在0.01~100 MHz頻率內,使用Agilent 4294A阻抗分析儀測量了人肝癌SMMC-7721細胞的交流阻抗,通過電阻抗譜、Bode圖、Nyquist圖和Nichols圖觀察了細胞體積分數(CVF)對肝癌細胞電阻抗特性的影響。結果表明:①頻率依賴性:電阻抗實部增量、虛部增量(ΔZ'、ΔZ″)、幅模增量(Δ|Z*|)和相位角增量(Δθ)皆隨頻率發生變化;②CVF依賴性:當CVF增加時,低頻極限增量值(ΔZ'0、Δ|Z*|0)、峰值(ΔZ″p、Δθp)、曲線面積和半徑(Nyquist圖、Nichols圖)均隨之增大;③存在兩個特征頻率:第一特征頻率(fC1)和第二特征頻率(fC2),分別來源于細胞膜與細胞外液、細胞質交界面的極化作用。結論:電阻抗譜方法能夠觀察人肝癌細胞電特性,可用于探討肝癌細胞電生理機制變化,為進一步篩選抗腫瘤藥物提供研究手段和觀測指標,具有重要的理論價值和潛在的應用前景。
引用本文： 方云, 湯治元, 張倩, 趙鑫, 馬青. 人肝癌細胞電阻抗特性的實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(5): 1070-1074. doi: 10.7507/1001-5515.20140201 復制
引言
生物電阻抗技術已廣泛應用到血液[1]、肌肉[2]、肝臟及肝癌組織[3]、乳腺癌[4]、宮頸癌[5]等相關的生物醫學領域。但是，從細胞水平對人肝癌細胞電阻抗特性進行研究，尚未見報道。原發性肝癌是世界第六大癌癥，死亡率位列第三，尤其在我國，肝癌已經成為一個公共健康問題[6]。因此積極開展對肝癌細胞的基礎理論研究，尋找有效的檢測手段，為篩選抗癌藥物提供研究手段和指標，具有重要的現實意義。 本文通過電阻抗測量技術，對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞懸液進行阻抗測量實驗研究，借助細胞電阻抗特征圖譜，提取肝癌細胞電阻抗特征參數，為探討其電生理機制的變化和篩選相應的抗癌藥物奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 細胞培養
人肝癌細胞系SMMC-7721細胞(購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)培養于含10%小牛血清(Hyclone公司產品)，100 U/mL青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養液(GIBCO公司產品)中，在溫度為37 ℃、濕度為100%、CO2濃度為5%的培養箱(Thermo公司，美國)中培養，細胞呈貼壁生長，3～4 d換液一次，4～5 d傳代一次。
1.2 樣品收集
在無菌條件下，將處于對數生長期的細胞通過無菌操作轉移到10 mL離心管中，離心機1 000 r/min離心5 min，獲得富集后的細胞，備用。
1.3 細胞阻抗測量
在0.01～100 MHz頻率范圍內，將Agilent 4294A阻抗分析儀(Agilent公司，日本)的測量條件設置為126個頻率點，每個頻率點自動循環掃描測量三次，將交流激勵信號源電壓設為100 mV。通過測量細胞電阻抗的幅模量|Z*|和相位角θ獲取電阻抗數據。測量池[7]為透明的有機玻璃圓柱管，在兩個底面上分別黏上鉑片電極，規格為：直徑d為4.8 mm，間距L為5.3 mm，容積約96 μL。在(25±1)℃下進行阻抗測量。
1.4 細胞體積分數測量
將細胞懸液均勻混合，制成的懸液加入到比容管(長度75 mm，外徑1.5 mm)，用Haematokrit 210離心機(Hettich公司，德國)以10 000 r/min離心5 min，分別測量全懸浮液長度(L)與細胞長度(l)，細胞體積分數(cell volume fraction,CVF)按公式計算：CVF＝(l/L)×100%。
1.5 阻抗測量與計算
細胞阻抗Z*=|Z*|×e-jθ=Z′+jZ″，通過測量的阻抗幅模量|Z*|和相位角θ，得到阻抗實部Z′=|Z*|cosθ，虛部Z″=|Z*|sinθ，實部增量ΔZ′=Z′-Z′100，虛部增量ΔZ″=Z″-Z″0.01，幅模增量Δ|Z*|=|Z*|-|Z*|100，相位角增量Δθ=θ-θ0.01，電場頻率f，角頻率ω=2πf，虛部單位j=-1，角標0.01和100分別表示頻率0.01 MHz和100 MHz。
