引用本文： 程谷萌, 賀濤, 邢怡橋. 鈣結合蛋白S100A4基因靜默對氧誘導視網膜新生血管的抑制作用及其機制. 中華眼底病雜志, 2016, 32(1): 52-57. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.01.013 復制
視網膜組織缺血缺氧可引起視網膜新生血管(RNV)的形成，但其形成機制目前還不甚明了。鈣結合蛋白S100A4是S100鈣結合蛋白家族成員之一，其EF雙螺旋氨基酸序列結構能與鈣離子結合從而發揮其生物學效應。S100A4分布于細胞核、細胞漿及細胞間隙并具有調節新生血管生成、細胞存活、遷移等生物學功能[1]。已有研究證實，S100A4蛋白作為促血管發生因子，可通過增強內皮細胞的移動性，減少血管生成抑制因子的產生而促進腫瘤新生血管的生成[2]。而目前關于S100A4在眼部新生血管，尤其是RNV形成中的作用及機制尚不明確。為此，本研究通過靜默氧誘導視網膜病變(OIR)模型小鼠視網膜S100A4基因，探討S100A4在RNV形成中的作用及其機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
7日齡C57/BL6小鼠150只，雌雄不限，由武漢大學A3實驗動物中心提供。攜帶針對S100A4小干擾RNA的重組腺病毒載體(Ad-S100A4-RNAi)、帶綠色熒光蛋白(GFP)的空白腺病毒載體(Ad-GFP)由上海吉凱基因有限公司提供，病毒滴度均為4.0×109 PFU/ml。采用隨機數字表法將小鼠分為正常組、正常-病毒對照組、基因治療組、單純模型組、空白載體組，每組30只。正常組、正常-病毒對照組小鼠在常氧環境下飼養。其余3組小鼠與哺乳母鼠同置于氧濃度為(75±2)%的氧箱內，測氧儀每日4次監測氧箱內氧濃度；飼養5 d后即小鼠12日齡時取出小鼠，轉移至正常氧濃度環境中繼續飼養5 d，建立OIR模型[3]。小鼠12日齡時，基因治療組及空白載體組小鼠于角鞏緣后0.5 mm處用配有32G針頭的微量注射器(美國Hamilton公司)分別對雙眼行玻璃體腔注射病毒滴度為1.0×109 PFU/ml的Ad-S100A4-RNAi和Ad-GFP各1.0μl；正常-病毒對照組小鼠玻璃體腔注射同樣滴度的等量Ad-S100A4-RNAi。注射完畢后針頭停留在眼內約10~15 s后迅速拔出，給予妥布霉素眼膏涂眼。正常組及單純模型組小鼠不做任何處理。
小鼠15日齡時，取基因治療組和正常組小鼠各2只，頸椎脫臼法處死摘除眼球后行視網膜凍頭制作[4]。用冰切機(CM1900，德國萊卡公司)將視杯經視神經矢狀切成12μm的切片，用抗GFP抗體孵育(ab190203，美國Abcam公司)加強其綠色熒光后在熒光顯微鏡下觀察病毒轉染情況。
小鼠17日齡時，取各組小鼠4~6只，頸椎脫臼法處死后摘除眼球。放入4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h。常規酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，與視神經矢狀軸平行連續切片，相鄰2張切片間隔30μm。每只眼球取切片10張行蘇木精-伊紅(HE)染色，雙盲計數法在光學顯微鏡400倍鏡下，每張切片取3個視野計數，統計突破內界膜的血管內皮細胞核數目。
小鼠17日齡時，取各組小鼠4只，頸椎脫臼法處死后摘除眼球。去除眼前節后于4%多聚甲醛固定1 h，PBS溶液中漂洗后顯微鏡下去除鞏膜及色素膜，平鋪視網膜后去除表面玻璃體。PBS溶液漂洗視網膜后于5%牛血清白蛋白封閉液(BSAT)中室溫封閉2 h，加入西非單葉豆凝集素(1：200，美國Invitrogen公司)孵育3 d。孵育完成后再次將視網膜置于PBS溶液中漂洗后封片。熒光顯微鏡下觀察視網膜血管變化。
