測定血清中肌酐的濃度是臨床上診斷腎功能的一項重要指標。在利用偶聯酶法測定的過程中,一種關鍵酶——肌氨酸氧化酶(SOX)(EC 1.5.3.1)的質量控制是我們首先要解決的一個重要問題。本文利用乳糖誘導重組肌氨酸氧化酶(r-SOX)基因在E.coli中高效表達,經300 L發酵罐發酵培養,菌體終密度達到OD600值22,菌體濕重達30 g/L,濕菌體含活性20 U/g。重組肌氨酸氧化酶表達量占菌體可溶性蛋白的25%左右。菌體破碎液經55 ℃選擇性熱變性處理和Ni-Sepharose FF層析二步純化,經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析酶的純度達97%以上,比活力達25 U/mg,純化倍數為14.4,活性收率為92.4%。純化的酶經SDS-PAGE和分子篩層析法測定,其分子量分別為53 kD和55 kD,提示該酶結構為單一肽鏈。純化的酶液和凍干粉均呈黃色,經三氯乙酸和熱變性處理,發現其與核黃素以共價鍵的方式結合。此外,對該酶的穩定性和其中的干擾酶過氧化氫酶也做了進一步的考察。以上所取得的研究結果為此酶的開發和利用奠定了基礎。
引用本文： 蒲靜, 王瑞, 姚明東, 何中杰, 趙明, 孟堯. 重組肌氨酸氧化酶的制備和鑒定. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(5): 1090-1096. doi: 10.7507/1001-5515.20140205 復制
引言
血清中的肌酐濃度是臨床上診斷腎功能的一項重要指標。目前肌酐的測定常用Jaffe法，由于該方法以化學反應為基礎，受血清中許多化學物質的干擾，特異性較差，給疾病的正確診斷帶來一定困難，所以逐漸被具有高專一性、高靈敏度、快速自動化等優點的偶聯酶法試劑盒所取代[1-2]。在酶法肌酐測定中，肌酐在一系列的酶促催化過程中生成肌氨酸，所生成的肌氨酸可以在肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase,SOX)作用下分解成甘氨酸、甲醛和H2O2[3]，其中偶聯甲醛脫氫酶可定量甲醛含量，也可以采用偶聯過氧化物酶測定H2O2的方法，來間接反映出樣品中肌酐的含量[4-7]。因此，SOX是偶聯酶法測定肌酐的關鍵酶之一[8]。另外，偶聯酶法試劑盒除了對參與反應的酶要求具有較高的純度之外，還要將干擾酶尤其是過氧化氫酶等控制在很低的范圍內，否則將影響測定結果。
基因工程技術是解決診斷試劑盒工具酶來源的有效方法之一，不但能大大降低生產成本，也易于去除目的酶中的干擾酶。目前國內外已有將SOX基因克隆表達的報道[9-13]，而對于有關重組肌氨酸氧化酶(recombinant SOX,r-SOX)基因工程菌的發酵罐培養和較大量制備酶制劑的研究卻鮮有報道，因此開展此項研究工作顯得很有必要。
本文主要討論經300 L發酵罐培養，對采用乳糖誘導表達SOX基因工程菌的發酵培養條件及酶的純化工藝和質控檢測進行研究，期望研究結果可為此酶的開發和利用奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料和設備
1.1.1 主要試劑
Bacillus SP.肌氨酸氧化酶基因E.coli BL21(DE3)工程菌由中國科學院微生物研究所構建；肌氨酸(sarcosine)和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)購自Aladdin公司；甘氨酸(glycine)購自Amresco公司；酵母膏(Yeast Extract)和蛋白胨(tryptone)購自OXOID公司；丙烯酰胺(acrylamide,Acr)、N,N′-甲叉雙丙烯酰胺(methylene bisacrylamide,Bis)和SDS購自Biomol公司；Ni Sepahrose FF和LMW calibration Kit購自Pharmacia公司；過氧化物酶(peroxidase)購自TOYOBO公司；兩性電解質(ampholytes)購自Bio-Rad公司。其余試劑均為國產分析純。
1.1.2 主要儀器
300 L發酵罐(上海保興生物設備工程有限公司)；高速冷凍離心機(Eppendorf 5804R)；紫外可見分光光度計(UnicoTM UC-2102 PC，上海第三分析儀器廠)；電泳系統(Bio-Rad公司Power PAC300)；凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司76S/02324)；GEA高壓均質機(上海東華高壓均質機廠)；GQ75B高速管式離心機(上海浦東天本離心機機械有限公司)；Mini-protean Ⅲ 電泳槽(Bio-Rad)；Beckman Avanti J-20XP高速冷凍離心機；冷卻罐(溫州市商泰輕工機械有限公司)；Mini Pellicon及Pellicon超濾系統(Millipore公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 重組肌氨酸氧化酶基因工程菌的培養[14 -16 ]