2 結果
2.1 人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗譜
圖 1(a)表示人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗實部增量(ΔZ′)隨電場頻率(f)變化的頻譜(ΔZ′(f))。① ΔZ′(f)曲線隨電場頻率f變化：在f為0.01～0.1 MHz頻段，ΔZ′基本不變，表現電阻抗實部低頻極限值(ΔZ′0)的高電阻；在f為0.1～10 MHz頻段，ΔZ′由高電阻向低電阻變化；在f為10～100 MHz頻段，ΔZ′逐漸減小。② ΔZ′(f)頻譜曲線隨CVF變化：隨CVF增加，肝癌SMMC-7721細胞的ΔZ′0隨之增加。
圖1
人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗頻譜
(a)
(a) the
圖 1(b)表示人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗虛部(ΔZ″)隨電場頻率(f)變化的頻譜[ΔZ″(f)]。在不考慮負號的情況下，ΔZ″(f)的表現：① ΔZ″(f)曲線隨電場頻率f發生較大變化，在f為0.01～1 MHz頻段形成一個峰值(ΔZ″P)，對應于第一特征頻率(fC1)；在f為1~100 MHz頻段先出現波谷，隨后ΔZ″(f)曲線上升。② ΔZ″P隨CVF增大而增加，而fC1基本不變。
圖 1(c)表示四種CVF的肝癌SMMC-7721細胞的復阻抗平面圖，橫坐標是電阻抗實部增量ΔZ′，縱坐標是電阻抗虛部增量ΔZ″，此圖稱為Nyquist圖。Nyquist圖的曲線以右截距ΔZ′0為起點，隨著角頻率(ω=2πf)的增加，向左延伸形成一個半圓弧和一個翹尾；半圓弧的圓心低于橫坐標，半圓弧的頂點是fC1，頂點到橫坐標的距離為ΔZ″P。隨CVF增加，Nyquist曲線的面積和半徑增大，曲線的位置擴展性向右平移，引起ΔZ′0和ΔZ″P變大。
2.2 人肝癌SMMC-7721細胞Bode圖和Nichols圖
圖 2(a)表示人肝癌SMMC-7721細胞的幅-頻特性曲線。① 電阻抗幅模量(Δ|Z*|)曲線隨外加電場頻率f的變化：在f為0.01～0.1 MHz頻段，Δ|Z*|表現為幅模量低頻極限值(Δ|Z*|0)；在f為 0.1～10 MHz頻段，Δ|Z*|由高幅模量向低幅模量變化；在f為10～100 MHz頻段，Δ|Z*|逐漸減小。② 隨CVF增加，Δ|Z*|曲線左側明顯抬升，導致Δ|Z*|0隨之增加。
圖2
人肝癌SMMC-7721細胞的Bode圖和Nichols圖
(a)幅-頻特性曲線；(b)相-頻特性曲線；(c)Nichols圖
Figure2. Bode and Nichols plots of human hepatoma SMMC-7721 cells(a) amplitude-frequency characteristic curve; (b) phase-frequency characteristic curve; (c) Nichols plot
圖 2(b)表示人肝癌SMMC-7721細胞的相-頻特性曲線。在不考慮負號的情況下:① 在0.01～1 MHz頻段，形成峰值ΔθP，其對應的頻率為第二特征頻率(fC2)，在1～100 MHz頻率段先形成波谷，后上揚；② 隨CVF增加，ΔθP也隨之增大，而fC2基本不變。
圖 2(c)表示四種不同CVF的人肝癌SMMC-7721細胞的Nichols圖，它與圖 1(c)曲線類似。當不考慮負號的情況下，Nichols圖曲線以右截距logΔ|Z*|0為起點，隨著ω的增加，形成半圓弧和翹尾的曲線，第二特征頻率(fC2)是圓弧頂點頻率，頂點到橫坐標的距離為相位角峰值(ΔθP)。隨CVF增加，log△|Z*|0、ΔθP、圓弧的面積和半徑隨之增大。
在不考慮負號的情況下，由表 1可知，隨CVF的增加，人肝癌SMMC-7721細胞的電阻抗參數(ΔZ′0、Δ|Z*|0、ΔZ″P、LogΔ |Z*|0、ΔθP)均增大，表現出與CVF的依存關系。
表1
CVF對人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗特性的影響
Table1.
