引用本文： 丁睿, 李霄, 竇科峰. 人分化抑制蛋白1慢病毒干擾載體的構建、篩選及其沉默效應的鑒定. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(12): 1511-1517. doi: 10.7507/1007-9424.20140358 復制
肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上發病率位于第5位的常見腫瘤，其也是世界第3位、我國第2位的腫瘤致死原因[1]。乙肝病毒（HBV）在肝癌形成中的關鍵作用毋庸置疑，但其參與肝細胞轉化的機理仍不清楚[2-4]。分化抑制蛋白（inhibitor of differentiation，Id）又稱DNA結合抑制蛋白。由于Id蛋白缺少DNA結合結構域，它與其他堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子（bHLH）結合后可形成沒有DNA結合能力的異二聚體，從而起到負性調節作用[5]。作為Id蛋白家族的一員，Id1蛋白在細胞分化過程中起到了重要的作用，它在包括HCC在內的多種人類腫瘤組織中呈高表達[6]。不受控制的Id1蛋白表達將促進腫瘤細胞增殖、抑制分化、刺激腫瘤血管生成及誘發基因組失穩。Id1蛋白的高表達往往和腫瘤的高侵襲性、較低的分化程度和較差的臨床預后相關[7-11]。高表達的Id1蛋白可以介導HCC細胞的增殖，并且是預測慢性肝炎肝硬變患者HCC發生風險的指標[12-13]。由此，Id1蛋白參與HCC形成的具體機理是什么？該過程中與Id1蛋白發生作用的分子主要有哪些？沉默Id1基因的表達能否抑制HCC的發生？這些均值得進一步深入研究。因此，筆者構建和篩選了Id1慢病毒干擾載體，并在HCC細胞系中加以驗證。
1 材料與方法
1.1 主要材料和設備
慢病毒干擾載體（pGCSIL-GFP質粒）、真核表達載體（pGC-FU質粒）、pHelper1.0載體、pHelper 2.0載體以及pcDNA3.1空質粒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。pGCSIL-GFP質粒包含AgeⅠ以及EcoRⅠ2個酶切位點，pGC-FU質粒包含AgeⅠ1個酶切位點。限制性內切酶AgeⅠ和EcoRⅠ均購自大連寶生物工程公司，T4 DNA Ligase試劑盒和實時定量PCR（real time-PCR）試劑盒均購自日本Takara生物公司，QIAGEN Plasmid Plus質粒抽提試劑盒和轉染試劑盒均購自德國QIAGEN公司，Trizol以及Lipofectamine2000均購自上海Invitrogen公司，Id1兔抗鼠/人單克隆抗體購自美國Calbioreagents公司，DMEM培養液和Opti-MEM? I減血清培養基均購自美國Gibco Industries公司。本實驗所用的細胞包括人HCC HepG2細胞以及239T細胞，均由筆者所在醫院實驗室提供；大腸桿菌感受態細胞DH5α購自上海吉凱基因化學技術有限公司。設備：Centricon Plus-20離心超濾管購自美國EMD Millipore公司，TP800 real time-PCR儀購自日本Takara公司，IX73型熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，3311型CO2培養箱購自美國Forma Scicentific公司，電泳槽、電泳儀、轉移槽和Molecular Imager顯影機均購自美國Bio-Rad公司；Oligo 7軟件為美國Molecular Biology Insights公司產品，Photoshop CS6軟件為美國Adobe公司產品，Beacon Designer2軟件為美國PREMIER Biosoft公司產品。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
人HepG2細胞置于含10%胎牛血清、0.1 mmol/L非必需氨基酸、5 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/mL氨芐青霉素和500μg/mL G418的DMEM培養液中，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中常規培養。239T細胞置于含10%胎牛血清、100μg/mL氨芐青霉素和500μg/mL G418的DMEM培養液中，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中常規培養。
