目的 設計、構建并篩選出轉染至人骨肉瘤細胞系OS-9901，對c-myc 沉默效果最佳的復制缺陷型重組腺病毒質粒pAd-c-myc- 短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）包裝出表達c-myc-shRNA 的重組腺病毒，并測定其滴度。 方法 設計有shRNA 結構的3 對單鏈寡核苷酸（ss oligos），經變性退火為雙鏈寡核苷酸（ds oligos），插入穿梭質粒pENTR/U6 載體，測序正確后，經LipofectamineTM2000 陽離子脂質體介導入人骨肉瘤細胞系OS-9901，采用RTPCR篩選對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA，然后與腺病毒骨架質粒行同源重組，篩選出正確重組子。采用293A 細胞包裝出表達c-myc-shRNA 的復制缺陷型重組腺病毒，觀察其細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），采用病毒顆粒法（viral particles，VP）和50% 組織培養感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測定病毒滴度。 結 果 電泳驗證后的ds oligos 插入穿梭質粒pENTR/U6 載體，測序結果提示構建的pENTR/U6-shRNA 質粒正確。從3 對ds oligos 通過RT-PCR 方法篩選出對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA，經Pac Ⅰ酶切線性化后同源重組成功構建了介導c-myc-shRNA 復制缺陷型重組腺病毒，CPE 和空泡現象 3 d 開始出現，6 d 更加明顯。采用VP法測定的第1 代腺病毒滴度為5.23 × 109 VP/mL，經3 ～ 4 代擴增后可達2.26 × 1012 VP/mL。TCID50 證實病毒滴度為10-3.8/0.1 mL。 結論 通過RNA 干擾技術，體外成功構建了介導shRNA-c-myc 復制缺陷型重組腺病毒。
目的 構建沉默環氧化酶-2（COX-2）基因重組慢病毒，觀察其體外侵襲的抑制作用，從而探討干擾COX-2抑制喉癌細胞增殖的作用機理，為喉癌的治療提供新的思路。 方法 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測COX-2基因在人表皮樣喉癌細胞（Hep-2）中的表達情況。利用上海吉凱公司RNA干擾（RNAi）慢病毒表達載體系統，構建針對COX-2基因慢病毒RNAi表達載體。轉染Hep-2細胞，干擾COX-2基因的表達，實時定量PCR檢測干擾前后基因表達變化。利用生長曲線測定干擾載體轉染前后細胞生長速度變化。流式細胞儀檢測細胞的生長周期。Boyden侵襲小室法測定體外侵襲力。 結果 成功構建了COX-2慢病毒RNAi表達載體，并建立了干擾COX-2基因的Hep-2細胞系。實時定量PCR檢測COX-2基因在Hep-2細胞系中過表達被顯著抑制。生長曲線測定，COX-2基因干擾后細胞增殖明顯變慢。流式細胞儀檢測細胞的生長周期可見干擾組誘導Hep-2細胞凋亡，轉染G0～G1期細胞數量明顯上升，S期細胞減少，表明siRNA干擾Hep-2細胞后，細胞由G0～G1期進入到S期受到阻滯，細胞增殖速度下降。體外侵襲實驗中，Hep-2-AS侵襲細胞數（31.0 ± 1.8）顯著低于Hep-2細胞（104.0 ± 2.6）及Hep-2-P細胞（99.0 ± 2.7），差異有統計學意義（P＜0.05）。 結論 喉癌中過表達的COX-2基因被干擾后表達明顯降低并顯著抑制細胞的生長速度和侵襲能力。同時驗證了COX-2基因RNA干擾在進行抗腫瘤的治療中潛在的應用前景。
