為了構建pGenesil-1-Beclin1真核表達載體,并建立Beclin1穩定沉默的人成神經瘤SH-SY5Y細胞系,將合成的shRNA片段連接pGenesil-1質粒,構建成重組質粒pGenesil-1-Beclin1,轉化其至感受態大腸桿菌JM109,挑取陽性克隆進行雙酶切和DNA測序鑒定。常規培養SH-SY5Y細胞,將重組質粒pGenesil-1-Beclin1和空白對照質粒pGenesil-1轉染SH-SY5Y細胞,G418抗性篩選,在熒光顯微鏡下挑取單細胞克隆并擴大培養至穩定細胞株,經RT-PCR和Western blot 檢測Beclin1基因的表達。經酶切和DNA測序鑒定重組真核表達載體構建正確,成功篩選出兩株細胞系。和對照組轉染pGenesil-1的細胞系相比,轉染pGenesil-1-Beclin1 細胞系的Beclin1 mRNA表達下降71.28%±1.45%(P＜0.05),Beclin1蛋白表達下降75.50%±2.63%(P＜0.05)。提示已經成功構建pGenesil-1-Beclin1真核表達載體并建立了Beclin1基因穩定沉默的SH-SY5Y細胞系,為研究Beclin1功能提供了細胞模型。
引用本文： 魏傳杰, 肖雙, 江嵐, 譚琰, 黃波, 龍鼎新. 穩定沉默Beclin1的人成神經瘤SH-SY5Y細胞系的構建. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(5): 1085-1089. doi: 10.7507/1001-5515.20140204 復制
引言
自噬是真核生物中一種進化上高度保守的、用于降解和回收利用細胞內生物大分子和受損細胞器的過程。自噬過度發生會誘導細胞死亡，被稱為II型程序性細胞死亡，其參與了人類多種疾病的發生發展[1-2]。Beclin1是第一個被確認的調控哺乳動物自噬的基因，其編碼的蛋白可調控自噬前體的形成，引導相關蛋白定位于自噬體膜[3]。RNA干擾是內源性或外源性雙鏈RNA在生物體內誘導同源靶基因的mRNA特異降解的一種現象，由于可使靶蛋白表達受阻，所以是一種重要的基因沉默手段。本研究構建重組質粒pGenesil-1-Beclin1并將其轉染SH-SY5Y細胞，建立穩定表達pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y的細胞系，為進一步研究細胞自噬提供了細胞實驗模型。
1 材料和方法
1.1 材料與儀器
SH-SY5Y細胞系由中國科學院動物研究所分子毒理學實驗室惠贈；pGenesil-1由重慶郵電大學常平安博士惠贈；JM109由本實驗室保存；限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及T4 DNA連接酶購自TAKARA公司；胰蛋白胨、酵母粉購自OXOID公司；DMEM培養基和anti-Beclin1單克隆抗體購自Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素購自華北制藥有限公司；胰蛋白酶、ECL發光液購自碧云天生物技術研究所；G418購自Merck公司；Vigofect轉染試劑購自北京威格拉斯生物技術有限公司；PCR引物合成于Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自Thermo公司；抗兔IgG-HRP、抗鼠IgG-HRP購自IHL公司；熒光倒置顯微鏡(Leica公司)；Tanon6200凝膠成像系統。
1.2 方法
1.2.1 shRNA設計
根據shRNA設計原則和人的Beclin1 mRNA序列(Genebank Accession：NM_003766.3)，選擇靶位點序列5′-CAGTTTGGCA CAATCAATA-3′，在寡核苷酸片段的5′和3′端引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，使其能夠和pGenesil-1載體相連接；在序列中間插入9個核苷酸TTCAAGACG的序列形成發卡形狀的環狀結構。其合成片段示意為BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+HindⅢ。
Beclin1的RNA干擾序列為
For5′-GATCCCCCAGTTTGGCACAATCAA TATTCAAGAGATATTGATTGTGCCAAACTG TTTTTGGAAA-3′