將甘油保存的肌氨酸氧化酶基因工程菌接入試管斜面培養基(LB培養基)上，37 ℃活化3~4次。挑取生長飽滿的菌落轉接入試管液體培養基，37 ℃ 200 r/min旋轉搖床培養15 h。按5%接種量接入搖瓶(LB培養基)，同樣條件下培養即為發酵罐用種子培養液。發酵罐培養基由1.2%蛋白胨、2.4%酵母膏、0.2%NaCl、0.6% K2HPO4、0.7% Na2HPO4組成，pH維持在6.0~7.5。將培養基裝入300 L發酵罐(工作體積260~270 L)，在1.034×105 Pa壓力下滅菌30 min。冷卻至40~45 ℃，按5%接種量接入種子菌種液并加入適量消泡劑(盈智有機硅材料有限公司,廣東佛山)。設置37 ℃、200 r/min和氧體積分數控制在25%。進行初始發酵培養，隔時間取樣分析生物量和pH變化。當菌體進入對數生長期時，將發酵罐溫度降到25 ℃，加入乳糖，使終濃度達40 mmol/L并調整氧體積分數為30%，開始誘導發酵。間隔2~3 h取樣分析，當生物量和活性基本恒定時停止發酵。
生物量的測定采用細菌光電比濁計數法，用分光光度計測OD600nm值表示菌體濃度。蛋白含量測定采用Bradford法[17]，以牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)為標準蛋白作為對照。酶活性測定[18]條件為37 ℃、pH 8.0，每分鐘生成1 μmol過氧化氫所需要的酶量定義為一個酶活性單位。具體測定過程為取1.0 mL工作液(含95 mmol/L 肌氨酸、0.47 mmol/L 4-氨基安替比林、5.2 U/mL過氧化物酶、Triton X-100 0.045%、2 mmol/L苯酚和48 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液)，加入0.05 mL適當稀釋的酶液，37 ℃下準確反應10 min，加入2.0 mL 0.25% SDS溶液終止反應，以酶稀釋液替代酶液做空白，于600 nm處測定OD值。
1.2.2 r-SOX的制備
(1)無細胞粗酶液的制備和選擇性熱變性處理[19]：取濕菌體1 kg，加入10 L 20 mmol/L、pH7.5 Tris-HCl緩沖液中預冷至4 ℃，用高壓勻質機在5.0×105 Pa條件下破碎，后經7 000 r/min離心20 min，收集上清液即無細胞粗酶液。將粗酶液以250~300 mL分裝于1 L的三角瓶中，放入55 ℃水浴中緩緩震搖，當粗酶液的溫度達到55 ℃時，處理20 min，并定時取樣分析酶活性來判斷熱處理效果。將熱處理后的酶液經5 000 r/min離心10 min后，棄去沉淀收集上清液，經0.45 μm膜過濾后進行Ni Sepharose FF親和層析。
(2)Ni-Sepharose FF親和層析：用0.5 mol/L NaCl、pH 7.5 40 mmol/L Tris-HCl緩沖液充分平衡柱，按說明書進行經預處理的Ni-Sepharose FF柱(500 mm×3 800 mm，有效凝膠體積為100 mL)，將經熱變性處理并交換成0.5 mol/L NaCl、pH 7.5 40 mmol/L Tris-HCl緩沖液體系的粗酶液分批(1 000 mL/次)上柱，流速2 mL/min，280 nm進行檢測。樣品上畢，用含20 mmol/L咪唑的平衡緩沖液充分洗滌雜蛋白至280 nm吸收值達記錄儀基線為止。然后用20倍凝膠體積的含20～400 mmol/L咪唑的平衡緩沖液進行線性梯度洗脫，10 mL/管分部收集，通過檢測酶活性收集酶活性峰部分。將此樣品液在pH 7.0、0.05 mol/L磷酸緩沖液的交換溶劑體系中用Biomax 5 kD的膜包濃縮至蛋白含量為30 mg/mL，經0.22 μm膜除菌，于4 ℃保存備用。
酶活性峰部分采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)[20]，4%濃縮膠，12%分離膠，電極緩沖液為pH 8.5 Tris-Gly-SDS緩沖液。用含2-巰基乙醇或不含2-巰基乙醇的處理液分別處理樣品。樣品在濃縮膠中以140 V，在分離膠中以180 V進行恒壓電泳。電泳結束后，凝膠條置于考馬斯亮藍R-250染色中染色蛋白條帶。檢測樣品分子量時以LMW Calibration Kit作為標準品。
1.2.3 r-SOX特性研究
(1)r-SOX的天然分子量測定[21]：采用Sephacryl S-200(預裝柱170 mm×9500 mm)凝膠過濾法，流動相為含有0.15 mol/L NaCl的0.05 mol/L、pH 7.0磷酸緩沖液。分別以1%丙酮、5 mg/mL Blue dextran 2000和5 mg/mL已知分子量蛋白質(1. ribonuclease A，3.7 kD；2. chymotrypsinogen A，25.0 kD；3. ovalbumin，43.0 kD；4. bovine serum albumin，67.0 kD；5. r-glycerol kinase，120 kD)為標準品(每個內標2 mL)上柱，同樣的流動相洗脫，280 nm檢測，分別采集各個標準品上柱到峰尖洗脫體積或上樣到峰尖時間，可獲得內水體積(Vi)、外水體積(Vo)以及各個蛋白作的洗脫體積(Ve)。然后將測試樣品在上述同樣條件下進行操作，測定樣品洗脫體積。按照Kav=(Ve－V0)/(Vi－V0)對分子量的對數作圖，通過樣品Ve即可從標準曲線查得樣品的相對分子質量。
