I- 1640培養液中，置于5% CO2、37 ℃條件下培養。對于MCF-7細胞，培養基中添加10 mg/mL牛胰島素。細胞生長至對數期時用于實驗研究。
1.3 細胞樣品制備
取對數生長期的MCF-7和Hela細胞接種于35 mm培養皿，細胞密度為2×105個/皿，細胞貼壁24 h后用于實驗。在開展AFM探針壓陷實驗時，培養基中加入10 mmol/L的HEPES用于保持培養基pH值。
1.4 AFM力-距離曲線的獲取
首先使用AFM自帶的熱調諧適配器(Themo K)在空氣中精確測量探針的彈性系數。接著將制備好的細胞樣品置于細胞培養控溫平臺并逐漸將探針浸入培養基中，在培養皿底部空白區域獲取力-距離曲線，并測量探針懸臂梁的光學偏轉靈敏度。隨后在光學顯微鏡的幫助下，將探針移動到細胞核上方，對細胞進行壓陷并獲得力-距離曲線。各選取15~20個細胞，每個細胞上重復獲取15條力-距離曲線。最后在培養皿底部空白區域再次測量探針懸臂梁的光學偏轉靈敏度，采用兩次光學偏轉敏感度的均值作為計算參數。所有力-距離曲線的獲取條件完全一致，采樣點20 000個，加載速率4 μm/s。
1.5 力-距離曲線分析和楊氏模量計算
本實驗根據赫茲模型分析探針逼近曲線并計算細胞楊氏模量[10]。 對于錐形探針，赫茲模型滿足以下方程：
| $F=\frac{2}{\pi }~\frac{E}{1-{{v}^{2}}}tan\alpha {{\sigma }^{2}}$ |
可以直接推導出楊氏模量：
| $E=\frac{\pi F(1-{{v}^{2}})}{2tan\alpha {{\sigma }^{2}}}$ |
其中 F為探針對細胞所施加的壓力，E為楊氏模量，v為泊松比，α為探針半開角，δ為壓痕深度。從式(2)可知，如果能在力-距離曲線上找到接觸點及其對應的壓力Fcon和距離Dcon，那么就可以精確計算出細胞在任意壓痕深度下的彈性模量，這也就是常用的兩點法。
Carl等[11]在此基礎上對式(1)進行修改，將公式兩端同時開方并且線性化
| $\frac{2}{\pi }~\frac{E}{1-{{v}^{2}}}tan{{\alpha }^{1/2}}=\frac{\Delta ({{F}^{1/2}})}{\Delta \delta }=slope$ |
發現線性擬合的結果與實驗數據能很好地吻合。由此也推導出：
| $E=\frac{2}{\pi }~\frac{\Delta ({{F}^{1/2}})}{\Delta {{\delta }^{2}}}\frac{1-{{v}^{2}}}{tan\alpha }=\frac{2}{\pi }slop{{e}^{2}}\frac{1-{{v}^{2}}}{tan\alpha }$ |
這就是采用斜率法計算細胞楊氏模量的方法。本研究采用逐點搜尋法[12]，使用Matlab程序自動尋找接觸點，利用式(2)和式(4)分別計算不同壓痕深度下細胞的楊氏模量。
1.6 細胞骨架熒光染色
細胞骨架染色方法參考張維等實驗方法[13]。將細胞按照1×105 個/皿的密度接種于放有蓋玻片的35 mm培養皿中。培養24 h后，棄去培養基，PBS沖洗后使用4%多聚甲醛固定細胞。使用羅丹明標記的鬼筆環肽和DAPI染料對細胞進行復染，加入抗熒光淬滅甘油封片后,使用激光共聚焦顯微鏡進行成像觀察。
1.7 數據處理及統計學分析
使用Prism 5.0軟件進行實驗數據統計分析，數據表達式形式為均數±標準差(
2 結果
2.1 AFM力-距離曲線的獲取
以Hela細胞為例，借助觀察系統將探針移動到細胞正上方，如圖 1(a)所示，探針壓陷細胞獲取力-距離曲線。圖 1(b)為探針在壓陷培養皿基底(藍色曲線)和Hela細胞(紅色曲線)時逼近過程的力-距離曲線，可以看出不同硬度基底上獲取的力-距離曲線趨勢明顯不同。
圖1
力-距離曲線獲取
(a) 選擇探針在細胞上壓陷位置； (b)培養皿和細胞上獲取的力-距離曲線，藍色：聚苯乙烯；紅色：細胞
Figure1. Acquisition of AFM force-distance curve(a) move the probe to the cell above the nuclear;(b) Reprehensive force-distance curves obtained from the culture dish (blue) and cell (red)
2.2 力-距離曲線分析及接觸點判定
在Crick等[12]方法的基礎上，修訂了接觸點判定的參數和流程，如圖 2(a)所示。圖 2(b)可以清楚的看到計算所得的接觸點，即直線擬合區域(紅色)和二次曲線擬合區域(綠色)的交界處。
圖2
接觸點的判定
(a) 接觸點判定流程圖；(b) 力-距離曲線上判定接觸點，曲線上紅色區域和綠色區域線條結合處即為接觸點
Figure2. Determination of the contact point(a) Flowchart for assessment of the contact point;(b) the contact point in the force-distance curve,where the red and the green curve meet
2.3 楊氏模量分析
采用兩點法和斜率法計算得到的Hela細胞和MCF-7細胞的楊氏模量以及楊氏模量與壓陷深度的關系圖，如圖 3所示。兩種方法所得曲線的變化趨勢基本相同，楊氏模量都是隨著壓陷深度的增加而減少。兩點法計算所得到的結果稍高于斜率法，但兩者之間沒有顯著差異。
圖3
細胞在不同壓痕深度下的楊氏模量
Figure3.