Rev5′-AGCTTTTCCAAAAACAGTTTGGC ACAATCAATATCTCTTGAATATTGATTGTG CCAAACTGGGG-3′
1.2.2 pGenesil-1-Beclin1表達載體的構建
取pGenesil-1空質粒用內切酶BamHⅠ和 HindⅢ于37 ℃雙酶切2 h，然后膠回收雙酶切后的大片段。將退火后的雙鏈與線性化的載體按照摩爾比3：1于16 ℃過夜連接。取連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109，涂于含有卡拉霉素(50 μg/mL)的LB瓊脂板，置于37 ℃生化培養箱中培養12~16 h。挑取單克隆菌落接種于含有卡拉霉素(50 μg/mL)的LB培養基中，37 ℃恒溫搖床過夜。用小提質粒試劑盒提取質粒，用內切酶EcoRⅠ、HindⅢ對新提取的質粒進行雙酶切鑒定，將鑒定成功的重組質粒送Invitrogen公司測序。
1.2.3 SH-SY5Y細胞培養與轉染
將SH-SY5Y細胞培養于直徑60 mm的塑料平皿中，加入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，37 ℃，5%的二氧化碳培養箱中培養。細胞培養液每隔一天更換一次，取生長對數期的細胞進行實驗。將SH-SY5Y細胞培養于直徑為60 mm的培養皿中，待細胞生長匯合度為70%~80%時，分別轉染pGenesil-1-Beclin1重組質粒和pGenesil-1，轉染方法按照Vigofect轉染試劑說明書。轉染后48 h去除培養基更換新鮮的完全培養基。
1.2.4 G418工作濃度確定和細胞篩選與鑒定
常規培養SH-SY5Y細胞于24孔板中，待細胞匯合度為50%時，每孔加入培養基500 μL，設定G418濃度梯度分別為0、200、300、400、500、600、700、800 μg/mL，每個濃度設3個復孔。2~3 d更換培養基，并保持G418濃度不變，培養10~14 d。選取SH-SY5Y細胞剛好全部死亡的G418濃度為最佳細胞篩選濃度。轉染細胞24~48 h后，按照1：15傳代。用最佳細胞篩選濃度的G418進行篩選，每3 d更換含G418培養液，2~3周后生長出單克隆細胞，在熒光顯微鏡下標定位置，挑出細胞團，采取有限稀釋法，接種于96孔板，使每孔只有一個細胞。待細胞長滿后逐級擴大培養，繼續G418加壓培養，直至獲得穩定的單克隆細胞系，并以不影響細胞生長的G418濃度維持篩選基因表達。
1.2.5 RT-PCR檢測Beclin1 mRNA表達變化
收集穩轉pGenesil-1和穩轉pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y細胞，采用Trizol法提取總RNA。按照Thermo逆轉錄試劑盒說明書生成cDNA，PCR反應條件，Beclin1：94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min擴增30個循環，擴增產物為268 bp；GAPDH：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min擴增25循環，產物為450 bp。PCR產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，Quantity One軟件測定分析結果。PCR反應引物如下：
Beclin1-for 5′-AGAACCGCAAGATAGTGGCA-3′
Beclin1-rev 5′-CGACCCAGCCTGAAGTTATT-3′
GAPDH-for 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′
GAPDH-rev 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′
1.2.6 Western blot檢測Beclin1表達變化