1.2.2 Id1-小干擾RNA（siRNA）重組慢病毒干擾載體的構建與鑒定
根據Id1基因（GenBank?/EMBL提取號碼：NM_002165）的信息，按照siRNA干擾序列設計原則[14]，運用Oligo 7軟件設計4對可用的siRNA干擾序列（表 1）。根據Id1-siRNA干擾序列分別設計病毒載體構建框架，其兩端均含酶切位點粘性末端（AgeⅠ：ACCGGT；EcoRⅠ：GAATTC）。經BLAST分析確認4對干擾片段的特異性。同時設計錯配序列作為陰性對照：正義鏈為5′-CCGGT-TCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGT-GACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′，反義鏈為5′-AA-TTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAAGTT-CTCTACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。由上海銳賽生物技術有限公司分別合成上述單鏈。將合成的4對寡核苷酸鏈等量混勻，于95℃條件下作用5 min以退火，冷卻至室溫，以形成帶粘性末端的雙鏈DNA（ds DNA Oligo），見表 2。以AgeⅠ和EcoRⅠ酶切pGCSIL-GFP質粒使其線性化，利用T4 DNA連接酶將合成的雙鏈DNA與載體連接（連接步驟參照T4 DNA Ligase試劑盒說明書進行）。構建的4種特異性沉默Id1基因的重組慢病毒干擾載體分別為：pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3以及pCGSIL-GFP-Id1-4。采用CaCl2法制備感受態細胞DH5α，4組各取5μL過夜連接物轉化感受態細胞DH5α后（制備和轉化操作參照DH5α感受態細菌說明書進行），分別涂于含卡那霉素抗性（30 mg/L）的LB平板上，于37℃恒溫箱中培養過夜。于每個培養皿上選擇3個單克隆菌落接種于3 mL含卡那霉素抗性（30 mg/L）的LB培養液中，37℃恒溫搖床（250 r/min）培養過夜。經菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆，參照QIAGEN Plasmid Plus質粒抽提試劑盒說明書提取質粒，并送上海Invitrogen公司測序。同時構建Id1基因高表達載體（pGC-FU-Id1）以及含錯配序列的pGCSIL-GFP載體并測序，方法同上。
表1
4組含Id1干擾靶點的siRNA序列
Table1.
Four kinds of siRNA sequences with Id1 interference targets
表2
4組含Id1干擾靶點的寡聚單鏈DNA序列
Table2.
Oligo sequences contained Id1 interference targets of 4 groups
1.2.3 Id1-RNA干擾（RNAi）有效靶點的篩選
轉染前24 h將對數生長期的293T細胞按每孔1×104個/mL接種于24孔板中，每種干擾載體設3個復孔。當細胞生長至80.0%～90.0%融合時，更換為400μL的Opti-MEM? I減血清培養基。將含Id1基因的pGC-FU-Id1重組質粒和針對不同干擾靶點的Id1-siRNA重組慢病毒干擾載體共同轉染293T細胞：每孔pGC-FU-Id1重組質粒的量均為0.5μg，Id1-siRNA重組載體的量均為0.5μg，Lipofectamine2000的體積均為2μL。將2種質粒（1μg）和Lipofectamine2000（2μL）分別溶解于Opti-MEM?I減血清培養基（48μL）中混勻，室溫靜置5 min后，再將稀釋好的質粒和Lipofectamine2000合并混勻，室溫靜置20 min。將混合液（100μL）加入293T細胞（轉染其他操作按試劑盒說明書進行），置于5% CO2培養箱中，37℃條件下培養6～8 h后，再換成新鮮的含10%胎牛血清的完全培養液。另以不轉染任何質粒的293T細胞作為空白對照組（CON組），以共轉染過表達質粒和pcDNA3.1空質粒的293T細胞作為空載體對照組（MOCK組），以共轉染過表達質粒和含錯配序列的pGCSIL-GFP載體的293T細胞作為陰性對照組（NC組）。