采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測S100A4、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)、半胱天冬酶(Caspase)-3及環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)蛋白表達。小鼠17日齡時，取各組小鼠10只，斷椎處死后摘除眼球，取出視網膜組織，于-80℃冰箱保存。提取蛋白后，二喹啉甲酸法測蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、封閉、孵育S100A4(1：100)、bcl-2(1：1000)、Caspase-3(1：1000)、CREB(1：1000)、β-肌動蛋白(β-actin，1：10 000)等相應抗體后行顯色、定影、顯影。采用Image-J分析條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin的灰度值之比反映目的蛋白的表達水平。
采用實時PCR檢測S100A4、bcl-2、Caspase-3及CREB mRNA表達。小鼠17日齡時，取各組小鼠10只，斷椎處死后摘除眼球，取出視網膜組織勻漿提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。配制25μl PCR反應體系。S100A4：上游引物5′-GTGTCCACCTTCCA CAAATACTCA-3′，下游引物5′-ACTTCATTGTC CCTGTTGCTGTC-3′，擴增片段長度173堿基對(bp)；bcl-2：上游引物5′-AGCCCACCGTAACAA TCAAG-3′，下游引物5′-CCTGTCCCTTTGTCTT CAGC-3′，擴增片段長度147 bp；Caspase-3：上游引物5′-GGGCCTGTTGAACTGA-3′，下游引物5′-CCGTCCTTTGAATTTCTCCA-3′，擴增片段長度242 bp；CREB：上游引物5′-TCAGCCGGGTACTA CCATTC-3′，下游引物5′-CTCTCTCTTCCGTGCT GCTT-3′，擴增片段長度217 bp；β-actin：上游引物5′-CTGAGAGGGA AATCGTGCGT-3′，下游引物5′-CCACAGGATTCC ATACCCAAGA-3′，擴增片段長度240 bp。
采用SPSS13.0統計學軟件行統計學分析，實驗數據以均數±標準差(
2 結果
熒光顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜未見病毒綠色熒光，僅可見少量自身熒光(圖 1A)；基因治療組小鼠視網膜神經節細胞層(GCL)、內叢狀層(IPL)、內核層(INL)、外叢狀層(OPL)可見病毒綠色強熒光，外核層(ONL)可見少量弱熒光(圖 1B)。
圖1
小鼠視網膜熒光顯微鏡像。1A.正常組，各層視網膜自身弱熒光；1B.基因治療組，小鼠視網膜GCL、IPL、INL、OPL均見強熒光，ONL可見少量弱熒光標尺：50μm
光學顯微鏡觀察發現，正常組、正常-病毒對照組小鼠視網膜均未見突破內界膜的血管內皮細胞核(圖 2A，2B)；基因治療組小鼠視網膜僅見少許突破內界膜的血管內皮細胞核(圖 2C)；單純模型組、空白載體組小鼠視網膜均可見大量突破內界膜伸向玻璃體腔的血管內皮細胞核(圖 2D，2E)。5組間突破內界膜的血管內皮細胞核計數比較，差異有統計學意義(F=144.20，P＜0.05)。單純模型組突破內界膜的血管內皮細胞核計數較正常組明顯增加比較，差異有統計學意義(t=15.68，P＜0.05)；基因治療組突破內界膜的血管內皮細胞核計數較單純模型組、空白載體組明顯下降，差異均有統計學意義(t=13.61、14.64，P＜0.05)(圖 3)。
圖2
小鼠視網膜光學顯微鏡像。2A.正常組；2B.正常-病毒對照組；2C.基因治療組；2D.單純模型組；2E.空白載體組。正常組、正常-病毒對照組小鼠視網膜均未見突破內界膜的血管內皮細胞核；基因治療組小鼠視網膜僅見少許突出內界膜的血管內皮細胞核(黑箭)；單純模型組、空白載體組小鼠視網膜均可見大量突破內界膜伸向玻璃體腔的血管內皮細胞核(黑箭) HE標尺：100μm
圖3
各組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核計數比較。*P＜0.05
