引用本文： 楊超, 鄭勇斌, 宋丹, 肖曠, 童仕倫. 構建 KrasLSL-G12D/- 和 Smad4loxp/loxp 雙轉基因 散發性結直腸癌小鼠模型 . 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(8): 917-922. doi: 10.7507/1007-9424.201801070 復制
結直腸癌發生是多步驟的過程，Kras 基因可以通過多種信號通路影響細胞不可控制的增殖和生長，參與結直腸癌發生的初始階段，在約 50% 的原發性結直腸癌患者中可以檢測到突變型 Kras[1]。Smad4 基因是細胞內信號傳遞介質家族成員，參與細胞生長和轉錄調控，扮演著腫瘤抑制因子的角色[2]；Smad4 表達缺失將導致結直腸上皮細胞增生活躍，導致腺瘤高發并呈現出癌變趨勢，還通過包括上皮間質轉化在內的機制表現出侵襲、轉移傾向[3-4]。基因工程小鼠模型作為一種近年來發展迅速的動物模型，可以特異性地修飾感興趣的目的基因，模擬與臨床類似的腫瘤，為精確研究基因與疾病的關系提供了可能[5]。本課題組構建了同時表達 KrasLSL-G12D/-和 Smad4loxp/loxp的雙轉基因散發性結直腸癌小鼠模型，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料
1.1.1 實驗動物
從美國杰克遜實驗室（The Jackson Laboratory）購買的 SPF 級 B6.129S4-Krastm4Tyj/J （008179）和 Stock Smad4tm2.1Cxd/J（017462）雌雄小鼠各 1 對，C57BL/6J 小鼠來自本課題組前期保種。B6.129S4-Krastm4Tyj/J 小鼠是在 Kras 基因上游插入了 Loxp-stop-Loxp（LSL）序列，Stock Smad4tm2.1Cxd/J 小鼠是在 Smad4 基因上下游分別插入了 Loxp 序列。Cre 重組酶可特異性識別 LSL 序列，利用慢病毒載體將 Cre 基因轉染入雙轉基因模型小鼠結直腸隱窩上皮細胞內，Cre 重組酶將對小鼠腸上皮細胞中 Kras 基因上游的終止序列以及 Smad4 基因序列進行特異性識別并切除，導致原癌基因 Kras 激活表達，誘導腸上皮細胞瘤變進而成癌。其基因重組模式見圖 1。
圖1
示 Cre 重組酶介導的基因重組模式圖
1.1.2 主要材料
小鼠結腸鏡系統，由 PENTAX FB-8V 改裝，日本；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀，ABI 公司，美國；凝膠成像系統，VILBER，法國；瓊脂糖凝膠電泳儀，六一生物公司，北京；鼠尾 DNA 提取試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司，北京；氯化鈣（CaCl2）轉染試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司，上海；IVIS 系統，PE 公司，美國；D-Luciferin，上海前塵生物科技有限公司，上海；引物，上海生工生物工程有限公司，上海。
1.2 動物飼養環境
實驗小鼠飼養于武漢大學動物實驗中心獨立通氣籠具系統（蘇州市蘇杭科技器材有限公司，蘇州），室溫 22～25 °C，相對濕度 60%～70%；小鼠飼養盒、墊料及飲用水均經過高溫高壓滅菌處理；小鼠繁殖飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司，北京）經輻照滅菌。
1.3 雙轉基因模型小鼠的構建
1.3.1 雙轉基因模型小鼠的培育與篩選
首先將 B6.129S4-Krastm4Tyj/J 小鼠與 C57BL/6J 小鼠雜交和反復回交，轉換其遺傳背景，以增強其存活和繁殖能力。利用普通 PCR 篩選出 C57BL/6J-KrasLSL-G12D/-/J 雜合子小鼠（由于該型純合子小鼠在母體子宮內已死亡，故只能篩選出雜合子小鼠，簡記為 KrasLSL-G12D/-）。同時將 Stock Smad4tm2.1Cxd/J 小鼠轉化遺傳背景后通過雜交和回交并利用普通 PCR 篩選出純合子小鼠，簡記為 Smad4loxp/loxp。最后將 KrasLSL-G12D/-和 Smad4loxp/loxp小鼠雜交形成雙雜合子的 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/-小鼠，再將此種基因型的雙雜合子小鼠自交，利用普通 PCR 和側交最終篩選出 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp品系小鼠，該小鼠即為本研究所構建的雙轉基因模型小鼠。