將以上處理24 h后的293T細胞置于熒光顯微鏡下觀察（200倍），隨機選擇3個視野，計數綠色熒光陽性細胞數，并計算其所占比例（即轉染率）。轉染率＞90.0%為合格。收集處理36～48 h后的293T細胞，抽提總蛋白，調整樣品蛋白終濃度為2 g/L，行Western blot法檢測Id1蛋白的表達水平。每個樣品取相同的蛋白量，加入上樣緩沖液，于100℃條件下煮沸變性10 min；行12％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉膜于硝酸纖維素膜（NC膜）上；以10％脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Id1兔抗鼠/人單克隆抗體（1：100，12μL/孔），4℃孵育過夜；再以TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（1：5 000，12μL/孔），室溫孵育1 h；再以TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min；最后用化學發光試劑（ECL）法顯影。采用Photoshop CS6軟件分析Id1蛋白和β-actin條帶的灰度值，通過計算Id1蛋白條帶和β-actin條帶灰度值的比值作為Id1蛋白的相對表達水平，并計算Id1蛋白表達的相對抑制效率（1-實驗組平均蛋白表達水平/NC組平均蛋白表達水平×100%），以篩選目的Id1-siRNA重組慢病毒干擾載體。
1.2.4 慢病毒顆粒的包裝
以篩選出的干擾效果最佳的Id1-siRNA重組質粒（pCGSIL-GFP-Id1-4）組建慢病毒即Id1-RNAi-LV。抽提質粒方法同上。將293T細胞按6×105個/mL接種于15 cm培養皿中，培養過夜后換無血清培養基，將脂質體-質粒復合物（含pGCSIL-GFP-Id1-4重組質粒20μg，pHelper1.0載體15μg，pHelper2.0載體10μg）與相應體積的Opti-MEM?I減血清培養基混合均勻，將總體積調整為2.5 mL，加入到細胞培養皿中。另將100μLLipofectamine2000試劑與2.4 mL Opti-MEM? I培養基輕柔混合后，也小心地加入到細胞培養皿中，以進行轉染（轉染其他操作按試劑盒說明書進行）。轉染8 h后，更換為完全培養液。48 h后收集病毒原液進行離心濃縮（4 000×g，10 min），-80℃存儲以備進行滴度鑒定。對含錯配序列的pGCSIL-GFP載體也進行慢病毒包裝，方法同上。
1.2.5 滴度鑒定
采用逐孔稀釋法滴定病毒滴度。測定前24 h，將293T細胞鋪于96孔板中（4×104個/孔）。取8個無菌離心管，每管加入90μL無血清培養基。取待測定的病毒原液10μL加入到第1個離心管中混勻，再從中取10μL加入到第2個管中，以此進行梯度稀釋，繼續相同的操作直到最后1管（第1管含10μL病毒原液，第8管含1×10-6μL病毒原液）。選取所需的細胞孔，吸去90μL培養基丟棄后，加入90μL分別稀釋好的病毒溶液，放入37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。再輕柔加入完全培養基100μL，操作時避免吹起細胞。4 d后于熒光顯微鏡下（100倍）觀察熒光細胞的數量。熒光細胞數隨稀釋倍數的增加而減少，計數最后2個有熒光的管中熒光細胞的克隆數。假設克隆數分別為X和Y，則病毒滴度（TU/mL）=（X＋Y×10）×1 000/2/X孔中病毒原液的含量（μL）。含錯配序列的慢病毒的病毒滴度和Id1-RNAI-LV相同。
1.2.6 慢病毒感染HepG2細胞
用0.25%胰酶消化處于對數生長期的HepG2細胞，制成細胞懸液（1×105個/mL）。將含約5×104個細胞的懸液接種于6孔板中，加入2 mL DMEM培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養，直至培養細胞密度達到約80.0%時進行病毒感染。以包裝好的Id1-RNAi-LV感染HepG2細胞（Id1-RNAi-LV組）。根據滴定值于DMEM培養基中加入適量的病毒，使MOI=10（MOI為病毒數與細胞數量的比值）。若細胞生長良好，繼續培養24 h后更換培養基；如果觀察到明顯的細胞毒性效應（如細胞體積縮小、連接消失等），則立即更換培養基。