收集穩轉pGenesil-1和穩轉pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y細胞，放射免疫沉淀測定法(Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA)測定細胞裂解液抽提蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。所得蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，其中分離膠濃度為10%。將電泳后的蛋白膠進行濕法轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，與1∶1 000稀釋后一抗(鼠抗Beclin1抗體)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，然后與1∶5 000稀釋后二抗(HRP標記抗鼠IgG)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。加入發光底物Super ECL Plus，用凝膠成像系統顯影曝光。
1.2.7 統計學分析
各組實驗重復3次，采用SPSS 16.0 統計軟件進行分析，實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 重組質粒的酶切和測序鑒定
將小提后的質粒用內切酶EcoRⅠ、HindⅢ進行雙酶切，pGenesil-1的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點之間的大小約364 bp，連接后的重組質粒pGenesil-1-Beclin1的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點之間的大小約398 bp，結果表明已經成功將shRNA片段連入pGenesil-1質粒。將鑒定成功的重組質粒送Invitrogen公司測序，測序結果和設計引物的序列完全一致，表明成功構建了pGenesil-1-Beclin1真核表達載體，如圖 1所示。
圖1
pGenesil-1-Beclin1真核表達載體的鑒定
M：marker；1：pGenesil-1(364 bp)；2：pGenesil-1-Beclin1(398 bp)；
Figure1. Identification of the eukaryotic expression vector of pGenesil-1-Beclin1M:marker; 1:pGenesil-1(364 bp); 2:pGenesil-1-Beclin1(398 bp);
2.2 G418篩選濃度的確定
將G418分為7個濃度梯度組(200、300、400、500、600、700、800 μg/mL)和一個對照組(0 μg/mL)處理培養的SH-SY5Y細胞，每2 d更換培養液并保持G418的濃度不變，并在顯微鏡下觀察細胞的生長狀況和形態。開始每個孔內細胞密度約50%~60%，生長旺盛、形態正常；G418加壓培養3 d，700 μg/mL和800 μg/mL孔中有部分細胞開始出現死亡，細胞生長基本停滯，對照孔細胞已布滿孔底，消化去除多余的細胞；6 d，700 μg/mL和800 μg/mL孔中細胞已全部死亡漂浮于培養液中，600 μg/mL孔細胞有部分細胞死亡，細胞生長基本停滯，細胞萎縮；9 d，600 μg/mL孔中大部分細胞死亡，僅存零星細胞貼壁存活，細胞狀態差；11 d，600 μg/mL孔細胞全部死亡，細胞萎縮變圓并漂浮于培養液中，其余G418濃度組細胞僅部分死亡，因此選取600 μg/mLG418濃度為SH-SY5Y細胞的最佳篩選濃度，如圖 2所示。200 μg/mL的G418對細胞影響不明顯，對照孔細胞生長狀態良好，故選取200 μg/mL作為維持篩選基因表達的壓力濃度。
圖2
G418 (600 μg/mL)處理SH-SY5Y細胞不同時期的細胞形態(20×)
Figure2.
Morphology of SH-SY5Y cells in different period after treated by G418 (600 μg/mL) (20×)
2.3 成功轉染和篩選表達Beclin1-shRNA基因的SH-SY5Y細胞系
利用脂質體法將pGenesil-1-Beclin1重組質粒和pGenesil-1空質粒轉染SH-SY5Y細胞，48 h后按照1∶15進行傳代并加入含有600 μg/mL G418的培養基進行加壓篩選，每隔2 d更換相同G418濃度的培養基。篩選10 d后大部分細胞已經死亡，少部分耐受G418的細胞形成單克隆細胞群落，在熒光顯微鏡下標記其位置，并挑取單克隆群落到96孔板中培養，繼續G418加壓處理，并逐級擴大培養，200 μg/mL G418維持篩選基因表達。熒光顯微鏡下觀察顯示細胞形態正常，每個細胞均發出綠色熒光，如圖 3所示。
圖3
穩定表達Beclin1-shRNA基因的SH-SY5Y細胞系在不同倍鏡下的細胞形態
Figure3.