1.3.2 小鼠組織 DNA 提取
為提取實驗小鼠 DNA 進行基因型的鑒定與篩選，剪取 2 周齡實驗小鼠尾尖組織 4～6 mm 長，剪碎后置于 1.5 mL EP 管中，使用鼠尾 DNA 提取試劑盒提取小鼠組織 DNA，于 4 °C 保存備檢。
1.3.3 KrasLSL-G12D/- 的檢測
正向引物為5′-TGTCTTTCCCCAGCACAGT-3′（針對野生型）、5′-GCAGGTCGAGGGACCTAATA-3′（針對突變型）；反向引物均為5′-CTGCATAGTACGCTATACCCTGT-3′。PCR 擴增條件為：94 °C 變性 2 min；94 °C 15 s，60 °C15 s，72 °C 10 s，28 個循環；72 °C 2 min，4 °C 冷卻保溫。PCR 產物 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳 20 min，凝膠熒光成像系統下觀察，KrasLSL-G12D/-小鼠應擴增出 100 bp 和 250 bp 的片段，而野生型小鼠僅擴增出 250 bp 的片段。
1.3.4 Smad4loxp/loxp的檢測
正向引物為5′-TAAGAGCCACAGGGTCAAGC-3′，反向引物為5′-TTCCAGGAAAAACAGGGCTA-3′。PCR 擴增條件為：94 °C 預變性 2 min；94 °C 變性 20 s，65 °C 復性 15 s（每個循環溫度降低 0.5 °C），68 °C 延伸10 s，10 個循環；接著再 94 °C 變性 15 s，60 °C 復性 15 s，72 °C延伸 10 s，共 28 個循環；72 °C 延伸2 min，4 °C 保存。將PCR 產物 3% 瓊脂糖凝膠電泳30 min，Smad4loxp/loxp小鼠只擴增出 500 bp 的片段，而野生型小鼠則擴增出 500 bp 和 436 bp 的片段。
1.4 雙轉基因模型小鼠驗證
1.4.1 構建病毒載體
利用CaCl2轉染法進行病毒載體構建，慢病毒質粒為課題組前期構建的pHIV-Ubi-Puromycin-IRES-Luciferase和pHIV-Ubi-Puromycin-Cre-IRES-Luciferase（Luciferase 即熒光素酶基因用來示蹤單個細胞，以研究單個細胞的行為變化）；包裝質粒PMD2G（addgene12259）和PSPAX2（addgene12260），按照轉染試劑盒說明書進行操作，收取病毒后進行純化并測定病毒滴度， 然后于 –80 ℃下保存。將病毒載體分別簡記為 Lentivirus IRES-Luciferase和 LentivirusCre-IRES-Luciferase。
1.4.2 體外驗證 Cre 酶活性
取處于對數生長期狀態良好的小鼠結腸癌細胞 MCA38 用于慢病毒感染。在 12 孔板中接種 MCA38，在 37 °C、體積分數為 5% CO2 的培養箱中培養，待細胞密度達到60%~70%時用慢病毒顆粒感染細胞，在 IVIS 系統下觀察病毒載體體外感染效果。
1.4.3 Cre 重組酶誘導小鼠結腸上皮細胞突變
采用生理鹽水灌腸去除直腸及遠端結腸內的腸內容物，戊巴比妥鈉（10 mg/mL，50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，小鼠結腸鏡檢查腸道清潔情況，同時確定感染的部位，利用微量注射器向小鼠腸黏膜下注射 LentivirusCre-IRES-Luciferase（108 pfu），對照組注射 LentivirusIRES-Luciferase（108 pfu）。感染 1 周后，于小鼠腹腔內注射 D-Luciferin（150 μg/mL，10 μL/g），IVIS 系統下觀察熒光，調整病毒滴度和感染頻率以獲得僅 1～2 處成瘤病灶的小鼠模型（病毒滴度一般為108 pfu，每只小鼠注射量30 μL，用微量注射器通過結腸鏡下注射于結直腸腸黏膜下，可見黏膜隆起是注射深度正確的標志，一般注射1或2處）。然后每4周利用IVIS系統監測雙轉基因模型小鼠成瘤情況。
1.4.4 組織病理學檢查