Effect of CVF on the electrical impedance properties of human hepatoma SMMC-7721 cells
3 討論
圖 3(a)是細胞懸浮在直流電場時，細胞內外的離子就會受到電場的作用，發生定向移動，陽離子向負極移動，陰離子向正極移動。由于細胞膜的存在，電荷受到細胞膜的物理阻隔，在細胞外：正電荷聚集在陽極側，負電荷聚集在負極側；在細胞內：負電荷聚集在陽極側，正電荷聚集在陰極側，在細胞膜上產生了正負離子分離現象，稱為細胞極化現象(cell polarization)[8]；圖 3(b)是細胞懸浮在交流低頻電場時[9]，由于低頻電場的正負極方向變換頻次較低，導致細胞內外的離子移動速度就慢，引起細胞極化效應和強度就強，相當于細胞膜電容處于開路狀態，表現為電容性阻抗增大，電流只好在低電阻區域的細胞外流動；圖 3(c)是細胞懸浮在交流高頻電場時，由于高頻電場的正負極方向切換頻次高，導致細胞內外的離子移動速度較快，細胞幾乎不產生極化現象，相當于細胞膜電容性短路，表現為低電阻，電流容易流經低阻的細胞內。細胞極化過程可以利用交流電阻抗方法測量，即采用激勵電壓V(ω)與響應電流I(ω)之比的復數電阻抗[Z(ω)=V(ω)/I(ω)]方式，實現細胞電阻抗頻譜測量。
圖3
細胞極化現象
(a)直流電場致細胞極化;(b)低頻電場致細胞極化;(c)高頻電場對細胞的影響
Figure3. Cell polarization phenomena(a) polarization of cell controlled by dc electric field; (b) polarization of cell controlled by low frequency electric field; (c) the effect of cell with high frequency electric field
從圖 1(a)、圖 2(a)以及表 1可知：人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗特征：① 細胞的頻率依存性：隨著頻率的遞增，電阻抗實部增量(ΔZ′)和幅模增量(Δ|Z*|)逐漸減小，出現了低頻極限增量(ΔZ′0、Δ|Z*|0)高值現象。其原因可以采用細胞膜電阻R和細胞膜電容C的并聯等效電路模型[7]進行解釋：當電場頻率處在低頻段時，膜電容處于開路狀態，表現為電容性阻抗(ZC=1/jωC)增強，低頻極限增量(ΔZ′0、Δ|Z*|0)呈現高值；當電場頻率由低頻向高頻逐漸增加時，電容性阻抗(ZC)也逐漸相應減小；當電場處于高頻時，電容性阻抗(ZC)最低，故出現了圖 1(a)、圖 2(a)中隨頻率變化的現象；② CVF依存性：隨CVF遞增，肝癌SMMC-7721細胞的低頻極限增量(ΔZ′0、Δ|Z*|0)明顯增加。其原因：當CVF增大時，即單位體積內細胞密度增大時，單位體積內細胞極化的膜表面積也會隨之增大，必然導致測量的阻抗值增大[10]，從而導致阻抗增量的增大。所以，低頻極限增量值(ΔZ′0、Δ|Z*|0)可以反映單位體積下的細胞數量或密度，已應用于無標記細胞培養過程的細胞計數檢測[11]。
在圖 1(b)，電阻抗虛部增量(ΔZ″)出現最大峰值(ΔZ″P)，說明在細胞膜與細胞外液的交界面，由外加電場誘發偶極的容抗，當外加電場頻率等于fC1時，產生了最大的響應；當外加電場頻率等于fC2時，在細胞膜與細胞質的交界面，電壓與電流之間的相位差，出現了最大變化，相應地在圖 2(b)出現了相位角增量最大峰值(ΔθP)。這兩個峰值(ΔZ″P、ΔθP)均隨CVF的增加而變大，其原因無外乎極化的細胞面積增多所致。