Morphology of SH-SY5Y cell lines with inhibited Beclin1 expression in different amplification factor
2.4 穩定轉染pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y細胞中Beclin1基因表達下調
選取兩株穩定表達pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y細胞系，測定其總RNA和總蛋白，數字以檢測Beclin1基因的表達情況。RT-PCR結果顯示穩轉pGenesil-1-Beclin1細胞的mRNA表達水平與穩轉pGenesil-1的細胞相比降低71.28%±1.45%(P＜0.05)。Western blot檢測結果顯示，穩轉pGenesil-1-Beclin1的細胞系比穩轉pGenesil-1的細胞系Beclin1蛋白表達降低75.50%±2.63%(P＜0.05)，如圖 4所示。
圖4
轉染pGenesil-1-Beclin1穩定細胞系Beclin1基因表達
(a) RT-PCR檢測兩種細胞株Beclin1 mRNA表達；(b) Western blot檢測兩種細胞株Beclin1蛋白表達。*兩組間比較，
(a) mRNA expression of Beclin1 in transfected cells detected by RT-PCR; (b) Protein expression of Beclin1 in transfected cells detected by western blotting. *comparing between the two groups,
3 討論
自噬是廣泛存在于真核生物的一種生命現象，與細胞的生長、分化、增殖、死亡的發生過程密切相關。自噬主要是溶酶體結合由雙層膜包裹的蛋白質、細胞器、細胞代謝物等待降解物形成自噬體進行多種酶消化和降解的過程，分解的產物可被細胞再次利用以滿足細胞代謝和細胞器的更新，對維護細胞內環境穩定有重要的作用[4-5]。Beclin1是酵母菌Atg6在哺乳動物內的同源基因，其編碼的蛋白在自噬的形成中起重要作用，Zhao等[6]利用RNAi干擾人成神經瘤細胞Beclin1基因的表達，自噬標志蛋白LC3 II表達顯著降低。Yue等[7]研究表明，敲除Beclin1基因的小鼠胚胎干細胞死于胚胎早期，Beclin1表達降低的胚胎也不能存活超過8.5 d，其原因可能是自噬對于提高細胞適應能力，維持內環境的穩定是必需的。Beclin1不僅是自噬基因而且還是重要的抑癌基因，Liang等[8]將Beclin1穩定轉染進MCF-7人乳腺癌細胞可以促進自噬的產生和降低腫瘤細胞的惡變性。Beclin1基因的表達降低會促進腫瘤的產生，據研究表明40%的前列腺癌、50%的乳腺癌、70%的卵巢癌[8-9]與Beclin1的表達減低有關。
pGenesil-1質粒載體是能在哺乳動物中高表達shRNA的真核表達載體，該載體還連接有綠色熒光蛋白報告基因和抗Neomycin基因，為后續的熒光顯微鏡的觀察和G418篩選提供了基礎。本課題組利用脂質體轉染法將構建好的pGenesil-1-Beclin1重組載體轉染SH-SY5Y細胞，經G418篩選得到穩定單克隆細胞系。RT-PCR和Western blot檢測表明Beclin1基因表達顯著降低，最終成功獲得干擾Beclin1表達的SH-SY5Y細胞系，為進一步研究Beclin1蛋白的作用提供了細胞模型。
引言
自噬是真核生物中一種進化上高度保守的、用于降解和回收利用細胞內生物大分子和受損細胞器的過程。自噬過度發生會誘導細胞死亡，被稱為II型程序性細胞死亡，其參與了人類多種疾病的發生發展[1-2]。Beclin1是第一個被確認的調控哺乳動物自噬的基因，其編碼的蛋白可調控自噬前體的形成，引導相關蛋白定位于自噬體膜[3]。RNA干擾是內源性或外源性雙鏈RNA在生物體內誘導同源靶基因的mRNA特異降解的一種現象，由于可使靶蛋白表達受阻，所以是一種重要的基因沉默手段。本研究構建重組質粒pGenesil-1-Beclin1并將其轉染SH-SY5Y細胞，建立穩定表達pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y的細胞系，為進一步研究細胞自噬提供了細胞實驗模型。
1 材料和方法
1.1 材料與儀器