熒光顯微鏡觀察發現，正常組、正常-病毒對照組小鼠視網膜表層與深層血管分布均勻，未見血管閉塞以及新生血管(圖 4A，4B)；基因治療組小鼠視網膜血管走行基本均勻，可見少量無灌注區及新生血管(圖 4C)；單純模型組小鼠視網膜中周部大量新生血管形成，后極部大片無灌注區(圖 4D)；空白載體組小鼠視網膜中周部大片無灌注區及大量新生血管形成(圖 4E)。5組小鼠RNV面積、無灌注區面積比較，差異均有統計學意義(F=149.50、122.50，P＜0.05)。與單純模型組、空白載體組比較，基因治療組小鼠RNV面積(t=12.75、11.37)、無灌注區面積(t=12.09、10.89)明顯減少，差異均有統計學意義(P＜0.05)(圖 5)。
圖4
小鼠視網膜熒光顯微鏡像。4A.正常組；4B.正常-病毒對照組；4C.基因治療組；4D.單純模型組；4E.空白載體組。正常組、正常-病毒對照組小鼠視網膜表層與深層血管分布均勻，未見血管閉塞以及新生血管；基因治療組小鼠視網膜血管走行基本均勻，可見少量新生血管(白箭)及無灌注區(黃箭)；單純模型組小鼠視網膜中周部大量新生血管形成(白箭)，后極部大片無灌注區(黃箭)；空白載體組小鼠視網膜中周部大量新生血管形成(白箭)及大片無灌注區(黃箭)標尺：2500μm
圖5
各組小鼠視網膜無灌注區及RNV面積比較。*基因治療組與單純模型組間、空白載體組間比較，P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，5組小鼠視網膜S100A4、bcl-2、Caspase-3和CREB蛋白表達比較，差異均有統計學意義(F=32.41，P＜0.05)。與正常組比較，正常-病毒對照組、基因治療組小鼠視網膜S100A4蛋白表達明顯下調，差異有統計學意義(t=4.12、3.42，P＜0.05)。與單純模型組、空白載體組比較，基因治療組小鼠視網膜S100A4(t=5.85、6.13)、bcl-2(t=3.63、3.36)、CREB(t=2.96、3.40)蛋白表達明顯下調，差異均有統計學意義(P＜0.05)；Caspase-3蛋白表達明顯上調，差異有統計學意義(t=3.55、3.14，P＜0.05)(圖 6)。
圖6
各組小鼠視網膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB蛋白表達比較。*P＜0.05
實時PCR檢測結果顯示，5組小鼠視網膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB mRNA表達比較，差異均有統計學意義(F=184.60，P＜0.05)。與正常組比較，正常-病毒對照組、基因治療組小鼠視網膜S100A4 mRNA表達明顯下調，差異有統計學意義(t=6.03、4.09，P＜0.05)。與單純模型組、空白載體組比較，基因治療組小鼠視網膜S100A4(t=11.29、10.44)、bcl-2(t=4.09、2.81)、CREB(t=6.37、5.38)mRNA表達明顯下調，差異均有統計學意義(P＜0.05)；Caspase-3 mRNA表達明顯上調，差異有統計學意義(t=4.37、3.67，P＜0.05)(圖 7)。
圖7
各組小鼠視網膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB mRNA表達比較。*P＜0.05
3 討論
S100蛋白最初是從牛腦中分離出的一種可溶性酸性蛋白，隸屬于鈣離子結合蛋白家族，作為S100蛋白家族成員之一在體內具有多種生物學功能[5]。既往研究表明，S100A4可通過增加腫瘤細胞的運動性，減少腫瘤細胞間的黏附，抑制細胞凋亡來促進腫瘤的侵襲與轉移[6-8]。近年來研究發現，S100A4在腫瘤新生血管的形成過程中也扮演著重要的角色[2]。但有關S100A4在眼部新生血管形成過程中是否發揮作用及其機制尚不明確。因此，我們通過建立OIR模型，觀察探討了S100A4基因靜默對氧誘導RNV形成的抑制作用及其可能機制。
本研究結果顯示，單純模型組突破內界膜的血管內皮細胞核計數、新生血管面積均大于正常組。說明OIR模型建立成功。在預實驗中，我們通過設定重組腺病毒滴度梯度最終確定玻璃體腔注射病毒滴度為1.0×109 PFU/ml，轉染時間為3 d時其轉染效率最佳。通過對不同組別S100A4蛋白表達量的檢測發現，基因治療組和正常-病毒對照組S100A4蛋白表達量較其他組明顯下降。證實S100A4-RNAi重組腺病毒可有效抑制S100A4蛋白的表達。