(2)等電聚焦電泳[22, 23]：在Bio-Rad Model Ⅱ Mini IEF Cell上進行，5%聚丙烯酰胺凝膠，2%兩性電解質，以IEF calibration Kit做為標準品。采用逐步提高電壓方式進行聚焦，即100 V、15 min，200 V、15 min，450 V、60 min。電泳畢用考馬斯亮藍R-250染色。
(3)r-SOX與FAD結合方式的鑒別：將純化的r-SOX在pH 8.0、50 mmol/L焦磷酸鈉緩沖液中經10%三氯乙酸加熱，8 000 r/min離心10 min后進行觀察，與未經三氯乙酸處理的r-SOX樣品進行比較考察其與FAD的結合方式。
(4)熱穩定性分析：將純化的10 mL SOX[濃度為25 U/(mg·mL-1),保存于pH 7.0、0.05 mol/L的磷酸緩沖液]，分別于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75和80 ℃水浴鍋中孵育12 min，分別取樣并經10 000 r/min離心10 min，測定上清液的酶活性，觀察其熱穩定性。
(5)保存穩定性分析：r-SOX(濃度為20 mg/mL，保存于pH 7.5、20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液)中加入蔗糖達5 mg/mL作為穩定劑，經0.22 μm膜除菌，分別置于4~ 6 ℃和室溫(25 ℃)條件下保存，以不加穩定劑樣品作為對照品，定期分析酶活性，考察其樣品處于液體狀態時的穩定性。
在r-SOX中加入蔗糖作為穩定劑，同時以不含穩定劑的酶作為對照，進行冷凍干燥。將凍干粉酶制劑放置4℃保存，定期分析酶活性，考察其凍干粉劑型狀態下酶的保存穩定性。
1.2.4 統計學分析
所有數據結果均為重復4次實驗所得，采用SPSS18.0統計分析軟件進行單樣本t檢驗和ANOVA單因素方差分析。
2 結果與討論
2.1 重組肌氨酸氧化酶基因工程菌的培養
300 L發酵罐中進行發酵培養過程中，生物量和pH值的變化情況見圖 1，可以看出，在初始發酵培養過程中，pH值逐漸降低而生物量逐漸增加。發酵培養4 h，pH值約為5.4，OD600=6。隨發酵時間的延長，pH值又逐漸上升，生物量也在逐漸增加。當發酵培養到7 h時，pH值上升到7.3左右，OD600=12，此時菌體進入生長對數期。在初始發酵過程中，經SDS-PAGE和活性檢測，發現目的蛋白表達極微。
將發酵罐溫度降至25 ℃，加入乳糖開始誘導發酵。在誘導發酵的整個過程中，pH值和OD600值則基本保持恒定。經SDS-PAGE分析，目的蛋白的表達量主要在胞內表達，而發酵液上清中幾乎無此酶。隨著培養誘導時間的延長，目的蛋白的表達量也在增加，誘導10 h后，菌體量和目的蛋白表達量趨于恒定不變。發酵結束，共可收集約7 800 g濕菌體，每升發酵液含30 g濕菌體，每克濕菌體含酶活力200 U，比活性為1.7 U/mg。
圖1
誘導與非誘導條件下發酵常數的變化
Figure1.
Changes of biomass and pH at different time containing 260-270 liter of cultured mass with the presence of lactose as inducer and absence of the lactose
2.2 r-SOX的制備
將經熱變性處理的粗酶液經Biomax 10膜包交換成含0.5 mol/L NaCl的pH 7.5、40 mmol/L Tris-HCl緩沖液體系后，以同樣緩沖液充分平衡的Ni Sepharose FF柱，用含20 mmol/L咪唑的同樣緩沖液充分洗滌雜蛋白，然后換用含20~400 mmol/L咪唑緩沖液進行線性梯度洗脫，得到一個洗脫主峰，即為目的蛋白活性峰(圖 2)。表 1反映了r-SOX的整個純化情況，可以看出，r-SOX的最終純化倍數為14.4，活性回收率為92.4%，從100 g濕菌體中可獲得740 mg純酶制劑。圖 3給出了各個純化步驟樣品的SDS-PAGE電泳圖，純化的r-SOX純度可達97%以上。
圖2
r-SOX在Ni Sepharose FF柱上的層析圖譜
洗脫峰為經含20~400 mmol/L咪唑，pH 7.5、40 mmol/L Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫后的r-SOX
Figure2. Chromatographic profile of r-SOX on Ni Sepharose FF columnthe elution peak indicates r-SOX eluted by 40 mmol/L,pH 7.5 Tris-HCl buffer containing 20 to 400 mmol/L imidazole
表1
r-SOX分離純化總表
Table1.