SH-SY5Y細胞系由中國科學院動物研究所分子毒理學實驗室惠贈；pGenesil-1由重慶郵電大學常平安博士惠贈；JM109由本實驗室保存；限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及T4 DNA連接酶購自TAKARA公司；胰蛋白胨、酵母粉購自OXOID公司；DMEM培養基和anti-Beclin1單克隆抗體購自Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素購自華北制藥有限公司；胰蛋白酶、ECL發光液購自碧云天生物技術研究所；G418購自Merck公司；Vigofect轉染試劑購自北京威格拉斯生物技術有限公司；PCR引物合成于Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自Thermo公司；抗兔IgG-HRP、抗鼠IgG-HRP購自IHL公司；熒光倒置顯微鏡(Leica公司)；Tanon6200凝膠成像系統。
1.2 方法
1.2.1 shRNA設計
根據shRNA設計原則和人的Beclin1 mRNA序列(Genebank Accession：NM_003766.3)，選擇靶位點序列5′-CAGTTTGGCA CAATCAATA-3′，在寡核苷酸片段的5′和3′端引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，使其能夠和pGenesil-1載體相連接；在序列中間插入9個核苷酸TTCAAGACG的序列形成發卡形狀的環狀結構。其合成片段示意為BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+HindⅢ。
Beclin1的RNA干擾序列為
For5′-GATCCCCCAGTTTGGCACAATCAA TATTCAAGAGATATTGATTGTGCCAAACTG TTTTTGGAAA-3′
Rev5′-AGCTTTTCCAAAAACAGTTTGGC ACAATCAATATCTCTTGAATATTGATTGTG CCAAACTGGGG-3′
1.2.2 pGenesil-1-Beclin1表達載體的構建
取pGenesil-1空質粒用內切酶BamHⅠ和 HindⅢ于37 ℃雙酶切2 h，然后膠回收雙酶切后的大片段。將退火后的雙鏈與線性化的載體按照摩爾比3：1于16 ℃過夜連接。取連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109，涂于含有卡拉霉素(50 μg/mL)的LB瓊脂板，置于37 ℃生化培養箱中培養12~16 h。挑取單克隆菌落接種于含有卡拉霉素(50 μg/mL)的LB培養基中，37 ℃恒溫搖床過夜。用小提質粒試劑盒提取質粒，用內切酶EcoRⅠ、HindⅢ對新提取的質粒進行雙酶切鑒定，將鑒定成功的重組質粒送Invitrogen公司測序。
1.2.3 SH-SY5Y細胞培養與轉染
將SH-SY5Y細胞培養于直徑60 mm的塑料平皿中，加入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，37 ℃，5%的二氧化碳培養箱中培養。細胞培養液每隔一天更換一次，取生長對數期的細胞進行實驗。將SH-SY5Y細胞培養于直徑為60 mm的培養皿中，待細胞生長匯合度為70%~80%時，分別轉染pGenesil-1-Beclin1重組質粒和pGenesil-1，轉染方法按照Vigofect轉染試劑說明書。轉染后48 h去除培養基更換新鮮的完全培養基。
1.2.4 G418工作濃度確定和細胞篩選與鑒定
常規培養SH-SY5Y細胞于24孔板中，待細胞匯合度為50%時，每孔加入培養基500 μL，設定G418濃度梯度分別為0、200、300、400、500、600、700、800 μg/mL，每個濃度設3個復孔。2~3 d更換培養基，并保持G418濃度不變，培養10~14 d。選取SH-SY5Y細胞剛好全部死亡的G418濃度為最佳細胞篩選濃度。轉染細胞24~48 h后，按照1：15傳代。用最佳細胞篩選濃度的G418進行篩選，每3 d更換含G418培養液，2~3周后生長出單克隆細胞，在熒光顯微鏡下標定位置，挑出細胞團，采取有限稀釋法，接種于96孔板，使每孔只有一個細胞。待細胞長滿后逐級擴大培養，繼續G418加壓培養，直至獲得穩定的單克隆細胞系，并以不影響細胞生長的G418濃度維持篩選基因表達。
1.2.5 RT-PCR檢測Beclin1 mRNA表達變化
收集穩轉pGenesil-1和穩轉pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y細胞，采用Trizol法提取總RNA。按照Thermo逆轉錄試劑盒說明書生成cDNA，PCR反應條件，Beclin1：94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min擴增30個循環，擴增產物為268 bp；GAPDH：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min擴增25循環，產物為450 bp。PCR產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，Quantity One軟件測定分析結果。PCR反應引物如下：