我們還發現，基因治療組突破內界膜的血管內皮細胞核數目較單純模型組和空白載體組明顯減少。說明抑制S100A4蛋白的表達可減少RNV的形成。此外，我們通過對視網膜鋪片的血管染色觀察，發現基因治療組小鼠新生血管面積較單純模型組和空白載體組明顯減少。進一步證明抑制S100A4蛋白的表達對新生血管的抑制作用。視網膜無灌注區的形成是誘發后期RNV形成的重要因素，其面積的大小與病理性新生血管形成的嚴重程度密切相關。本研究結果也證實了抑制S100A4蛋白的表達可明顯減小視網膜無灌注區的面積。因此，我們認為，抑制S100A4蛋白的表達對RNV的形成具有顯著的抑制作用。
CREB是一種真核生物細胞核內蛋白質，作為轉錄因子在不同的組織和器官中都能起到調節新生血管發生發展的作用[9-11]。作為CREB的目標基因，bcl-2的-1640與-1529位點之間有一個環磷酸腺苷反應元件蛋白，在被CREB激活后可調控bcl-2的表達水平[12, 13]。而bcl-2具有抑制凋亡的作用，并且在新生血管的發生發展中具有促進作用。我們通過檢測各組小鼠視網膜中上述因子的蛋白和mRNA表達，以期探討S100A4基因靜默對RNV抑制作用的可能機制。結果顯示，單純模型組bcl-2、CREB的蛋白和mRNA表達量較正常組均有上調。這可能是因為缺氧導致CREB的激活增加從而促進了bcl-2的抗凋亡效應。相反的是，基因治療組bcl-2、CREB的蛋白和mRNA表達量較單純模型組和空白載體組明顯降低。這可能是由于S100A4基因靜默能減少CREB的表達，進而降低了bcl-2的抗凋亡作用。
Caspase-3可通過內源性和外源性凋亡通路被激活，引起bcl-2蛋白的激活[14]。且已有研究證實Caspase-3在抗腫瘤新生血管中的作用[15, 16]。為了進一步證實S100A4基因靜默可抑制RNV形成這一結論，我們對Caspase-3蛋白和mRNA表達進行了檢測。結果顯示，基因治療組小鼠視網膜Caspase-3的蛋白和mRNA表達量較單純模型組和空白載體組明顯上調。說明在OIR小鼠模型中，S100A4基因靜默可促進Caspase-3的促凋亡作用。
本研究結果表明，在OIR小鼠模型中，S100A4基因靜默可減少視網膜病理性新生血管，減小視網膜無灌注區面積。這一作用可能是由S100A4基因靜默可降低CREB的表達量從而減弱bcl-2的抗凋亡效應，而同時促進Caspase-3的促凋亡效應引起的。提示S100A4可能成為治療RNV疾病的新靶點。
視網膜組織缺血缺氧可引起視網膜新生血管(RNV)的形成，但其形成機制目前還不甚明了。鈣結合蛋白S100A4是S100鈣結合蛋白家族成員之一，其EF雙螺旋氨基酸序列結構能與鈣離子結合從而發揮其生物學效應。S100A4分布于細胞核、細胞漿及細胞間隙并具有調節新生血管生成、細胞存活、遷移等生物學功能[1]。已有研究證實，S100A4蛋白作為促血管發生因子，可通過增強內皮細胞的移動性，減少血管生成抑制因子的產生而促進腫瘤新生血管的生成[2]。而目前關于S100A4在眼部新生血管，尤其是RNV形成中的作用及機制尚不明確。為此，本研究通過靜默氧誘導視網膜病變(OIR)模型小鼠視網膜S100A4基因，探討S100A4在RNV形成中的作用及其機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
7日齡C57/BL6小鼠150只，雌雄不限，由武漢大學A3實驗動物中心提供。攜帶針對S100A4小干擾RNA的重組腺病毒載體(Ad-S100A4-RNAi)、帶綠色熒光蛋白(GFP)的空白腺病毒載體(Ad-GFP)由上海吉凱基因有限公司提供，病毒滴度均為4.0×109 PFU/ml。采用隨機數字表法將小鼠分為正常組、正常-病毒對照組、基因治療組、單純模型組、空白載體組，每組30只。正常組、正常-病毒對照組小鼠在常氧環境下飼養。其余3組小鼠與哺乳母鼠同置于氧濃度為(75±2)%的氧箱內，測氧儀每日4次監測氧箱內氧濃度；飼養5 d后即小鼠12日齡時取出小鼠，轉移至正常氧濃度環境中繼續飼養5 d，建立OIR模型[3]。小鼠12日齡時，基因治療組及空白載體組小鼠于角鞏緣后0.5 mm處用配有32G針頭的微量注射器(美國Hamilton公司)分別對雙眼行玻璃體腔注射病毒滴度為1.0×109 PFU/ml的Ad-S100A4-RNAi和Ad-GFP各1.0μl；正常-病毒對照組小鼠玻璃體腔注射同樣滴度的等量Ad-S100A4-RNAi。注射完畢后針頭停留在眼內約10~15 s后迅速拔出，給予妥布霉素眼膏涂眼。正常組及單純模型組小鼠不做任何處理。