感染3 d后于熒光顯微鏡（100倍）下觀察細胞綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，如表達GFP的細胞比例大于50%，則繼續培養2 d后，收集細胞分別行real time-PCR（操作和反應體系同試劑盒說明書，Id1 mRNA的表達水平采用2-ΔΔCt法計算）和Western blot檢測（方法同上）；若感染率低于50%，需重新進行感染實驗。實驗中采用未感染任何病毒的HepG2細胞為空白對照組（VCON組），采用感染含錯配序列慢病毒的HepG2細胞為陰性對照組（VNC組），感染操作同上（每組設3個復孔）。計算Id1-RNAi-LV組的相對抑制率，相對抑制效率=1-Id1-RNAi-LV組Id1蛋白或mRNA的表達水平/VNC組對應蛋白或mRNA的表達水平×100%。
1.3 統計學方法
采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（
2 結果
2.1 Id1-siRNA重組慢病毒干擾載體的鑒定結果
經上海Invitrogen公司測序證實，本實驗所得的特異性沉默Id1基因的4種siRNA重組慢病毒干擾載體（pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）的測序結果均與設計合成的靶向鏈一致，表明均構建成功。經測序，真核表達載體（pGC-FU-Id1）和含錯配序列的pCGSIL-GFP載體也構建成功。
2.2 沉默效率最高的Id1-siRNA重組慢病毒干擾載體的篩選結果
經熒光顯微鏡觀察發現，pCGSIL-GFP-Id1-1組、pCGSIL-GFP-Id1-2組、pCGSIL-GFP-Id1-3組、pCGSIL-GFP-Id1-4組、MOCK組及NC組的轉染率均在90.0%以上（CON組無轉染率結果），符合要求。7組293T細胞中Id1蛋白的表達水平結果見圖 1。由圖 1可見，與其余5組比較（除CON組外），pCGSIL-GFP-Id1-4組Id1蛋白的表達水平最低（P < 0.05），提示pCGSIL-GFP-Id1-4具有最高的沉默效率，其相對抑制效率為76.8%。
圖1
7組293T細胞中Id1蛋白的SDS-PAGE電泳結果和表達水平結果。1A：SDS-PAGE電泳結果；1B：Id1蛋白的表達水平結果，與其他5組比較（除CON組外），* P < 0.05；1：CON組；2：MOCK組；3：NC組；4：pCGSIL-GFP-Id1-1組；5：pCGSIL-GFP-Id1-2組；6：pCGSIL-GFP-Id1-3組；7：pCGSIL-GFP-Id1-4組??圖 2不同稀釋倍數的Id1-RNAi-LV感染293T細胞后的熒光細胞觀察結果（倒置熒光顯微鏡×100）。3A：病毒原液；3B：10倍；3C：1×102倍；3D：1×103倍；3E：1×104倍；3F：1×105倍；3G：1×106倍；3H：1×107倍??圖 33組HepG2細胞中Id1 mRNA及其蛋白的SDS-PAGE電泳結果和表達水平結果。3A：Id1蛋白的SDS-PAGE電泳結果；3B：Id1 mRNA及其蛋白的表達水平結果，與其余2組比較，* P < 0.05；1：VCON組；2：VNC組；3：Id1-RNAi-LV組
Figure1.
SDS-PAGE electrophoresis results and expression level results of Id1 protein in 293T cells of 7 groups．1A: Results of SDS-PAGE electro-phoresis; 1B: The expression levels of Id1 protein in 7 groups, compared with other 5 groups (except for CON group), *P < 0.05; 1: CON group; 2: MOCK group; 3: NC group; 4: pCGSIL-GFP-Id1-1 group; 5: pCGSIL-GFP-Id1-2 group; 6: pCGSIL-GFP-Id1-3 group; 7: pCGSIL-GFP-Id1-4 group??Figure 2 Fluorescent cells observation results of 293T cells in different diluted times after infection of Id1-RNAi-LV (Inverted fluorescence microscope ×100). 