待雙轉基因模型小鼠腫瘤形成后，將小鼠麻醉，解剖取出結腸并用 PBS 沖洗，在新制備的甲醛中固定 24 h，石蠟包埋切片后行蘇木精-伊紅（ HE ）染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織病理學變化，記錄結腸上皮細胞瘤變情況。
1.5 統計學方法
統計分析使用 GraphPad Prism 6 軟件。小鼠的繁殖學指標用均數±標準差（
±s）表示，雙轉基因模型小鼠與 C57BL/6J 小鼠的差異比較用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.050。
2 結果
2.1 雙轉基因模型小鼠 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp的檢測
目前共繁育出48只C57BL/6J小鼠，69只雙轉基因模型小鼠。構建的雙轉基因模型小鼠與 C57BL/6J 小鼠相比外形無明顯差別，見圖 2a。與 C57BL/6J 小鼠比較，雙轉基因模型小鼠的窩產仔數更多（P=0.038）、胎間隔時間短（P<0.001），見表 1。雙轉基因模型小鼠的基因鑒定結果見圖 2b，其中 1、2 和 3 號小鼠基因型為 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp，為本研究所構建的雙轉基因模型小鼠；4 號小鼠是培育過程中另一種常見的基因型，為 Kras-/-+Smad4loxp/loxp，該型小鼠在實驗過程中需剔除。
圖2
示雙轉基因構建結果及基因鑒定結果
a：為第 8 周時雙轉基因模型小鼠（右邊）與 C57BL/6J 小鼠（左邊）相比，其外觀無明顯差別；b：為雙轉基因模型小鼠的基因鑒定結果，從左往右的電泳圖依次為加 Kras 突變型引物、加 Kras 野生型引物和加 Smad4 引物；1、2 和 3 號泳道為構建的雙轉基因模型小鼠；4 號泳道為 Kras-/- +Smad4loxp/loxp小鼠；M 為 Marker
表1
兩種小鼠繁殖學指標比較結果（
）
2.2 LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase體外功能驗證
體外驗證病毒載體功能的 IVIS 下顯像結果見圖 3，LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase均能順利導入小鼠結腸癌細胞中并表現出熒光，間接驗證了 Cre 重組酶的功能。
圖3
示體外驗證慢病毒載體功能在 IVIS 系統下的顯像情況
a：為用 LentivirusIRES-Luciferase感染 MCA38 細胞；b：為用 LentivirusCre-IRES-Luciferase感染 MCA38 細胞；c：為未用病毒載體感染的 MCA38 細胞作為陰性對照
2.3 構建 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp雙轉基因小鼠散發性結直腸癌模型情況
圖4
示 LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase感染雙轉基因模型小鼠結腸上皮細胞后第 4、8 及12 周時 IVIS 系統下的熒光情況
a：為LentivirusCre-IRES-Luciferase感染；b：為LentivirusIRES-Luciferase感染
2.3.1 Cre 重組酶誘導小鼠結腸上皮細胞突變
用慢病毒感染雙轉基因模型小鼠結腸上皮細胞，在注射后第 4 周時 2 組小鼠熒光信號基本相同，在第 8 周至第 12 周時 LentivirusCre-IRES-Luciferase組的熒光信號較前有增強，而 LentivirusIRES-Luciferase組熒光信號出現衰減，甚至在第 8 周后已完全檢測不到。結果見圖 4。
圖5
示小鼠結腸上皮細胞 HE 染色結果
a：為構建的未被誘導突變模型小鼠腸道組織（HE ×100）；b：為模型小鼠經 Cre 酶誘導成瘤后的腫瘤組織（HE ×400）
2.3.2 瘤變組織病理學檢查結果
與正常的小鼠結直腸細胞相比，經病毒感染瘤變的組織行 HE 染色后鏡下可見細胞異型性增加，細胞核大而深染，核質比例增加，并散在黏液空泡，經病理檢查證實為腺癌，見圖 5。
3 討論
散發性結直腸癌的進展過程遵循腺瘤→腺癌→轉移的發展軸，其分子機制包括：染色體不穩定[6]、微衛星不穩定[7]及 CpG 島甲基化表型[8]，由此可見，散發性結直腸癌發病機制的多樣性使得單個動物模型難以模擬疾病進展全過程。