目的 采用RNA干擾技術沉默CCS（copper chaperone for SOD1）基因，構建相關小干擾RNA（siRNA），探索出針對CCS的高效siRNA序列。 方法 合成用于人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）細胞中沉默CCS基因的siRNA。應用脂質體轉染的方法在HUVEC細胞中對CCS基因進行RNA沉默。蛋白免疫印跡Western blotting檢測沉默前后CCS蛋白表達變化的情況，甲基四唑藍法MTT檢測轉染前后細胞活力。最后用單因素方差分析對數據進行統計學分析，以確定有效的siRNA序列。 結果 轉染前后細胞形態無肉眼可見變化，轉染后細胞活力分別為98.5%和98.8%。CCS蛋白沉默率分別為63.7%和61.4%。 結論 采用siCCS-2和siCCS-3序列轉染條件對HUVEC細胞活力損傷小，CCS沉默效率高，實驗條件穩定，重復性好。為我們繼續研究沉默CCS后抑制血管內皮細胞的生長增殖、血管形成提供了穩定的實驗基礎。
目的探索以小干擾RNA（siRNA）慢病毒干擾載體組建的慢病毒對人HepG2細胞分化抑制蛋白1（Id1）基因的沉默效應。 方法構建4種針對Id1基因不同干擾靶點的Id1-siRNA慢病毒干擾載體（pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4），將其轉染至293T細胞，以篩選出針對Id1基因的最有效的RNA干擾（RNAi）靶序列。再以沉默效果最優的干擾載體進一步構建慢病毒（Id1-RNAi-LV），感染人HepG2細胞后，采用實時定量PCR法和Western blot法分別檢測其Id1 mRNA及其蛋白的表達水平。 結果與pCGSIL-GFP-Id1-1組、pCGSIL-GFP-Id1-2組及pCGSIL-GFP-Id1-3組比較，pCGSIL-GFP-Id1-4組的Id1蛋白表達水平最低（P＜0.05），沉默效果最優。以pCGSIL-GFP-Id1-4干擾載體組建慢病毒后，測得慢病毒的病毒滴度為2.0×109 TU/mL。與空白對照組和陰性對照組比較，以組建的慢病毒感染人HepG2細胞后，人HepG2細胞中Id1 mRNA及其蛋白的表達水平均降低（P＜0.05）。 結論本實驗構建的特異性慢病毒可穩定地介導Id1基因的沉默。
目的觀察探討鈣結合蛋白S100A4基因靜默對氧誘導視網膜新生血管(RNV)的抑制作用及其機制。 方法7日齡C57BL/6J小鼠150只隨機分為正常組、正常-病毒對照組、單純模型組、基因治療組、空白載體組, 每組30只。正常組、正常-病毒對照組小鼠在常氧環境下飼養; 其余3組小鼠建立氧誘導視網膜病變模型。小鼠12日齡時, 基因治療組及空白載體組小鼠雙眼玻璃體腔注射病毒滴度為1.0×109 PFU/ml的攜帶針對S100A4小干擾RNA的重組腺病毒載體(Ad-S100A4-RNAi)和帶綠色熒光蛋白的空白腺病毒載體各1.0μl; 正常-病毒對照組小鼠玻璃體腔注射同樣滴度的等量Ad-S100A4-RNAi。正常組及單純模型組小鼠不做任何處理。小鼠15日齡時, 基因治療組和正常組作視網膜組織冰凍切片觀察病毒轉染情況。小鼠17日齡時, 各組作視網膜組織切片, 計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核; 作全視網膜鋪片免疫熒光染色, 觀察視網膜血管變化; 蛋白免疫印跡法(Western blot)及實時PCR檢測小鼠視網膜S100A4、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)、半胱天冬酶(Caspase)-3及環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)的蛋白和mRNA表達。 結果熒光顯微鏡觀察發現, 正常組小鼠視網膜未見病毒綠色熒光, 僅可見少量自身熒光; 基因治療組小鼠視網膜神經節細胞層、內叢狀層、內核層、外叢狀層可見病毒綠色強熒光, 外核層可見少量弱熒光。單純模型組突破內界膜的血管內皮細胞核計數較正常組明顯增加, 差異有統計學意義(t=15.68, P＜0.05);基因治療組突破內界膜的血管內皮細胞核計數較單純模型組、空白載體組明顯下降, 差異均有統計學意義(t=13.61、14.64, P＜0.05)。與單純模型組、空白載體組比較, 基因治療組小鼠RNV面積、無灌注區面積明顯減少, 差異均有統計學意義(P＜0.05)。Western blot及實時PCR檢測結果顯示, 與單純模型組、空白載體組比較, 基因治療組小鼠視網膜S100A4、bcl-2、CREB蛋白及mRNA表達明顯下調, 差異均有統計學意義(P＜0.05);Caspase-3蛋白及mRNA表達明顯上調, 差異有統計學意義(P＜0.05)。 結論S100A4基因靜默可抑制氧誘導RNV。其機制可能與S100A4基因靜默下調bcl-2、CREB表達, 上調Caspase-3表達作用有關。