圖 1(b、c)和圖 2(b、c)中標出的兩個宏觀電阻抗特征頻率(fC1、fC2)分別表示肝癌SMMC-7721細胞兩個不同部位對外加電場響應的細胞電阻抗特征，根據fC1、fC2的數值，這兩個特征頻率均來自細胞膜的電荷極化，但是它們所處的細胞膜位置不同，即：fC1來源于發生在細胞膜與細胞外液交界面的電荷極化，它反映外加電場對此界面的頻率響應特征；fC2來源于發生在細胞膜與細胞質交界面的電荷極化，其反映外加電場對細胞膜與細胞質之間界面的頻率響應特征。這兩個宏觀的參數(fC1、fC2)可以反映發生在細胞膜與細胞外液交界或細胞質交界處的微觀充放電過程[12]。表明fC1和fC2均可反映細胞電阻抗特性，可用于細胞培養的病毒疫苗生產過程的在線監測[13]以及生物細胞質量監測(biomass monitoring)[12]。
由表 1可知，當CVF在23%～42%時，特征頻率(fC1、fC2)基本上與CVF的變化無關，特征頻率(fC1、fC2)可用于表示肝癌SMMC-7721細胞自身固有的電學特征指標，它可用于鑒定人肝癌細胞系SMMC-7721，為進一步肝細胞的生物電磁學的研究奠定了基礎。
4 結論
本文的細胞阻抗譜測量與分析結果表明，人肝癌SMMC-7721細胞的電阻抗具有三個特征：① 頻率依賴性，即隨電場頻率的遞增，電阻抗增量(ΔZ′、ΔZ″、Δ|Z*|)和相位角增量(Δθ)均增加；② CVF依存性，即隨CVF的遞增，低頻極限增量(ΔZ′0、Δ|Z*|0)、峰值(ΔZ″P、ΔθP)、曲線面積和半徑(Nyquist圖、Nichols圖)均隨之增大；③ 阻抗弛豫具有2個特征頻率(fC1、fC2)，fC1來源于細胞膜相與細胞外液相交界，fC2來源于細胞膜相與細胞質相交界，且CVF在23%~39%時，CVF對特征頻率(fC1、fC2)無影響。
本文的電阻抗頻譜方法可以應用于肝癌細胞電生理機制研究，為進一步開發抗腫瘤藥物，提供了研究手段和觀測指標，具有重要的理論價值和潛在的應用前景。
引言
生物電阻抗技術已廣泛應用到血液[1]、肌肉[2]、肝臟及肝癌組織[3]、乳腺癌[4]、宮頸癌[5]等相關的生物醫學領域。但是，從細胞水平對人肝癌細胞電阻抗特性進行研究，尚未見報道。原發性肝癌是世界第六大癌癥，死亡率位列第三，尤其在我國，肝癌已經成為一個公共健康問題[6]。因此積極開展對肝癌細胞的基礎理論研究，尋找有效的檢測手段，為篩選抗癌藥物提供研究手段和指標，具有重要的現實意義。 本文通過電阻抗測量技術，對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞懸液進行阻抗測量實驗研究，借助細胞電阻抗特征圖譜，提取肝癌細胞電阻抗特征參數，為探討其電生理機制的變化和篩選相應的抗癌藥物奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 細胞培養
人肝癌細胞系SMMC-7721細胞(購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)培養于含10%小牛血清(Hyclone公司產品)，100 U/mL青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養液(GIBCO公司產品)中，在溫度為37 ℃、濕度為100%、CO2濃度為5%的培養箱(Thermo公司，美國)中培養，細胞呈貼壁生長，3～4 d換液一次，4～5 d傳代一次。
1.2 樣品收集
在無菌條件下，將處于對數生長期的細胞通過無菌操作轉移到10 mL離心管中，離心機1 000 r/min離心5 min，獲得富集后的細胞，備用。
1.3 細胞阻抗測量