小鼠15日齡時，取基因治療組和正常組小鼠各2只，頸椎脫臼法處死摘除眼球后行視網膜凍頭制作[4]。用冰切機(CM1900，德國萊卡公司)將視杯經視神經矢狀切成12μm的切片，用抗GFP抗體孵育(ab190203，美國Abcam公司)加強其綠色熒光后在熒光顯微鏡下觀察病毒轉染情況。
小鼠17日齡時，取各組小鼠4~6只，頸椎脫臼法處死后摘除眼球。放入4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h。常規酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，與視神經矢狀軸平行連續切片，相鄰2張切片間隔30μm。每只眼球取切片10張行蘇木精-伊紅(HE)染色，雙盲計數法在光學顯微鏡400倍鏡下，每張切片取3個視野計數，統計突破內界膜的血管內皮細胞核數目。
小鼠17日齡時，取各組小鼠4只，頸椎脫臼法處死后摘除眼球。去除眼前節后于4%多聚甲醛固定1 h，PBS溶液中漂洗后顯微鏡下去除鞏膜及色素膜，平鋪視網膜后去除表面玻璃體。PBS溶液漂洗視網膜后于5%牛血清白蛋白封閉液(BSAT)中室溫封閉2 h，加入西非單葉豆凝集素(1：200，美國Invitrogen公司)孵育3 d。孵育完成后再次將視網膜置于PBS溶液中漂洗后封片。熒光顯微鏡下觀察視網膜血管變化。
采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測S100A4、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)、半胱天冬酶(Caspase)-3及環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)蛋白表達。小鼠17日齡時，取各組小鼠10只，斷椎處死后摘除眼球，取出視網膜組織，于-80℃冰箱保存。提取蛋白后，二喹啉甲酸法測蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、封閉、孵育S100A4(1：100)、bcl-2(1：1000)、Caspase-3(1：1000)、CREB(1：1000)、β-肌動蛋白(β-actin，1：10 000)等相應抗體后行顯色、定影、顯影。采用Image-J分析條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin的灰度值之比反映目的蛋白的表達水平。
采用實時PCR檢測S100A4、bcl-2、Caspase-3及CREB mRNA表達。小鼠17日齡時，取各組小鼠10只，斷椎處死后摘除眼球，取出視網膜組織勻漿提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。配制25μl PCR反應體系。S100A4：上游引物5′-GTGTCCACCTTCCA CAAATACTCA-3′，下游引物5′-ACTTCATTGTC CCTGTTGCTGTC-3′，擴增片段長度173堿基對(bp)；bcl-2：上游引物5′-AGCCCACCGTAACAA TCAAG-3′，下游引物5′-CCTGTCCCTTTGTCTT CAGC-3′，擴增片段長度147 bp；Caspase-3：上游引物5′-GGGCCTGTTGAACTGA-3′，下游引物5′-CCGTCCTTTGAATTTCTCCA-3′，擴增片段長度242 bp；CREB：上游引物5′-TCAGCCGGGTACTA CCATTC-3′，下游引物5′-CTCTCTCTTCCGTGCT GCTT-3′，擴增片段長度217 bp；β-actin：上游引物5′-CTGAGAGGGA AATCGTGCGT-3′，下游引物5′-CCACAGGATTCC ATACCCAAGA-3′，擴增片段長度240 bp。
采用SPSS13.0統計學軟件行統計學分析，實驗數據以均數±標準差(
2 結果
熒光顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜未見病毒綠色熒光，僅可見少量自身熒光(圖 1A)；基因治療組小鼠視網膜神經節細胞層(GCL)、內叢狀層(IPL)、內核層(INL)、外叢狀層(OPL)可見病毒綠色強熒光，外核層(ONL)可見少量弱熒光(圖 1B)。