Purification separation profile of r-SOX
圖3
SDS-PAGE分析不同純化階段洗脫液和酶的相對分子量
泳道1、2、3、4分別代表在非還原性條件下的粗酶提取液、選擇性熱變性、Ni Sepharose FF親和層析純化的樣品液20
Lane 1,2,3,4 present crude extract,thermo-denaturation,and 20 and 10
2.3 r-SOX特性研究
用不同方法對r-SOX重組肌氨酸氧化酶的相對分子質量進行了分析。在還原和非還原條件下進行SDS-PAGE，用Quantity One軟件分析得到蛋白質標準各條帶的遷移率與分子量關系的曲線，計算重組肌氨酸氧化酶的相對分子量為53 kD(圖 3)。經分子篩層析法測定其天然相對分子量為55 kD(圖 4)。由此可以推測該酶為單條肽鏈的天然大分子。經等電聚焦電泳分析，該重組肌氨酸氧化酶的pI為5.3(圖 5)。在三氯乙酸存在下經熱變性處理，離心后，發現沉淀部分為黃色，而上清液為白色，提示該酶中酶蛋白與非蛋白部分(核黃素)以共價鍵方式結合(圖 6)。上述獲得的結果與文獻報道[18, 24-26]基本一致。
圖4
分子篩層析法測定r-SOX天然分子量
① 核糖核酸酶A,13.7 kD；②
① ribonuclease A,13.7 kD; ②
圖5
等電聚焦電泳鑒定r-SOX
泳道1：純化的r-SOX；泳道M：標準蛋白
Figure5. Determination of pI of r-SOX on isoelectric focusing electrophoresis-polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1: the purified r-SOX; Lane M: broad pI calibration kit
圖6
r-SOX與FAD結合方式的鑒別
(a)在pH 8.0、50mmol/L焦磷酸鈉緩沖液中的r-SOX樣品；(b)在pH 8.0、50mmol/L焦磷酸鈉緩沖液中經10%三氯乙酸加熱、煮沸10min，離心后的r-SOX樣品
Figure6. Identification of r-SOX with covalent FAD prosthetic groups(a) r-SOX in sodium pyrophosphate buffer,pH 8.0; (b) r-SOX in sodium pyrophosphate buffer,pH 8.0 which was kept in a boiling water bath for 10 min in the presence of 10% trichloroacetic acid followed by simple centrifugation
純化的酶液于不同溫度下處理12 min，分別取樣測定酶活性。發現在55 ℃時其酶活性未受影響。在60 ℃時酶活性可保留75%，超過60 ℃酶活性急劇降低(圖 7)。提示r-SOX具有較好的熱穩定性。r-SOX(濃度為20 mg/mL，保存于pH 7.5、20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液)中加入蔗糖穩定劑，于室溫(25 ℃)保存25 d，定期檢測酶活性，未發現酶活性丟失。在4~6 ℃冰箱中保存3個月，也未發現酶活性丟失。實驗結果說明，4 ℃保存較25 ℃效果更好。純化的r-SOX加入蔗糖作為穩定劑，冷凍干燥，放置4 ℃保存，定期分析酶活性考察其穩定性(圖 8)。結果顯示，4 ℃存放6個月后活性開始有微弱降低，存放10個月時其活性可保持在85%，與不加保護劑比較活性沒有明顯差異。
圖7
r-SOX的熱穩定性
保存于pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液的r-SOX在不同溫度下處理12 min的變化曲線
Figure7. Thermal stability of r-SOXr-SOX (in pH 7.5,20mmol/L Tris-HCl buffer) was treated in various temperatures for 12 min
圖8
r-SOX凍干粉劑型的保存穩定性
Figure8.