在0.01～100 MHz頻率范圍內，將Agilent 4294A阻抗分析儀(Agilent公司，日本)的測量條件設置為126個頻率點，每個頻率點自動循環掃描測量三次，將交流激勵信號源電壓設為100 mV。通過測量細胞電阻抗的幅模量|Z*|和相位角θ獲取電阻抗數據。測量池[7]為透明的有機玻璃圓柱管，在兩個底面上分別黏上鉑片電極，規格為：直徑d為4.8 mm，間距L為5.3 mm，容積約96 μL。在(25±1)℃下進行阻抗測量。
1.4 細胞體積分數測量
將細胞懸液均勻混合，制成的懸液加入到比容管(長度75 mm，外徑1.5 mm)，用Haematokrit 210離心機(Hettich公司，德國)以10 000 r/min離心5 min，分別測量全懸浮液長度(L)與細胞長度(l)，細胞體積分數(cell volume fraction,CVF)按公式計算：CVF＝(l/L)×100%。
1.5 阻抗測量與計算
細胞阻抗Z*=|Z*|×e-jθ=Z′+jZ″，通過測量的阻抗幅模量|Z*|和相位角θ，得到阻抗實部Z′=|Z*|cosθ，虛部Z″=|Z*|sinθ，實部增量ΔZ′=Z′-Z′100，虛部增量ΔZ″=Z″-Z″0.01，幅模增量Δ|Z*|=|Z*|-|Z*|100，相位角增量Δθ=θ-θ0.01，電場頻率f，角頻率ω=2πf，虛部單位j=-1，角標0.01和100分別表示頻率0.01 MHz和100 MHz。
2 結果
2.1 人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗譜
圖 1(a)表示人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗實部增量(ΔZ′)隨電場頻率(f)變化的頻譜(ΔZ′(f))。① ΔZ′(f)曲線隨電場頻率f變化：在f為0.01～0.1 MHz頻段，ΔZ′基本不變，表現電阻抗實部低頻極限值(ΔZ′0)的高電阻；在f為0.1～10 MHz頻段，ΔZ′由高電阻向低電阻變化；在f為10～100 MHz頻段，ΔZ′逐漸減小。② ΔZ′(f)頻譜曲線隨CVF變化：隨CVF增加，肝癌SMMC-7721細胞的ΔZ′0隨之增加。
圖1
人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗頻譜
(a)
(a) the
圖 1(b)表示人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗虛部(ΔZ″)隨電場頻率(f)變化的頻譜[ΔZ″(f)]。在不考慮負號的情況下，ΔZ″(f)的表現：① ΔZ″(f)曲線隨電場頻率f發生較大變化，在f為0.01～1 MHz頻段形成一個峰值(ΔZ″P)，對應于第一特征頻率(fC1)；在f為1~100 MHz頻段先出現波谷，隨后ΔZ″(f)曲線上升。② ΔZ″P隨CVF增大而增加，而fC1基本不變。
圖 1(c)表示四種CVF的肝癌SMMC-7721細胞的復阻抗平面圖，橫坐標是電阻抗實部增量ΔZ′，縱坐標是電阻抗虛部增量ΔZ″，此圖稱為Nyquist圖。Nyquist圖的曲線以右截距ΔZ′0為起點，隨著角頻率(ω=2πf)的增加，向左延伸形成一個半圓弧和一個翹尾；半圓弧的圓心低于橫坐標，半圓弧的頂點是fC1，頂點到橫坐標的距離為ΔZ″P。隨CVF增加，Nyquist曲線的面積和半徑增大，曲線的位置擴展性向右平移，引起ΔZ′0和ΔZ″P變大。
2.2 人肝癌SMMC-7721細胞Bode圖和Nichols圖
圖 2(a)表示人肝癌SMMC-7721細胞的幅-頻特性曲線。① 電阻抗幅模量(Δ|Z*|)曲線隨外加電場頻率f的變化：在f為0.01～0.1 MHz頻段，Δ|Z*|表現為幅模量低頻極限值(Δ|Z*|0)；在f為 0.1～10 MHz頻段，Δ|Z*|由高幅模量向低幅模量變化；在f為10～100 MHz頻段，Δ|Z*|逐漸減小。② 隨CVF增加，Δ|Z*|曲線左側明顯抬升，導致Δ|Z*|0隨之增加。