Hung 等[9]認為，一個理想的結直腸癌動物模型至少應該滿足：① 僅有一個或少數幾個原發成瘤病灶并具有一定的遠處轉移能力；② 原發病灶必須局限于結腸上皮細胞和肌層之間；③ 具有較短的成瘤周期及可預知的時間軸。本研究所構建的雙轉基因模型小鼠利用病毒載體注射誘導腸上皮細胞癌變，通過注射的深度來控制原發病灶的位置，同時還能通過注射病毒的滴度和劑量保證僅有少量原發病灶產生；由于觀察時間較短及多數成瘤小鼠因腸梗阻導致死亡影響了對遠處轉移能力的評估，在后期的實驗中可以利用腸道支架等方式延長模型小鼠的生命周期，以觀察腫瘤轉移情況。
結腸上皮細胞的更新依賴于結腸隱窩基底部的多能干細胞維持，當隱窩干細胞基因發生突變后，細胞的自我更新、克隆、增殖及分化超過了正常腸上皮細胞凋亡速度，則將導致腺瘤的形成。基因工程小鼠模型的巨大優勢在于利用相對簡易的基因修飾，實現目的基因在某一時段只在特定的組織表達或者失活，使模型具有特定的生物表型或特性，提供與散發性結腸癌相似的基因分子學改變，最大程度上模擬臨床狀態[10-11]，同時也減少基因重組對模型動物發育影響而導致的癌性損傷或胚胎死亡[12]，并且還能精確研究目的基因與疾病發生的關系[13]。本研究利用了慢病毒介導 Cre-loxp 重組酶系統感染小鼠結直腸隱窩上皮細胞，Cre 重組酶對結直腸隱窩-絨毛軸的上皮細胞進行選擇性基因修飾，激活致癌基因，誘導腸上皮細胞瘤變進而成癌。
腺瘤的形成常常起始于抑癌基因（如 APC 基因等）失活，通過 Wnt 信號的持續激活導致腺瘤的形成；從腺瘤向腺癌的轉變往往還需要額外的分子事件，如原癌基因 Kras 的激活；在散發性結腸癌中常可見到突變的 Kras，并與腫瘤侵襲性及對化療藥物耐藥相關，常常預示著患者不好的預后[14]。此外，突變的 Kras 可以與失活的抑癌基因如 Smad4 協同作用，以增強促進腫瘤生長和侵襲性的 Wnt 信號[15]。Smad4 基因的表達缺失在早期胃腸道腫瘤中就可見到，特別是在低分化腫瘤細胞及印戒細胞癌中更為普遍。研究[16]發現，轉化生長因子-β/Smad4 基因低表達將會導致結直腸癌具有更高的增殖和轉移傾向。Luo 等[17]研究發現，在構建的 LSL-KrasG12D+ApcΔ14/+雙轉基因小鼠中，Cre 誘導的成瘤與那些單轉基因 ApcΔ14/+小鼠相比，腫瘤細胞的分化程度更差，侵襲性更強，成瘤率也更高。本研究的前期預實驗結果也證實了雙轉基因小鼠的成瘤率比單轉基因高。需要注意的是，本研究所構建的雙轉基因模型小鼠的基因型為部分雜合，每一代小鼠均需用普通 PCR 進行基因檢測；有趣的是，根據孟德爾遺傳定律，后代小鼠中雜合概率理論上為 50%，但我們在研究過程中發現，后代小鼠雜合概率穩定于 85%～90%，其可能的機制有待進一步探究。
微型計算機斷層掃描（microCT）、微型正電子發射斷層掃描（microPET）等技術已被用于小動物腫瘤的體內成像[20]，但高成本和技術難度限制了這些成像技術的應用。因此，更符合成本效益原則，基于熒光和生物發光信號的光學成像技術得以廣泛應用于腫瘤研究的各個領域。Qin 等[21]更是將表達有綠色熒光蛋白-熒光素酶 2-鐵蛋白的質粒轉染肝癌細胞，然后皮下注射到小鼠體內，構建了一種既可定量分析又可空間定位的肝癌模型。本研究模型利用慢病毒向腸上皮細胞內導入熒光素酶基因作為報告基因來示蹤單個腸上皮細胞，使得可以在活體條件下研究單個腸上皮細胞的分化及轉歸。小動物活體顯像技術使得人們可以在個體層面定量、無創及動態地觀察動物體內的生理生化變化，提供了傳統動物模型無法獲得的重要信息[18]。在小鼠體內豐富的 ATP、氧氣和外源性熒光素的條件下，熒光素酶催化產生低背景和高信噪比的熒光信號，可以在活體情況下定量分析腫瘤細胞的數量，可以動態地觀察腫瘤的發生、發展過程[19]。
機體的免疫反應全程參與了結直腸癌的產生及進展過程，浸潤于腫瘤組織和腫瘤周圍區域的免疫細胞也被視為是影響患者預后的獨立預測指標[22]。本研究以 C57BL/6J 小鼠為遺傳背景所構建的模型與傳統的裸鼠種植模型相比，完整保留了小鼠的免疫功能，后期的進一步研究中可以利用結腸鏡系統在腫瘤發生、發展及轉移過程中分別對原發灶及周圍組織多次取材，用以探究局部免疫反應對結直腸癌發生、發展的影響。值得注意的是，機體的免疫反應對結直腸癌的發生和發展具有雙重作用[23-25]，一方面，機體的免疫細胞能夠特異性及非特異性地殺滅腫瘤細胞，從而發揮抑制腫瘤的作用；另一方面，腫瘤局部持續的免疫反應也可促進腫瘤生長、浸潤及通過免疫逃避介導腫瘤轉移。