Beclin1-for 5′-AGAACCGCAAGATAGTGGCA-3′
Beclin1-rev 5′-CGACCCAGCCTGAAGTTATT-3′
GAPDH-for 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′
GAPDH-rev 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′
1.2.6 Western blot檢測Beclin1表達變化
收集穩轉pGenesil-1和穩轉pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y細胞，放射免疫沉淀測定法(Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA)測定細胞裂解液抽提蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。所得蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，其中分離膠濃度為10%。將電泳后的蛋白膠進行濕法轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，與1∶1 000稀釋后一抗(鼠抗Beclin1抗體)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，然后與1∶5 000稀釋后二抗(HRP標記抗鼠IgG)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。加入發光底物Super ECL Plus，用凝膠成像系統顯影曝光。
1.2.7 統計學分析
各組實驗重復3次，采用SPSS 16.0 統計軟件進行分析，實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 重組質粒的酶切和測序鑒定
將小提后的質粒用內切酶EcoRⅠ、HindⅢ進行雙酶切，pGenesil-1的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點之間的大小約364 bp，連接后的重組質粒pGenesil-1-Beclin1的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點之間的大小約398 bp，結果表明已經成功將shRNA片段連入pGenesil-1質粒。將鑒定成功的重組質粒送Invitrogen公司測序，測序結果和設計引物的序列完全一致，表明成功構建了pGenesil-1-Beclin1真核表達載體，如圖 1所示。
圖1
pGenesil-1-Beclin1真核表達載體的鑒定
M：marker；1：pGenesil-1(364 bp)；2：pGenesil-1-Beclin1(398 bp)；
Figure1. Identification of the eukaryotic expression vector of pGenesil-1-Beclin1M:marker; 1:pGenesil-1(364 bp); 2:pGenesil-1-Beclin1(398 bp);
2.2 G418篩選濃度的確定
將G418分為7個濃度梯度組(200、300、400、500、600、700、800 μg/mL)和一個對照組(0 μg/mL)處理培養的SH-SY5Y細胞，每2 d更換培養液并保持G418的濃度不變，并在顯微鏡下觀察細胞的生長狀況和形態。開始每個孔內細胞密度約50%~60%，生長旺盛、形態正常；G418加壓培養3 d，700 μg/mL和800 μg/mL孔中有部分細胞開始出現死亡，細胞生長基本停滯，對照孔細胞已布滿孔底，消化去除多余的細胞；6 d，700 μg/mL和800 μg/mL孔中細胞已全部死亡漂浮于培養液中，600 μg/mL孔細胞有部分細胞死亡，細胞生長基本停滯，細胞萎縮；9 d，600 μg/mL孔中大部分細胞死亡，僅存零星細胞貼壁存活，細胞狀態差；11 d，600 μg/mL孔細胞全部死亡，細胞萎縮變圓并漂浮于培養液中，其余G418濃度組細胞僅部分死亡，因此選取600 μg/mLG418濃度為SH-SY5Y細胞的最佳篩選濃度，如圖 2所示。200 μg/mL的G418對細胞影響不明顯，對照孔細胞生長狀態良好，故選取200 μg/mL作為維持篩選基因表達的壓力濃度。
圖2
G418 (600 μg/mL)處理SH-SY5Y細胞不同時期的細胞形態(20×)
Figure2.