The stability of r-SOX in powder form at 4-6 ℃
3 結論
本文研究了在300 L發酵罐中，以乳糖作為誘導劑，發酵培養重組肌氨酸氧化酶基因工程菌，并建立了在實驗室規模制備r-SOX的方法。
在初始發酵培養過程中，隨著發酵時間的延長，pH值逐漸降低而生物量逐漸增加。當工程菌進入對數生長期時，降低溫度進行誘導發酵，pH值與生物量呈正相關，在pH值上升到7.3時，生物量與目的蛋白表達量基本維持恒定。r-SOX為胞內表達，在無誘導劑存在時表達量很低，當有誘導劑時表達量逐漸增加，當培養到一定時間后表達量基本保持不變。每升發酵液含有30g濕菌體，每克濕菌體含酶活力200 U，比活性為1.7 U/mg。
經選擇性熱變性處理無細胞抽提液，再經Ni-Sepharose FF層析柱2步純化即可獲得高純度的r-SOX制劑，收率為92%，比活性25 U/mg，100 g濕菌體中可最終獲得740 mg酶制劑。此酶為單條肽鏈與FAD以共價鍵連接的結合蛋白，此外該酶制劑中所含過氧化氫酶活性經檢測低于0.5%，符合配制診斷試劑盒的要求。
引言
血清中的肌酐濃度是臨床上診斷腎功能的一項重要指標。目前肌酐的測定常用Jaffe法，由于該方法以化學反應為基礎，受血清中許多化學物質的干擾，特異性較差，給疾病的正確診斷帶來一定困難，所以逐漸被具有高專一性、高靈敏度、快速自動化等優點的偶聯酶法試劑盒所取代[1-2]。在酶法肌酐測定中，肌酐在一系列的酶促催化過程中生成肌氨酸，所生成的肌氨酸可以在肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase,SOX)作用下分解成甘氨酸、甲醛和H2O2[3]，其中偶聯甲醛脫氫酶可定量甲醛含量，也可以采用偶聯過氧化物酶測定H2O2的方法，來間接反映出樣品中肌酐的含量[4-7]。因此，SOX是偶聯酶法測定肌酐的關鍵酶之一[8]。另外，偶聯酶法試劑盒除了對參與反應的酶要求具有較高的純度之外，還要將干擾酶尤其是過氧化氫酶等控制在很低的范圍內，否則將影響測定結果。
基因工程技術是解決診斷試劑盒工具酶來源的有效方法之一，不但能大大降低生產成本，也易于去除目的酶中的干擾酶。目前國內外已有將SOX基因克隆表達的報道[9-13]，而對于有關重組肌氨酸氧化酶(recombinant SOX,r-SOX)基因工程菌的發酵罐培養和較大量制備酶制劑的研究卻鮮有報道，因此開展此項研究工作顯得很有必要。
本文主要討論經300 L發酵罐培養，對采用乳糖誘導表達SOX基因工程菌的發酵培養條件及酶的純化工藝和質控檢測進行研究，期望研究結果可為此酶的開發和利用奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料和設備
1.1.1 主要試劑
Bacillus SP.肌氨酸氧化酶基因E.coli BL21(DE3)工程菌由中國科學院微生物研究所構建；肌氨酸(sarcosine)和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)購自Aladdin公司；甘氨酸(glycine)購自Amresco公司；酵母膏(Yeast Extract)和蛋白胨(tryptone)購自OXOID公司；丙烯酰胺(acrylamide,Acr)、N,N′-甲叉雙丙烯酰胺(methylene bisacrylamide,Bis)和SDS購自Biomol公司；Ni Sepahrose FF和LMW calibration Kit購自Pharmacia公司；過氧化物酶(peroxidase)購自TOYOBO公司；兩性電解質(ampholytes)購自Bio-Rad公司。其余試劑均為國產分析純。
1.1.2 主要儀器
300 L發酵罐(上海保興生物設備工程有限公司)；高速冷凍離心機(Eppendorf 5804R)；紫外可見分光光度計(UnicoTM UC-2102 PC，上海第三分析儀器廠)；電泳系統(Bio-Rad公司Power PAC300)；凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司76S/02324)；GEA高壓均質機(上海東華高壓均質機廠)；GQ75B高速管式離心機(上海浦東天本離心機機械有限公司)；Mini-protean Ⅲ 電泳槽(Bio-Rad)；Beckman Avanti J-20XP高速冷凍離心機；冷卻罐(溫州市商泰輕工機械有限公司)；Mini Pellicon及Pellicon超濾系統(Millipore公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 重組肌氨酸氧化酶基因工程菌的培養[14 -16 ]