總之，本研究所構建的雙轉基因小鼠模型保留了完整的免疫功能，能夠在活體狀態下動態研究機體免疫狀態與結直腸癌發生、發展和轉移的關系，同時該模型還進一步揭示了原癌基因 Kras 與抑癌基因 Smad4 之間的協同致癌作用。
結直腸癌發生是多步驟的過程，Kras 基因可以通過多種信號通路影響細胞不可控制的增殖和生長，參與結直腸癌發生的初始階段，在約 50% 的原發性結直腸癌患者中可以檢測到突變型 Kras[1]。Smad4 基因是細胞內信號傳遞介質家族成員，參與細胞生長和轉錄調控，扮演著腫瘤抑制因子的角色[2]；Smad4 表達缺失將導致結直腸上皮細胞增生活躍，導致腺瘤高發并呈現出癌變趨勢，還通過包括上皮間質轉化在內的機制表現出侵襲、轉移傾向[3-4]。基因工程小鼠模型作為一種近年來發展迅速的動物模型，可以特異性地修飾感興趣的目的基因，模擬與臨床類似的腫瘤，為精確研究基因與疾病的關系提供了可能[5]。本課題組構建了同時表達 KrasLSL-G12D/-和 Smad4loxp/loxp的雙轉基因散發性結直腸癌小鼠模型，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料
1.1.1 實驗動物
從美國杰克遜實驗室（The Jackson Laboratory）購買的 SPF 級 B6.129S4-Krastm4Tyj/J （008179）和 Stock Smad4tm2.1Cxd/J（017462）雌雄小鼠各 1 對，C57BL/6J 小鼠來自本課題組前期保種。B6.129S4-Krastm4Tyj/J 小鼠是在 Kras 基因上游插入了 Loxp-stop-Loxp（LSL）序列，Stock Smad4tm2.1Cxd/J 小鼠是在 Smad4 基因上下游分別插入了 Loxp 序列。Cre 重組酶可特異性識別 LSL 序列，利用慢病毒載體將 Cre 基因轉染入雙轉基因模型小鼠結直腸隱窩上皮細胞內，Cre 重組酶將對小鼠腸上皮細胞中 Kras 基因上游的終止序列以及 Smad4 基因序列進行特異性識別并切除，導致原癌基因 Kras 激活表達，誘導腸上皮細胞瘤變進而成癌。其基因重組模式見圖 1。
圖1
示 Cre 重組酶介導的基因重組模式圖
1.1.2 主要材料
小鼠結腸鏡系統，由 PENTAX FB-8V 改裝，日本；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀，ABI 公司，美國；凝膠成像系統，VILBER，法國；瓊脂糖凝膠電泳儀，六一生物公司，北京；鼠尾 DNA 提取試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司，北京；氯化鈣（CaCl2）轉染試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司，上海；IVIS 系統，PE 公司，美國；D-Luciferin，上海前塵生物科技有限公司，上海；引物，上海生工生物工程有限公司，上海。
1.2 動物飼養環境
實驗小鼠飼養于武漢大學動物實驗中心獨立通氣籠具系統（蘇州市蘇杭科技器材有限公司，蘇州），室溫 22～25 °C，相對濕度 60%～70%；小鼠飼養盒、墊料及飲用水均經過高溫高壓滅菌處理；小鼠繁殖飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司，北京）經輻照滅菌。
1.3 雙轉基因模型小鼠的構建
1.3.1 雙轉基因模型小鼠的培育與篩選
首先將 B6.129S4-Krastm4Tyj/J 小鼠與 C57BL/6J 小鼠雜交和反復回交，轉換其遺傳背景，以增強其存活和繁殖能力。利用普通 PCR 篩選出 C57BL/6J-KrasLSL-G12D/-/J 雜合子小鼠（由于該型純合子小鼠在母體子宮內已死亡，故只能篩選出雜合子小鼠，簡記為 KrasLSL-G12D/-）。同時將 Stock Smad4tm2.1Cxd/J 小鼠轉化遺傳背景后通過雜交和回交并利用普通 PCR 篩選出純合子小鼠，簡記為 Smad4loxp/loxp。最后將 KrasLSL-G12D/-和 Smad4loxp/loxp小鼠雜交形成雙雜合子的 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/-小鼠，再將此種基因型的雙雜合子小鼠自交，利用普通 PCR 和側交最終篩選出 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp品系小鼠，該小鼠即為本研究所構建的雙轉基因模型小鼠。