圖1
小鼠視網膜熒光顯微鏡像。1A.正常組，各層視網膜自身弱熒光；1B.基因治療組，小鼠視網膜GCL、IPL、INL、OPL均見強熒光，ONL可見少量弱熒光標尺：50μm
光學顯微鏡觀察發現，正常組、正常-病毒對照組小鼠視網膜均未見突破內界膜的血管內皮細胞核(圖 2A，2B)；基因治療組小鼠視網膜僅見少許突破內界膜的血管內皮細胞核(圖 2C)；單純模型組、空白載體組小鼠視網膜均可見大量突破內界膜伸向玻璃體腔的血管內皮細胞核(圖 2D，2E)。5組間突破內界膜的血管內皮細胞核計數比較，差異有統計學意義(F=144.20，P＜0.05)。單純模型組突破內界膜的血管內皮細胞核計數較正常組明顯增加比較，差異有統計學意義(t=15.68，P＜0.05)；基因治療組突破內界膜的血管內皮細胞核計數較單純模型組、空白載體組明顯下降，差異均有統計學意義(t=13.61、14.64，P＜0.05)(圖 3)。
圖2
小鼠視網膜光學顯微鏡像。2A.正常組；2B.正常-病毒對照組；2C.基因治療組；2D.單純模型組；2E.空白載體組。正常組、正常-病毒對照組小鼠視網膜均未見突破內界膜的血管內皮細胞核；基因治療組小鼠視網膜僅見少許突出內界膜的血管內皮細胞核(黑箭)；單純模型組、空白載體組小鼠視網膜均可見大量突破內界膜伸向玻璃體腔的血管內皮細胞核(黑箭) HE標尺：100μm
圖3
各組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核計數比較。*P＜0.05
熒光顯微鏡觀察發現，正常組、正常-病毒對照組小鼠視網膜表層與深層血管分布均勻，未見血管閉塞以及新生血管(圖 4A，4B)；基因治療組小鼠視網膜血管走行基本均勻，可見少量無灌注區及新生血管(圖 4C)；單純模型組小鼠視網膜中周部大量新生血管形成，后極部大片無灌注區(圖 4D)；空白載體組小鼠視網膜中周部大片無灌注區及大量新生血管形成(圖 4E)。5組小鼠RNV面積、無灌注區面積比較，差異均有統計學意義(F=149.50、122.50，P＜0.05)。與單純模型組、空白載體組比較，基因治療組小鼠RNV面積(t=12.75、11.37)、無灌注區面積(t=12.09、10.89)明顯減少，差異均有統計學意義(P＜0.05)(圖 5)。
圖4
小鼠視網膜熒光顯微鏡像。4A.正常組；4B.正常-病毒對照組；4C.基因治療組；4D.單純模型組；4E.空白載體組。正常組、正常-病毒對照組小鼠視網膜表層與深層血管分布均勻，未見血管閉塞以及新生血管；基因治療組小鼠視網膜血管走行基本均勻，可見少量新生血管(白箭)及無灌注區(黃箭)；單純模型組小鼠視網膜中周部大量新生血管形成(白箭)，后極部大片無灌注區(黃箭)；空白載體組小鼠視網膜中周部大量新生血管形成(白箭)及大片無灌注區(黃箭)標尺：2500μm
圖5
各組小鼠視網膜無灌注區及RNV面積比較。*基因治療組與單純模型組間、空白載體組間比較，P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，5組小鼠視網膜S100A4、bcl-2、Caspase-3和CREB蛋白表達比較，差異均有統計學意義(F=32.41，P＜0.05)。與正常組比較，正常-病毒對照組、基因治療組小鼠視網膜S100A4蛋白表達明顯下調，差異有統計學意義(t=4.12、3.42，P＜0.05)。與單純模型組、空白載體組比較，基因治療組小鼠視網膜S100A4(t=5.85、6.13)、bcl-2(t=3.63、3.36)、CREB(t=2.96、3.40)蛋白表達明顯下調，差異均有統計學意義(P＜0.05)；Caspase-3蛋白表達明顯上調，差異有統計學意義(t=3.55、3.14，P＜0.05)(圖 6)。
圖6
各組小鼠視網膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB蛋白表達比較。*P＜0.05