將甘油保存的肌氨酸氧化酶基因工程菌接入試管斜面培養基(LB培養基)上，37 ℃活化3~4次。挑取生長飽滿的菌落轉接入試管液體培養基，37 ℃ 200 r/min旋轉搖床培養15 h。按5%接種量接入搖瓶(LB培養基)，同樣條件下培養即為發酵罐用種子培養液。發酵罐培養基由1.2%蛋白胨、2.4%酵母膏、0.2%NaCl、0.6% K2HPO4、0.7% Na2HPO4組成，pH維持在6.0~7.5。將培養基裝入300 L發酵罐(工作體積260~270 L)，在1.034×105 Pa壓力下滅菌30 min。冷卻至40~45 ℃，按5%接種量接入種子菌種液并加入適量消泡劑(盈智有機硅材料有限公司,廣東佛山)。設置37 ℃、200 r/min和氧體積分數控制在25%。進行初始發酵培養，隔時間取樣分析生物量和pH變化。當菌體進入對數生長期時，將發酵罐溫度降到25 ℃，加入乳糖，使終濃度達40 mmol/L并調整氧體積分數為30%，開始誘導發酵。間隔2~3 h取樣分析，當生物量和活性基本恒定時停止發酵。
生物量的測定采用細菌光電比濁計數法，用分光光度計測OD600nm值表示菌體濃度。蛋白含量測定采用Bradford法[17]，以牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)為標準蛋白作為對照。酶活性測定[18]條件為37 ℃、pH 8.0，每分鐘生成1 μmol過氧化氫所需要的酶量定義為一個酶活性單位。具體測定過程為取1.0 mL工作液(含95 mmol/L 肌氨酸、0.47 mmol/L 4-氨基安替比林、5.2 U/mL過氧化物酶、Triton X-100 0.045%、2 mmol/L苯酚和48 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液)，加入0.05 mL適當稀釋的酶液，37 ℃下準確反應10 min，加入2.0 mL 0.25% SDS溶液終止反應，以酶稀釋液替代酶液做空白，于600 nm處測定OD值。
1.2.2 r-SOX的制備
(1)無細胞粗酶液的制備和選擇性熱變性處理[19]：取濕菌體1 kg，加入10 L 20 mmol/L、pH7.5 Tris-HCl緩沖液中預冷至4 ℃，用高壓勻質機在5.0×105 Pa條件下破碎，后經7 000 r/min離心20 min，收集上清液即無細胞粗酶液。將粗酶液以250~300 mL分裝于1 L的三角瓶中，放入55 ℃水浴中緩緩震搖，當粗酶液的溫度達到55 ℃時，處理20 min，并定時取樣分析酶活性來判斷熱處理效果。將熱處理后的酶液經5 000 r/min離心10 min后，棄去沉淀收集上清液，經0.45 μm膜過濾后進行Ni Sepharose FF親和層析。
(2)Ni-Sepharose FF親和層析：用0.5 mol/L NaCl、pH 7.5 40 mmol/L Tris-HCl緩沖液充分平衡柱，按說明書進行經預處理的Ni-Sepharose FF柱(500 mm×3 800 mm，有效凝膠體積為100 mL)，將經熱變性處理并交換成0.5 mol/L NaCl、pH 7.5 40 mmol/L Tris-HCl緩沖液體系的粗酶液分批(1 000 mL/次)上柱，流速2 mL/min，280 nm進行檢測。樣品上畢，用含20 mmol/L咪唑的平衡緩沖液充分洗滌雜蛋白至280 nm吸收值達記錄儀基線為止。然后用20倍凝膠體積的含20～400 mmol/L咪唑的平衡緩沖液進行線性梯度洗脫，10 mL/管分部收集，通過檢測酶活性收集酶活性峰部分。將此樣品液在pH 7.0、0.05 mol/L磷酸緩沖液的交換溶劑體系中用Biomax 5 kD的膜包濃縮至蛋白含量為30 mg/mL，經0.22 μm膜除菌，于4 ℃保存備用。
酶活性峰部分采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)[20]，4%濃縮膠，12%分離膠，電極緩沖液為pH 8.5 Tris-Gly-SDS緩沖液。用含2-巰基乙醇或不含2-巰基乙醇的處理液分別處理樣品。樣品在濃縮膠中以140 V，在分離膠中以180 V進行恒壓電泳。電泳結束后，凝膠條置于考馬斯亮藍R-250染色中染色蛋白條帶。檢測樣品分子量時以LMW Calibration Kit作為標準品。
1.2.3 r-SOX特性研究
(1)r-SOX的天然分子量測定[21]：采用Sephacryl S-200(預裝柱170 mm×9500 mm)凝膠過濾法，流動相為含有0.15 mol/L NaCl的0.05 mol/L、pH 7.0磷酸緩沖液。分別以1%丙酮、5 mg/mL Blue dextran 2000和5 mg/mL已知分子量蛋白質(1. ribonuclease A，3.7 kD；2. chymotrypsinogen A，25.0 kD；3. ovalbumin，43.0 kD；4. bovine serum albumin，67.0 kD；5. r-glycerol kinase，120 kD)為標準品(每個內標2 mL)上柱，同樣的流動相洗脫，280 nm檢測，分別采集各個標準品上柱到峰尖洗脫體積或上樣到峰尖時間，可獲得內水體積(Vi)、外水體積(Vo)以及各個蛋白作的洗脫體積(Ve)。然后將測試樣品在上述同樣條件下進行操作，測定樣品洗脫體積。按照Kav=(Ve－V0)/(Vi－V0)對分子量的對數作圖，通過樣品Ve即可從標準曲線查得樣品的相對分子質量。