Morphology of SH-SY5Y cells in different period after treated by G418 (600 μg/mL) (20×)
2.3 成功轉染和篩選表達Beclin1-shRNA基因的SH-SY5Y細胞系
利用脂質體法將pGenesil-1-Beclin1重組質粒和pGenesil-1空質粒轉染SH-SY5Y細胞，48 h后按照1∶15進行傳代并加入含有600 μg/mL G418的培養基進行加壓篩選，每隔2 d更換相同G418濃度的培養基。篩選10 d后大部分細胞已經死亡，少部分耐受G418的細胞形成單克隆細胞群落，在熒光顯微鏡下標記其位置，并挑取單克隆群落到96孔板中培養，繼續G418加壓處理，并逐級擴大培養，200 μg/mL G418維持篩選基因表達。熒光顯微鏡下觀察顯示細胞形態正常，每個細胞均發出綠色熒光，如圖 3所示。
圖3
穩定表達Beclin1-shRNA基因的SH-SY5Y細胞系在不同倍鏡下的細胞形態
Figure3.
Morphology of SH-SY5Y cell lines with inhibited Beclin1 expression in different amplification factor
2.4 穩定轉染pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y細胞中Beclin1基因表達下調
選取兩株穩定表達pGenesil-1-Beclin1的SH-SY5Y細胞系，測定其總RNA和總蛋白，數字以檢測Beclin1基因的表達情況。RT-PCR結果顯示穩轉pGenesil-1-Beclin1細胞的mRNA表達水平與穩轉pGenesil-1的細胞相比降低71.28%±1.45%(P＜0.05)。Western blot檢測結果顯示，穩轉pGenesil-1-Beclin1的細胞系比穩轉pGenesil-1的細胞系Beclin1蛋白表達降低75.50%±2.63%(P＜0.05)，如圖 4所示。
圖4
轉染pGenesil-1-Beclin1穩定細胞系Beclin1基因表達
(a) RT-PCR檢測兩種細胞株Beclin1 mRNA表達；(b) Western blot檢測兩種細胞株Beclin1蛋白表達。*兩組間比較，
(a) mRNA expression of Beclin1 in transfected cells detected by RT-PCR; (b) Protein expression of Beclin1 in transfected cells detected by western blotting. *comparing between the two groups,
3 討論
自噬是廣泛存在于真核生物的一種生命現象，與細胞的生長、分化、增殖、死亡的發生過程密切相關。自噬主要是溶酶體結合由雙層膜包裹的蛋白質、細胞器、細胞代謝物等待降解物形成自噬體進行多種酶消化和降解的過程，分解的產物可被細胞再次利用以滿足細胞代謝和細胞器的更新，對維護細胞內環境穩定有重要的作用[4-5]。Beclin1是酵母菌Atg6在哺乳動物內的同源基因，其編碼的蛋白在自噬的形成中起重要作用，Zhao等[6]利用RNAi干擾人成神經瘤細胞Beclin1基因的表達，自噬標志蛋白LC3 II表達顯著降低。Yue等[7]研究表明，敲除Beclin1基因的小鼠胚胎干細胞死于胚胎早期，Beclin1表達降低的胚胎也不能存活超過8.5 d，其原因可能是自噬對于提高細胞適應能力，維持內環境的穩定是必需的。Beclin1不僅是自噬基因而且還是重要的抑癌基因，Liang等[8]將Beclin1穩定轉染進MCF-7人乳腺癌細胞可以促進自噬的產生和降低腫瘤細胞的惡變性。Beclin1基因的表達降低會促進腫瘤的產生，據研究表明40%的前列腺癌、50%的乳腺癌、70%的卵巢癌[8-9]與Beclin1的表達減低有關。
pGenesil-1質粒載體是能在哺乳動物中高表達shRNA的真核表達載體，該載體還連接有綠色熒光蛋白報告基因和抗Neomycin基因，為后續的熒光顯微鏡的觀察和G418篩選提供了基礎。本課題組利用脂質體轉染法將構建好的pGenesil-1-Beclin1重組載體轉染SH-SY5Y細胞，經G418篩選得到穩定單克隆細胞系。RT-PCR和Western blot檢測表明Beclin1基因表達顯著降低，最終成功獲得干擾Beclin1表達的SH-SY5Y細胞系，為進一步研究Beclin1蛋白的作用提供了細胞模型。