Cell’s Young’s modulus in different indentation depths
2.4 細胞微絲骨架排布
圖 4是Hela細胞和MCF-7細胞F-actin以及細胞核熒光染色圖片。如圖 4所示，Hela細胞中F-actin分布規律，成束狀排布；而在MCF-7細胞中，絲狀結構較少。同時Hela細胞的應力纖維束要明顯多于MCF-7細胞。
圖4
細胞F-actin骨架排布
Figure4.
Distribution of cell F-actin
3 討論
目前使用AFM研究細胞力學性能經典流程如下：選取合適形狀(錐形或球形等)和力常數的探針壓陷細胞，獲取進針和退針過程中探針的力-距離曲線，然后利用不同的數學模型和方法分析力-距離曲線，最后計算細胞的力學性能參數。在這種研究策略中，數據分析模型的選擇和分析是影響力學性能計算準確性和重復性的關鍵因素之一[14]。
赫茲模型是被廣泛接受的數據分析模型，而接觸點位置的判斷和壓痕深度的選取是影響赫茲模型計算細胞力學性能的兩個重要因素。本研究在優化接觸點判定流程的基礎上，縮小接觸點搜索范圍，采用逐點掃描的方法，能快速地自動計算出細胞的接觸點，如圖 2所示。
楊氏模量是細胞力學性能研究中最常用的參數之一，已有的研究結果顯示采用不同檢測裝置和方法得到的結果存在較大的差異。因此實驗中有必要嚴格選定實驗參數。本文選用兩種常用于細胞力學研究的細胞株，在確定接觸點位置的基礎上，采用兩點法和斜率法兩種方法分析計算了細胞在不同壓痕深度下的楊氏模量。研究顯示，Hela細胞的楊氏模量要遠遠大于MCF-7細胞，這一結果與Leporatti等[15]的研究趨于一致。同時細胞的力學性能與細胞的F-actin的分布結果吻合，Hela細胞中的F-actin纖維束要顯著多于MCF-7細胞。此外本實驗獲得的數據與已發表的研究結果相比，在絕對數值上有一定的差異[15-16] ，這種差異是可能是由于探針形狀、加載速率和測試系統的靈敏性不同等多種因素造成的。但是分析發現，兩種細胞楊氏模量的比值與Leporatti等的結果非常吻合，間接體現了本實驗方法的可靠性和穩定性，這也提示我們在相同儀器和實驗條件下，該方法完全適用于不同類型細胞和不同處理條件下細胞楊氏模量的比較研究。
此外，本文中的兩種計算方法都可以在準確的壓痕深度下獲得細胞的彈性模量。結果顯示兩種細胞的彈性模量隨著壓痕深度的增加而降低，且變化趨勢一致。當壓痕深度大于400 nm后，細胞的楊氏模量保持穩定，與Guo等[17]在對成骨細胞進行的研究中獲得的數據變化趨勢基本一致。需要指出的是，采用斜率法計算獲得的楊氏模量隨壓痕深度曲線變化的趨勢相對平緩，說明斜率法對接觸的依賴性較小，這也體現出斜率法固有的優點。這提示了在接觸點判斷有誤的情況下，斜率法計算獲得的楊氏模量與真實值的誤差要小于兩點法。因此，對于較難判定接觸點位置的力-距離曲線，采用斜率法分析會獲得相對準確的楊氏模量值。
4 結論
細胞的生物物理性質在生物體生命活動中起著非常重要的作用。目前細胞力學領域已取得了許多突破性的進展，已成為生物研究中的一個熱點問題。本研究采用AFM分析了Hela和MCF-7細胞的楊氏模量，比較兩點法和斜率法這兩種基于赫茲模型的力-距離曲線分析方法的優缺點，發現斜率法能減少由于接觸點判斷錯誤引起的楊氏模量計算誤差。本研究為AFM檢測細胞彈性模量中力-距離曲線分析方法的選擇提供了參考依據。