1.3.2 小鼠組織 DNA 提取
為提取實驗小鼠 DNA 進行基因型的鑒定與篩選，剪取 2 周齡實驗小鼠尾尖組織 4～6 mm 長，剪碎后置于 1.5 mL EP 管中，使用鼠尾 DNA 提取試劑盒提取小鼠組織 DNA，于 4 °C 保存備檢。
1.3.3 KrasLSL-G12D/- 的檢測
正向引物為5′-TGTCTTTCCCCAGCACAGT-3′（針對野生型）、5′-GCAGGTCGAGGGACCTAATA-3′（針對突變型）；反向引物均為5′-CTGCATAGTACGCTATACCCTGT-3′。PCR 擴增條件為：94 °C 變性 2 min；94 °C 15 s，60 °C15 s，72 °C 10 s，28 個循環；72 °C 2 min，4 °C 冷卻保溫。PCR 產物 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳 20 min，凝膠熒光成像系統下觀察，KrasLSL-G12D/-小鼠應擴增出 100 bp 和 250 bp 的片段，而野生型小鼠僅擴增出 250 bp 的片段。
1.3.4 Smad4loxp/loxp的檢測
正向引物為5′-TAAGAGCCACAGGGTCAAGC-3′，反向引物為5′-TTCCAGGAAAAACAGGGCTA-3′。PCR 擴增條件為：94 °C 預變性 2 min；94 °C 變性 20 s，65 °C 復性 15 s（每個循環溫度降低 0.5 °C），68 °C 延伸10 s，10 個循環；接著再 94 °C 變性 15 s，60 °C 復性 15 s，72 °C延伸 10 s，共 28 個循環；72 °C 延伸2 min，4 °C 保存。將PCR 產物 3% 瓊脂糖凝膠電泳30 min，Smad4loxp/loxp小鼠只擴增出 500 bp 的片段，而野生型小鼠則擴增出 500 bp 和 436 bp 的片段。
1.4 雙轉基因模型小鼠驗證
1.4.1 構建病毒載體
利用CaCl2轉染法進行病毒載體構建，慢病毒質粒為課題組前期構建的pHIV-Ubi-Puromycin-IRES-Luciferase和pHIV-Ubi-Puromycin-Cre-IRES-Luciferase（Luciferase 即熒光素酶基因用來示蹤單個細胞，以研究單個細胞的行為變化）；包裝質粒PMD2G（addgene12259）和PSPAX2（addgene12260），按照轉染試劑盒說明書進行操作，收取病毒后進行純化并測定病毒滴度， 然后于 –80 ℃下保存。將病毒載體分別簡記為 Lentivirus IRES-Luciferase和 LentivirusCre-IRES-Luciferase。
1.4.2 體外驗證 Cre 酶活性
取處于對數生長期狀態良好的小鼠結腸癌細胞 MCA38 用于慢病毒感染。在 12 孔板中接種 MCA38，在 37 °C、體積分數為 5% CO2 的培養箱中培養，待細胞密度達到60%~70%時用慢病毒顆粒感染細胞，在 IVIS 系統下觀察病毒載體體外感染效果。
1.4.3 Cre 重組酶誘導小鼠結腸上皮細胞突變
采用生理鹽水灌腸去除直腸及遠端結腸內的腸內容物，戊巴比妥鈉（10 mg/mL，50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，小鼠結腸鏡檢查腸道清潔情況，同時確定感染的部位，利用微量注射器向小鼠腸黏膜下注射 LentivirusCre-IRES-Luciferase（108 pfu），對照組注射 LentivirusIRES-Luciferase（108 pfu）。感染 1 周后，于小鼠腹腔內注射 D-Luciferin（150 μg/mL，10 μL/g），IVIS 系統下觀察熒光，調整病毒滴度和感染頻率以獲得僅 1～2 處成瘤病灶的小鼠模型（病毒滴度一般為108 pfu，每只小鼠注射量30 μL，用微量注射器通過結腸鏡下注射于結直腸腸黏膜下，可見黏膜隆起是注射深度正確的標志，一般注射1或2處）。然后每4周利用IVIS系統監測雙轉基因模型小鼠成瘤情況。
1.4.4 組織病理學檢查
待雙轉基因模型小鼠腫瘤形成后，將小鼠麻醉，解剖取出結腸并用 PBS 沖洗，在新制備的甲醛中固定 24 h，石蠟包埋切片后行蘇木精-伊紅（ HE ）染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織病理學變化，記錄結腸上皮細胞瘤變情況。