實時PCR檢測結果顯示，5組小鼠視網膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB mRNA表達比較，差異均有統計學意義(F=184.60，P＜0.05)。與正常組比較，正常-病毒對照組、基因治療組小鼠視網膜S100A4 mRNA表達明顯下調，差異有統計學意義(t=6.03、4.09，P＜0.05)。與單純模型組、空白載體組比較，基因治療組小鼠視網膜S100A4(t=11.29、10.44)、bcl-2(t=4.09、2.81)、CREB(t=6.37、5.38)mRNA表達明顯下調，差異均有統計學意義(P＜0.05)；Caspase-3 mRNA表達明顯上調，差異有統計學意義(t=4.37、3.67，P＜0.05)(圖 7)。
圖7
各組小鼠視網膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB mRNA表達比較。*P＜0.05
3 討論
S100蛋白最初是從牛腦中分離出的一種可溶性酸性蛋白，隸屬于鈣離子結合蛋白家族，作為S100蛋白家族成員之一在體內具有多種生物學功能[5]。既往研究表明，S100A4可通過增加腫瘤細胞的運動性，減少腫瘤細胞間的黏附，抑制細胞凋亡來促進腫瘤的侵襲與轉移[6-8]。近年來研究發現，S100A4在腫瘤新生血管的形成過程中也扮演著重要的角色[2]。但有關S100A4在眼部新生血管形成過程中是否發揮作用及其機制尚不明確。因此，我們通過建立OIR模型，觀察探討了S100A4基因靜默對氧誘導RNV形成的抑制作用及其可能機制。
本研究結果顯示，單純模型組突破內界膜的血管內皮細胞核計數、新生血管面積均大于正常組。說明OIR模型建立成功。在預實驗中，我們通過設定重組腺病毒滴度梯度最終確定玻璃體腔注射病毒滴度為1.0×109 PFU/ml，轉染時間為3 d時其轉染效率最佳。通過對不同組別S100A4蛋白表達量的檢測發現，基因治療組和正常-病毒對照組S100A4蛋白表達量較其他組明顯下降。證實S100A4-RNAi重組腺病毒可有效抑制S100A4蛋白的表達。
我們還發現，基因治療組突破內界膜的血管內皮細胞核數目較單純模型組和空白載體組明顯減少。說明抑制S100A4蛋白的表達可減少RNV的形成。此外，我們通過對視網膜鋪片的血管染色觀察，發現基因治療組小鼠新生血管面積較單純模型組和空白載體組明顯減少。進一步證明抑制S100A4蛋白的表達對新生血管的抑制作用。視網膜無灌注區的形成是誘發后期RNV形成的重要因素，其面積的大小與病理性新生血管形成的嚴重程度密切相關。本研究結果也證實了抑制S100A4蛋白的表達可明顯減小視網膜無灌注區的面積。因此，我們認為，抑制S100A4蛋白的表達對RNV的形成具有顯著的抑制作用。
CREB是一種真核生物細胞核內蛋白質，作為轉錄因子在不同的組織和器官中都能起到調節新生血管發生發展的作用[9-11]。作為CREB的目標基因，bcl-2的-1640與-1529位點之間有一個環磷酸腺苷反應元件蛋白，在被CREB激活后可調控bcl-2的表達水平[12, 13]。而bcl-2具有抑制凋亡的作用，并且在新生血管的發生發展中具有促進作用。我們通過檢測各組小鼠視網膜中上述因子的蛋白和mRNA表達，以期探討S100A4基因靜默對RNV抑制作用的可能機制。結果顯示，單純模型組bcl-2、CREB的蛋白和mRNA表達量較正常組均有上調。這可能是因為缺氧導致CREB的激活增加從而促進了bcl-2的抗凋亡效應。相反的是，基因治療組bcl-2、CREB的蛋白和mRNA表達量較單純模型組和空白載體組明顯降低。這可能是由于S100A4基因靜默能減少CREB的表達，進而降低了bcl-2的抗凋亡作用。
Caspase-3可通過內源性和外源性凋亡通路被激活，引起bcl-2蛋白的激活[14]。且已有研究證實Caspase-3在抗腫瘤新生血管中的作用[15, 16]。為了進一步證實S100A4基因靜默可抑制RNV形成這一結論，我們對Caspase-3蛋白和mRNA表達進行了檢測。結果顯示，基因治療組小鼠視網膜Caspase-3的蛋白和mRNA表達量較單純模型組和空白載體組明顯上調。說明在OIR小鼠模型中，S100A4基因靜默可促進Caspase-3的促凋亡作用。
本研究結果表明，在OIR小鼠模型中，S100A4基因靜默可減少視網膜病理性新生血管，減小視網膜無灌注區面積。這一作用可能是由S100A4基因靜默可降低CREB的表達量從而減弱bcl-2的抗凋亡效應，而同時促進Caspase-3的促凋亡效應引起的。提示S100A4可能成為治療RNV疾病的新靶點。