圖2
人肝癌SMMC-7721細胞的Bode圖和Nichols圖
(a)幅-頻特性曲線；(b)相-頻特性曲線；(c)Nichols圖
Figure2. Bode and Nichols plots of human hepatoma SMMC-7721 cells(a) amplitude-frequency characteristic curve; (b) phase-frequency characteristic curve; (c) Nichols plot
圖 2(b)表示人肝癌SMMC-7721細胞的相-頻特性曲線。在不考慮負號的情況下:① 在0.01～1 MHz頻段，形成峰值ΔθP，其對應的頻率為第二特征頻率(fC2)，在1～100 MHz頻率段先形成波谷，后上揚；② 隨CVF增加，ΔθP也隨之增大，而fC2基本不變。
圖 2(c)表示四種不同CVF的人肝癌SMMC-7721細胞的Nichols圖，它與圖 1(c)曲線類似。當不考慮負號的情況下，Nichols圖曲線以右截距logΔ|Z*|0為起點，隨著ω的增加，形成半圓弧和翹尾的曲線，第二特征頻率(fC2)是圓弧頂點頻率，頂點到橫坐標的距離為相位角峰值(ΔθP)。隨CVF增加，log△|Z*|0、ΔθP、圓弧的面積和半徑隨之增大。
在不考慮負號的情況下，由表 1可知，隨CVF的增加，人肝癌SMMC-7721細胞的電阻抗參數(ΔZ′0、Δ|Z*|0、ΔZ″P、LogΔ |Z*|0、ΔθP)均增大，表現出與CVF的依存關系。
表1
CVF對人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗特性的影響
Table1.
Effect of CVF on the electrical impedance properties of human hepatoma SMMC-7721 cells
3 討論
圖 3(a)是細胞懸浮在直流電場時，細胞內外的離子就會受到電場的作用，發生定向移動，陽離子向負極移動，陰離子向正極移動。由于細胞膜的存在，電荷受到細胞膜的物理阻隔，在細胞外：正電荷聚集在陽極側，負電荷聚集在負極側；在細胞內：負電荷聚集在陽極側，正電荷聚集在陰極側，在細胞膜上產生了正負離子分離現象，稱為細胞極化現象(cell polarization)[8]；圖 3(b)是細胞懸浮在交流低頻電場時[9]，由于低頻電場的正負極方向變換頻次較低，導致細胞內外的離子移動速度就慢，引起細胞極化效應和強度就強，相當于細胞膜電容處于開路狀態，表現為電容性阻抗增大，電流只好在低電阻區域的細胞外流動；圖 3(c)是細胞懸浮在交流高頻電場時，由于高頻電場的正負極方向切換頻次高，導致細胞內外的離子移動速度較快，細胞幾乎不產生極化現象，相當于細胞膜電容性短路，表現為低電阻，電流容易流經低阻的細胞內。細胞極化過程可以利用交流電阻抗方法測量，即采用激勵電壓V(ω)與響應電流I(ω)之比的復數電阻抗[Z(ω)=V(ω)/I(ω)]方式，實現細胞電阻抗頻譜測量。
圖3
細胞極化現象
(a)直流電場致細胞極化;(b)低頻電場致細胞極化;(c)高頻電場對細胞的影響
Figure3. Cell polarization phenomena(a) polarization of cell controlled by dc electric field; (b) polarization of cell controlled by low frequency electric field; (c) the effect of cell with high frequency electric field