1.5 統計學方法
統計分析使用 GraphPad Prism 6 軟件。小鼠的繁殖學指標用均數±標準差（
±s）表示，雙轉基因模型小鼠與 C57BL/6J 小鼠的差異比較用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.050。
2 結果
2.1 雙轉基因模型小鼠 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp的檢測
目前共繁育出48只C57BL/6J小鼠，69只雙轉基因模型小鼠。構建的雙轉基因模型小鼠與 C57BL/6J 小鼠相比外形無明顯差別，見圖 2a。與 C57BL/6J 小鼠比較，雙轉基因模型小鼠的窩產仔數更多（P=0.038）、胎間隔時間短（P<0.001），見表 1。雙轉基因模型小鼠的基因鑒定結果見圖 2b，其中 1、2 和 3 號小鼠基因型為 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp，為本研究所構建的雙轉基因模型小鼠；4 號小鼠是培育過程中另一種常見的基因型，為 Kras-/-+Smad4loxp/loxp，該型小鼠在實驗過程中需剔除。
圖2
示雙轉基因構建結果及基因鑒定結果
a：為第 8 周時雙轉基因模型小鼠（右邊）與 C57BL/6J 小鼠（左邊）相比，其外觀無明顯差別；b：為雙轉基因模型小鼠的基因鑒定結果，從左往右的電泳圖依次為加 Kras 突變型引物、加 Kras 野生型引物和加 Smad4 引物；1、2 和 3 號泳道為構建的雙轉基因模型小鼠；4 號泳道為 Kras-/- +Smad4loxp/loxp小鼠；M 為 Marker
表1
兩種小鼠繁殖學指標比較結果（
）
2.2 LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase體外功能驗證
體外驗證病毒載體功能的 IVIS 下顯像結果見圖 3，LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase均能順利導入小鼠結腸癌細胞中并表現出熒光，間接驗證了 Cre 重組酶的功能。
圖3
示體外驗證慢病毒載體功能在 IVIS 系統下的顯像情況
a：為用 LentivirusIRES-Luciferase感染 MCA38 細胞；b：為用 LentivirusCre-IRES-Luciferase感染 MCA38 細胞；c：為未用病毒載體感染的 MCA38 細胞作為陰性對照
2.3 構建 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp雙轉基因小鼠散發性結直腸癌模型情況
圖4
示 LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase感染雙轉基因模型小鼠結腸上皮細胞后第 4、8 及12 周時 IVIS 系統下的熒光情況
a：為LentivirusCre-IRES-Luciferase感染；b：為LentivirusIRES-Luciferase感染
2.3.1 Cre 重組酶誘導小鼠結腸上皮細胞突變
用慢病毒感染雙轉基因模型小鼠結腸上皮細胞，在注射后第 4 周時 2 組小鼠熒光信號基本相同，在第 8 周至第 12 周時 LentivirusCre-IRES-Luciferase組的熒光信號較前有增強，而 LentivirusIRES-Luciferase組熒光信號出現衰減，甚至在第 8 周后已完全檢測不到。結果見圖 4。
圖5
示小鼠結腸上皮細胞 HE 染色結果
a：為構建的未被誘導突變模型小鼠腸道組織（HE ×100）；b：為模型小鼠經 Cre 酶誘導成瘤后的腫瘤組織（HE ×400）
2.3.2 瘤變組織病理學檢查結果
與正常的小鼠結直腸細胞相比，經病毒感染瘤變的組織行 HE 染色后鏡下可見細胞異型性增加，細胞核大而深染，核質比例增加，并散在黏液空泡，經病理檢查證實為腺癌，見圖 5。
3 討論
散發性結直腸癌的進展過程遵循腺瘤→腺癌→轉移的發展軸，其分子機制包括：染色體不穩定[6]、微衛星不穩定[7]及 CpG 島甲基化表型[8]，由此可見，散發性結直腸癌發病機制的多樣性使得單個動物模型難以模擬疾病進展全過程。