2A: No diluted; 2B: Diluted 10 times; 2C: Diluted 1×102 times; 2D: Diluted 1×103 times; 2E: Diluted 1×104 times; 2F: Diluted 1×105 times; 2G: Diluted 1×106 times; 2H: Diluted 1×107 times??Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis results and expression level results of Id1 mRNA and its protein in HepG2 cells of 3 groups. 3A: Results of SDS-PAGE electrophoresis of Id1 protein; 3B: The expression levels of Id1 mRNA and its protein in 3 groups, compared with other 2 groups, * P < 0.05; 1: VCON group; 2: VNC group; 3: Id1-RNAi-LV group
2.3 慢病毒顆粒的滴度測定結果
本實驗所構建的Id1-siRNA-LV的病毒滴度為2.0×109 TU/mL，說明Id1-siRNA-LV包裝成功。熒光顯微鏡下見熒光顯影細胞的數量隨稀釋倍數的增加而減少，在稀釋1×107倍的情況下，視野中仍可見熒光顯影細胞（圖 2）。
2.4 Id1-RNAi-LV感染HepG2細胞的效果
real time-PCR結果表明，Id1-RNAi-LV組Id1 mRNA的表達水平較VCON組和VNC組低（P < 0.05），相對抑制效率為55.0%；而VCON組與VNC組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。Western blot結果表明，Id1-RNAi-LV組Id1蛋白的表達水平較VCON組和VNC組低（P < 0.05），相對抑制效率為38.8%；而VCON組與VNC組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 3。該結果提示，Id1-RNAi-LV對HepG2細胞Id1 mRNA及其蛋白的表達均具有抑制作用。
3 討論
Id1參與了人類腫瘤的發生、發展以及侵襲過程。最初的研究[15-17]發現，正常人類原代細胞轉染Id1基因后發生p53和視網膜母細胞瘤抑制蛋白（Rb）通路的失活，Id1基因可修復由p53基因介導的DNA損傷，并且通過引起Rb蛋白的過磷酸化而啟動細胞周期進程，促進細胞增殖。因此認為，Id1基因可能起到癌基因的作用。目前已經在超過15種人類腫瘤中發現了Id1基因轉錄和轉譯水平的表達上調[6]。如在前列腺癌中，Id1蛋白的表達隨著Gleason等級的升高（提示腫瘤惡性程度）和分化程度的變差而上調[8]。在卵巢癌中，低分化癌細胞和較差預后患者的癌組織標本中均檢測出了高水平表達的Id1蛋白[7]。高表達的Id1蛋白被認為是早期宮頸癌預后較差的標志[10]。這些結果表明，Id1蛋白不僅是介導腫瘤發生的因子，也可能是腫瘤發展過程中的關鍵因子。在腫瘤侵襲過程中，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）起到了重要的作用，其可調節基底膜的降解和重塑細胞外基質。研究[18]也發現，持續表達的Id1蛋白可增加乳腺細胞衰老過程中MMP蛋白的表達水平，促進乳腺細胞的能動性和侵襲性，將Id1基因轉入非侵襲性乳腺癌細胞后可促進細胞的增殖和侵襲。此外，在腫瘤發展過程中，Id1蛋白還參與促進腫瘤血管生成，提高腫瘤對化療藥物的耐受性。如前列腺癌細胞系轉染Id1基因后可促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）啟動子的表達，而敲除Id1基因后，不僅可下調VEGF基因的轉錄活性，也能抑制VEGF的分泌[19]。在前列腺癌和鼻咽癌細胞中，異位表達的Id1蛋白引起了腫瘤對紫杉醇的耐藥[20-21]。除了紫杉醇，Id1蛋白表達上調還與前列腺癌細胞對阿霉素和環磷酰胺的耐藥有關[22]。但目前對Id1基因和HCC關系的研究仍較少。目前已發現，過度表達的Id1蛋白可以通過抑制與細胞衰老有關的p16INK4a/Rb信號轉導通路而介導HCC的增殖[23]。經轉化生長因子-β1（TGF-β1）介導的Id1抑制通路可能在HCC細胞的生長抑制和部分分化中均起到重要作用[13]。此外，研究[12]還發現，Id1蛋白的高表達可能是預測慢性肝炎肝硬變患者HCC發生風險的指標。因此，在揭示HCC發生和發展的研究過程中，我們不能忽視Id1基因在其中所起的重要作用。