從圖 1(a)、圖 2(a)以及表 1可知：人肝癌SMMC-7721細胞電阻抗特征：① 細胞的頻率依存性：隨著頻率的遞增，電阻抗實部增量(ΔZ′)和幅模增量(Δ|Z*|)逐漸減小，出現了低頻極限增量(ΔZ′0、Δ|Z*|0)高值現象。其原因可以采用細胞膜電阻R和細胞膜電容C的并聯等效電路模型[7]進行解釋：當電場頻率處在低頻段時，膜電容處于開路狀態，表現為電容性阻抗(ZC=1/jωC)增強，低頻極限增量(ΔZ′0、Δ|Z*|0)呈現高值；當電場頻率由低頻向高頻逐漸增加時，電容性阻抗(ZC)也逐漸相應減小；當電場處于高頻時，電容性阻抗(ZC)最低，故出現了圖 1(a)、圖 2(a)中隨頻率變化的現象；② CVF依存性：隨CVF遞增，肝癌SMMC-7721細胞的低頻極限增量(ΔZ′0、Δ|Z*|0)明顯增加。其原因：當CVF增大時，即單位體積內細胞密度增大時，單位體積內細胞極化的膜表面積也會隨之增大，必然導致測量的阻抗值增大[10]，從而導致阻抗增量的增大。所以，低頻極限增量值(ΔZ′0、Δ|Z*|0)可以反映單位體積下的細胞數量或密度，已應用于無標記細胞培養過程的細胞計數檢測[11]。
在圖 1(b)，電阻抗虛部增量(ΔZ″)出現最大峰值(ΔZ″P)，說明在細胞膜與細胞外液的交界面，由外加電場誘發偶極的容抗，當外加電場頻率等于fC1時，產生了最大的響應；當外加電場頻率等于fC2時，在細胞膜與細胞質的交界面，電壓與電流之間的相位差，出現了最大變化，相應地在圖 2(b)出現了相位角增量最大峰值(ΔθP)。這兩個峰值(ΔZ″P、ΔθP)均隨CVF的增加而變大，其原因無外乎極化的細胞面積增多所致。
圖 1(b、c)和圖 2(b、c)中標出的兩個宏觀電阻抗特征頻率(fC1、fC2)分別表示肝癌SMMC-7721細胞兩個不同部位對外加電場響應的細胞電阻抗特征，根據fC1、fC2的數值，這兩個特征頻率均來自細胞膜的電荷極化，但是它們所處的細胞膜位置不同，即：fC1來源于發生在細胞膜與細胞外液交界面的電荷極化，它反映外加電場對此界面的頻率響應特征；fC2來源于發生在細胞膜與細胞質交界面的電荷極化，其反映外加電場對細胞膜與細胞質之間界面的頻率響應特征。這兩個宏觀的參數(fC1、fC2)可以反映發生在細胞膜與細胞外液交界或細胞質交界處的微觀充放電過程[12]。表明fC1和fC2均可反映細胞電阻抗特性，可用于細胞培養的病毒疫苗生產過程的在線監測[13]以及生物細胞質量監測(biomass monitoring)[12]。
由表 1可知，當CVF在23%～42%時，特征頻率(fC1、fC2)基本上與CVF的變化無關，特征頻率(fC1、fC2)可用于表示肝癌SMMC-7721細胞自身固有的電學特征指標，它可用于鑒定人肝癌細胞系SMMC-7721，為進一步肝細胞的生物電磁學的研究奠定了基礎。
4 結論
本文的細胞阻抗譜測量與分析結果表明，人肝癌SMMC-7721細胞的電阻抗具有三個特征：① 頻率依賴性，即隨電場頻率的遞增，電阻抗增量(ΔZ′、ΔZ″、Δ|Z*|)和相位角增量(Δθ)均增加；② CVF依存性，即隨CVF的遞增，低頻極限增量(ΔZ′0、Δ|Z*|0)、峰值(ΔZ″P、ΔθP)、曲線面積和半徑(Nyquist圖、Nichols圖)均隨之增大；③ 阻抗弛豫具有2個特征頻率(fC1、fC2)，fC1來源于細胞膜相與細胞外液相交界，fC2來源于細胞膜相與細胞質相交界，且CVF在23%~39%時，CVF對特征頻率(fC1、fC2)無影響。
本文的電阻抗頻譜方法可以應用于肝癌細胞電生理機制研究，為進一步開發抗腫瘤藥物，提供了研究手段和觀測指標，具有重要的理論價值和潛在的應用前景。