Hung 等[9]認為，一個理想的結直腸癌動物模型至少應該滿足：① 僅有一個或少數幾個原發成瘤病灶并具有一定的遠處轉移能力；② 原發病灶必須局限于結腸上皮細胞和肌層之間；③ 具有較短的成瘤周期及可預知的時間軸。本研究所構建的雙轉基因模型小鼠利用病毒載體注射誘導腸上皮細胞癌變，通過注射的深度來控制原發病灶的位置，同時還能通過注射病毒的滴度和劑量保證僅有少量原發病灶產生；由于觀察時間較短及多數成瘤小鼠因腸梗阻導致死亡影響了對遠處轉移能力的評估，在后期的實驗中可以利用腸道支架等方式延長模型小鼠的生命周期，以觀察腫瘤轉移情況。
結腸上皮細胞的更新依賴于結腸隱窩基底部的多能干細胞維持，當隱窩干細胞基因發生突變后，細胞的自我更新、克隆、增殖及分化超過了正常腸上皮細胞凋亡速度，則將導致腺瘤的形成。基因工程小鼠模型的巨大優勢在于利用相對簡易的基因修飾，實現目的基因在某一時段只在特定的組織表達或者失活，使模型具有特定的生物表型或特性，提供與散發性結腸癌相似的基因分子學改變，最大程度上模擬臨床狀態[10-11]，同時也減少基因重組對模型動物發育影響而導致的癌性損傷或胚胎死亡[12]，并且還能精確研究目的基因與疾病發生的關系[13]。本研究利用了慢病毒介導 Cre-loxp 重組酶系統感染小鼠結直腸隱窩上皮細胞，Cre 重組酶對結直腸隱窩-絨毛軸的上皮細胞進行選擇性基因修飾，激活致癌基因，誘導腸上皮細胞瘤變進而成癌。
腺瘤的形成常常起始于抑癌基因（如 APC 基因等）失活，通過 Wnt 信號的持續激活導致腺瘤的形成；從腺瘤向腺癌的轉變往往還需要額外的分子事件，如原癌基因 Kras 的激活；在散發性結腸癌中常可見到突變的 Kras，并與腫瘤侵襲性及對化療藥物耐藥相關，常常預示著患者不好的預后[14]。此外，突變的 Kras 可以與失活的抑癌基因如 Smad4 協同作用，以增強促進腫瘤生長和侵襲性的 Wnt 信號[15]。Smad4 基因的表達缺失在早期胃腸道腫瘤中就可見到，特別是在低分化腫瘤細胞及印戒細胞癌中更為普遍。研究[16]發現，轉化生長因子-β/Smad4 基因低表達將會導致結直腸癌具有更高的增殖和轉移傾向。Luo 等[17]研究發現，在構建的 LSL-KrasG12D+ApcΔ14/+雙轉基因小鼠中，Cre 誘導的成瘤與那些單轉基因 ApcΔ14/+小鼠相比，腫瘤細胞的分化程度更差，侵襲性更強，成瘤率也更高。本研究的前期預實驗結果也證實了雙轉基因小鼠的成瘤率比單轉基因高。需要注意的是，本研究所構建的雙轉基因模型小鼠的基因型為部分雜合，每一代小鼠均需用普通 PCR 進行基因檢測；有趣的是，根據孟德爾遺傳定律，后代小鼠中雜合概率理論上為 50%，但我們在研究過程中發現，后代小鼠雜合概率穩定于 85%～90%，其可能的機制有待進一步探究。
微型計算機斷層掃描（microCT）、微型正電子發射斷層掃描（microPET）等技術已被用于小動物腫瘤的體內成像[20]，但高成本和技術難度限制了這些成像技術的應用。因此，更符合成本效益原則，基于熒光和生物發光信號的光學成像技術得以廣泛應用于腫瘤研究的各個領域。Qin 等[21]更是將表達有綠色熒光蛋白-熒光素酶 2-鐵蛋白的質粒轉染肝癌細胞，然后皮下注射到小鼠體內，構建了一種既可定量分析又可空間定位的肝癌模型。本研究模型利用慢病毒向腸上皮細胞內導入熒光素酶基因作為報告基因來示蹤單個腸上皮細胞，使得可以在活體條件下研究單個腸上皮細胞的分化及轉歸。小動物活體顯像技術使得人們可以在個體層面定量、無創及動態地觀察動物體內的生理生化變化，提供了傳統動物模型無法獲得的重要信息[18]。在小鼠體內豐富的 ATP、氧氣和外源性熒光素的條件下，熒光素酶催化產生低背景和高信噪比的熒光信號，可以在活體情況下定量分析腫瘤細胞的數量，可以動態地觀察腫瘤的發生、發展過程[19]。
機體的免疫反應全程參與了結直腸癌的產生及進展過程，浸潤于腫瘤組織和腫瘤周圍區域的免疫細胞也被視為是影響患者預后的獨立預測指標[22]。本研究以 C57BL/6J 小鼠為遺傳背景所構建的模型與傳統的裸鼠種植模型相比，完整保留了小鼠的免疫功能，后期的進一步研究中可以利用結腸鏡系統在腫瘤發生、發展及轉移過程中分別對原發灶及周圍組織多次取材，用以探究局部免疫反應對結直腸癌發生、發展的影響。值得注意的是，機體的免疫反應對結直腸癌的發生和發展具有雙重作用[23-25]，一方面，機體的免疫細胞能夠特異性及非特異性地殺滅腫瘤細胞，從而發揮抑制腫瘤的作用；另一方面，腫瘤局部持續的免疫反應也可促進腫瘤生長、浸潤及通過免疫逃避介導腫瘤轉移。
總之，本研究所構建的雙轉基因小鼠模型保留了完整的免疫功能，能夠在活體狀態下動態研究機體免疫狀態與結直腸癌發生、發展和轉移的關系，同時該模型還進一步揭示了原癌基因 Kras 與抑癌基因 Smad4 之間的協同致癌作用。