本文為研究 Snail1 基因對喉鱗癌細胞株 Hep-2 緊密連接蛋白表達及遷移能力的影響，將含有 Snail1 基因的短發夾 RNA（Sh-RNA）的質粒轉染喉鱗癌細胞株 Hep-2，培養出可穩定傳代的 Snail1 基因沉默的細胞（命名為 Sh-snail1 細胞）。課題組以蛋白免疫印跡技術檢測緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表達是否發生變化。然后設計傷口愈合實驗檢測其遷移能力，再以蛋白免疫印跡技術檢測與細胞遷移能力密切相關的 RhoGTP 酶家族重要成員 RhoA、Cdc42 蛋白的表達變化。結果表明，Sh-snail1 細胞緊密連接關鍵蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達明顯上調，遷移能力明顯減弱，且 RhoA、Cdc42 蛋白表達下調。該研究表明，喉鱗癌 Hep-2 細胞通過下調 Snail1 基因的表達使細胞間連接更加緊密，同時抑制 Hep-2 細胞的遷移能力，下調 RhoA、Cdc42 蛋白的表達。本文研究結果證實，Snail1 基因與 Hep-2 細胞轉移過程中的細胞間緊密連接打開以及細胞遷移能力增強密切相關，為靶向治療喉鱗癌提供分子機制的研究依據。
目的探討小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）慢病毒介導沉默 P75 神經生長因子受體（P75 neurotrophin receptor，P75NTR）基因對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響。方法首先設計 3 條慢病毒介導 P75NTR 基因的 siRNA 序列（P75NTR-siRNA-1、2、3）以及陰性對照（negative control，NC）-siRNA，分別轉染第3 代 SD 大鼠 BMSCs；倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測細胞 P75NTR 基因及蛋白表達情況，并篩選沉默效果最佳的 P75NTR-siRNA 進行后續成骨分化實驗。取第 3 代 SD 大鼠 BMSCs，隨機分為實驗組、陰性對照組及空白對照組；其中，陰性對照組及實驗組分別采用 NC-siRNA 及篩選的 P75NTR-siRNA 慢病毒載體轉染 BMSCs，空白對照組為正常 BMSCs。采用 MTT 法檢測轉染后細胞增殖情況；各組細胞經成骨誘導分化培養后，Western blot 檢測成骨相關蛋白［骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）及 Runx 相關轉錄因子 2（Runx related transcription factor 2，Runx2）］表達，免疫組織化學染色觀察Ⅰ型膠原表達情況，ALP 檢測以及茜素紅染色觀察成骨情況。結果慢病毒介導 P75NTR 基因轉染 BMSCs 后，其 P75NTR mRNA 及蛋白表達量均明顯降低（P<0.05），其中 P75NTR-siRNA-3 沉默效果最佳。P75NTR 基因沉默后，MTT 檢測示實驗組細胞增殖較兩對照組明顯增快（P<0.05）。成骨誘導分化培養后，實驗組 OCN 及 Runx2 蛋白相對表達量、Ⅰ 型膠原蛋白表達、ALP 活力均明顯高于兩對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；且隨成骨誘導時間延長，礦化結節逐漸增多。結論siRNA 慢病毒沉默 P75NTR 基因可以促進大鼠 BMSCs 成骨分化，為治療骨缺損提供了新思路。