(2)等電聚焦電泳[22, 23]：在Bio-Rad Model Ⅱ Mini IEF Cell上進行，5%聚丙烯酰胺凝膠，2%兩性電解質，以IEF calibration Kit做為標準品。采用逐步提高電壓方式進行聚焦，即100 V、15 min，200 V、15 min，450 V、60 min。電泳畢用考馬斯亮藍R-250染色。
(3)r-SOX與FAD結合方式的鑒別：將純化的r-SOX在pH 8.0、50 mmol/L焦磷酸鈉緩沖液中經10%三氯乙酸加熱，8 000 r/min離心10 min后進行觀察，與未經三氯乙酸處理的r-SOX樣品進行比較考察其與FAD的結合方式。
(4)熱穩定性分析：將純化的10 mL SOX[濃度為25 U/(mg·mL-1),保存于pH 7.0、0.05 mol/L的磷酸緩沖液]，分別于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75和80 ℃水浴鍋中孵育12 min，分別取樣并經10 000 r/min離心10 min，測定上清液的酶活性，觀察其熱穩定性。
(5)保存穩定性分析：r-SOX(濃度為20 mg/mL，保存于pH 7.5、20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液)中加入蔗糖達5 mg/mL作為穩定劑，經0.22 μm膜除菌，分別置于4~ 6 ℃和室溫(25 ℃)條件下保存，以不加穩定劑樣品作為對照品，定期分析酶活性，考察其樣品處于液體狀態時的穩定性。
在r-SOX中加入蔗糖作為穩定劑，同時以不含穩定劑的酶作為對照，進行冷凍干燥。將凍干粉酶制劑放置4℃保存，定期分析酶活性，考察其凍干粉劑型狀態下酶的保存穩定性。
1.2.4 統計學分析
所有數據結果均為重復4次實驗所得，采用SPSS18.0統計分析軟件進行單樣本t檢驗和ANOVA單因素方差分析。
2 結果與討論
2.1 重組肌氨酸氧化酶基因工程菌的培養
300 L發酵罐中進行發酵培養過程中，生物量和pH值的變化情況見圖 1，可以看出，在初始發酵培養過程中，pH值逐漸降低而生物量逐漸增加。發酵培養4 h，pH值約為5.4，OD600=6。隨發酵時間的延長，pH值又逐漸上升，生物量也在逐漸增加。當發酵培養到7 h時，pH值上升到7.3左右，OD600=12，此時菌體進入生長對數期。在初始發酵過程中，經SDS-PAGE和活性檢測，發現目的蛋白表達極微。
將發酵罐溫度降至25 ℃，加入乳糖開始誘導發酵。在誘導發酵的整個過程中，pH值和OD600值則基本保持恒定。經SDS-PAGE分析，目的蛋白的表達量主要在胞內表達，而發酵液上清中幾乎無此酶。隨著培養誘導時間的延長，目的蛋白的表達量也在增加，誘導10 h后，菌體量和目的蛋白表達量趨于恒定不變。發酵結束，共可收集約7 800 g濕菌體，每升發酵液含30 g濕菌體，每克濕菌體含酶活力200 U，比活性為1.7 U/mg。
圖1
誘導與非誘導條件下發酵常數的變化
Figure1.
Changes of biomass and pH at different time containing 260-270 liter of cultured mass with the presence of lactose as inducer and absence of the lactose
2.2 r-SOX的制備
將經熱變性處理的粗酶液經Biomax 10膜包交換成含0.5 mol/L NaCl的pH 7.5、40 mmol/L Tris-HCl緩沖液體系后，以同樣緩沖液充分平衡的Ni Sepharose FF柱，用含20 mmol/L咪唑的同樣緩沖液充分洗滌雜蛋白，然后換用含20~400 mmol/L咪唑緩沖液進行線性梯度洗脫，得到一個洗脫主峰，即為目的蛋白活性峰(圖 2)。表 1反映了r-SOX的整個純化情況，可以看出，r-SOX的最終純化倍數為14.4，活性回收率為92.4%，從100 g濕菌體中可獲得740 mg純酶制劑。圖 3給出了各個純化步驟樣品的SDS-PAGE電泳圖，純化的r-SOX純度可達97%以上。
圖2
r-SOX在Ni Sepharose FF柱上的層析圖譜
洗脫峰為經含20~400 mmol/L咪唑，pH 7.5、40 mmol/L Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫后的r-SOX
Figure2. Chromatographic profile of r-SOX on Ni Sepharose FF columnthe elution peak indicates r-SOX eluted by 40 mmol/L,pH 7.5 Tris-HCl buffer containing 20 to 400 mmol/L imidazole
表1
r-SOX分離純化總表
Table1.
Purification separation profile of r-SOX
圖3
SDS-PAGE分析不同純化階段洗脫液和酶的相對分子量
泳道1、2、3、4分別代表在非還原性條件下的粗酶提取液、選擇性熱變性、Ni Sepharose FF親和層析純化的樣品液20
Lane 1,2,3,4 present crude extract,thermo-denaturation,and 20 and 10
2.3 r-SOX特性研究
用不同方法對r-SOX重組肌氨酸氧化酶的相對分子質量進行了分析。在還原和非還原條件下進行SDS-PAGE，用Quantity One軟件分析得到蛋白質標準各條帶的遷移率與分子量關系的曲線，計算重組肌氨酸氧化酶的相對分子量為53 kD(圖 3)。經分子篩層析法測定其天然相對分子量為55 kD(圖 4)。由此可以推測該酶為單條肽鏈的天然大分子。經等電聚焦電泳分析，該重組肌氨酸氧化酶的pI為5.3(圖 5)。在三氯乙酸存在下經熱變性處理，離心后，發現沉淀部分為黃色，而上清液為白色，提示該酶中酶蛋白與非蛋白部分(核黃素)以共價鍵方式結合(圖 6)。上述獲得的結果與文獻報道[18, 24-26]基本一致。
圖4
分子篩層析法測定r-SOX天然分子量
① 核糖核酸酶A,13.7 kD；②
① ribonuclease A,13.7 kD; ②
圖5
等電聚焦電泳鑒定r-SOX
泳道1：純化的r-SOX；泳道M：標準蛋白
Figure5. Determination of pI of r-SOX on isoelectric focusing electrophoresis-polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1: the purified r-SOX; Lane M: broad pI calibration kit
圖6
r-SOX與FAD結合方式的鑒別
(a)在pH 8.0、50mmol/L焦磷酸鈉緩沖液中的r-SOX樣品；(b)在pH 8.0、50mmol/L焦磷酸鈉緩沖液中經10%三氯乙酸加熱、煮沸10min，離心后的r-SOX樣品
Figure6. Identification of r-SOX with covalent FAD prosthetic groups(a) r-SOX in sodium pyrophosphate buffer,pH 8.0; (b) r-SOX in sodium pyrophosphate buffer,pH 8.0 which was kept in a boiling water bath for 10 min in the presence of 10% trichloroacetic acid followed by simple centrifugation
純化的酶液于不同溫度下處理12 min，分別取樣測定酶活性。發現在55 ℃時其酶活性未受影響。在60 ℃時酶活性可保留75%，超過60 ℃酶活性急劇降低(圖 7)。提示r-SOX具有較好的熱穩定性。r-SOX(濃度為20 mg/mL，保存于pH 7.5、20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液)中加入蔗糖穩定劑，于室溫(25 ℃)保存25 d，定期檢測酶活性，未發現酶活性丟失。在4~6 ℃冰箱中保存3個月，也未發現酶活性丟失。實驗結果說明，4 ℃保存較25 ℃效果更好。純化的r-SOX加入蔗糖作為穩定劑，冷凍干燥，放置4 ℃保存，定期分析酶活性考察其穩定性(圖 8)。結果顯示，4 ℃存放6個月后活性開始有微弱降低，存放10個月時其活性可保持在85%，與不加保護劑比較活性沒有明顯差異。
圖7
r-SOX的熱穩定性
保存于pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液的r-SOX在不同溫度下處理12 min的變化曲線
Figure7. Thermal stability of r-SOXr-SOX (in pH 7.5,20mmol/L Tris-HCl buffer) was treated in various temperatures for 12 min
圖8
r-SOX凍干粉劑型的保存穩定性
Figure8.
The stability of r-SOX in powder form at 4-6 ℃
3 結論
本文研究了在300 L發酵罐中，以乳糖作為誘導劑，發酵培養重組肌氨酸氧化酶基因工程菌，并建立了在實驗室規模制備r-SOX的方法。
在初始發酵培養過程中，隨著發酵時間的延長，pH值逐漸降低而生物量逐漸增加。當工程菌進入對數生長期時，降低溫度進行誘導發酵，pH值與生物量呈正相關，在pH值上升到7.3時，生物量與目的蛋白表達量基本維持恒定。r-SOX為胞內表達，在無誘導劑存在時表達量很低，當有誘導劑時表達量逐漸增加，當培養到一定時間后表達量基本保持不變。每升發酵液含有30g濕菌體，每克濕菌體含酶活力200 U，比活性為1.7 U/mg。
經選擇性熱變性處理無細胞抽提液，再經Ni-Sepharose FF層析柱2步純化即可獲得高純度的r-SOX制劑，收率為92%，比活性25 U/mg，100 g濕菌體中可最終獲得740 mg酶制劑。此酶為單條肽鏈與FAD以共價鍵連接的結合蛋白，此外該酶制劑中所含過氧化氫酶活性經檢測低于0.5%，符合配制診斷試劑盒的要求。