RNAi技術通過細胞內的RNA酶Dicer，將雙鏈的RNA分子降解為21～23堿基對大小的siRNA，后者再結合核酶復合物形成RNA誘導沉默復合物，之后再定位并切割對應的mRNA，從而達到抑制同源基因表達的效果[24]。但由于siRNA的易降解性，需要特定的載體以維持其長期穩定的RNAi效果。2003年，Stewart等[25]首次報道了慢病毒介導的RNAi在Hela細胞和原代樹突細胞中的應用。慢病毒屬逆轉錄病毒，慢病毒載體是在其基礎上通過重組改造而成的，其表達效率和安全性均更高[26]。慢病毒載體的主要結構包括3個部分，分別為包裝質粒、包膜質粒和轉移質粒。將3種質粒經重組改造后感染293T細胞，即可產生存在復制缺陷的HIV病毒[27]。這種病毒在宿主體內不但可以長期穩定表達，而且免疫反應輕微，并且可同時兼容多個轉錄啟動子。將慢病毒載體高效感染和整合的特性，結合RNAi對同源基因特異性抑制的特性，即構成了慢病毒載體介導的RNAi。它對原代培養的人巨噬細胞、造血干細胞等各類哺乳動物細胞均具有有效的RNAi效果。由于慢病毒載體能夠將外源基因安全和高效地轉入動物或人體內，并能夠使目的基因高效、穩定且持續表達，故在臨床中特別是在腫瘤治療中具有很好的應用前景。
本實驗設計、篩選并成功構建了人Id1慢病毒干擾載體，并成功實現慢病毒的包裝，病毒滴度為2.0×109 TU/mL。將包裝好的慢病毒（Id1-RNAi-LV）感染HepG2細胞后，與VCON組和VNC組比較，其Id1 mRNA和蛋白的表達水平均較低，表明慢病毒干擾載體構建成功。本實驗構建的慢病毒干擾載體可用于研究Id1基因沉默對HCC發生和發展過程的影響，有助于進一步了解在HCC形成過程中與Id1基因相關的分子通路，以及尋找有效的HCC基因治療靶點；同時其有助于研究Id1基因與HCC腫瘤耐藥間的關系。如果抑制Id1基因的表達可以降低腫瘤對化療藥物的耐受作用，那么將Id1慢病毒干擾載體結合至化療藥物上共同使用則可能增強藥物介導的凋亡并逆轉腫瘤的抗藥性。此外，本實驗成功構建的Id1慢病毒干擾載體對有Id1參與的其他人類腫瘤的研究也具有重要價值。
肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上發病率位于第5位的常見腫瘤，其也是世界第3位、我國第2位的腫瘤致死原因[1]。乙肝病毒（HBV）在肝癌形成中的關鍵作用毋庸置疑，但其參與肝細胞轉化的機理仍不清楚[2-4]。分化抑制蛋白（inhibitor of differentiation，Id）又稱DNA結合抑制蛋白。由于Id蛋白缺少DNA結合結構域，它與其他堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子（bHLH）結合后可形成沒有DNA結合能力的異二聚體，從而起到負性調節作用[5]。作為Id蛋白家族的一員，Id1蛋白在細胞分化過程中起到了重要的作用，它在包括HCC在內的多種人類腫瘤組織中呈高表達[6]。不受控制的Id1蛋白表達將促進腫瘤細胞增殖、抑制分化、刺激腫瘤血管生成及誘發基因組失穩。Id1蛋白的高表達往往和腫瘤的高侵襲性、較低的分化程度和較差的臨床預后相關[7-11]。高表達的Id1蛋白可以介導HCC細胞的增殖，并且是預測慢性肝炎肝硬變患者HCC發生風險的指標[12-13]。由此，Id1蛋白參與HCC形成的具體機理是什么？該過程中與Id1蛋白發生作用的分子主要有哪些？沉默Id1基因的表達能否抑制HCC的發生？這些均值得進一步深入研究。因此，筆者構建和篩選了Id1慢病毒干擾載體，并在HCC細胞系中加以驗證。
1 材料與方法
1.1 主要材料和設備
慢病毒干擾載體（pGCSIL-GFP質粒）、真核表達載體（pGC-FU質粒）、pHelper1.0載體、pHelper 2.0載體以及pcDNA3.1空質粒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。pGCSIL-GFP質粒包含AgeⅠ以及EcoRⅠ2個酶切位點，pGC-FU質粒包含AgeⅠ1個酶切位點。限制性內切酶AgeⅠ和EcoRⅠ均購自大連寶生物工程公司，T4 DNA Ligase試劑盒和實時定量PCR（real time-PCR）試劑盒均購自日本Takara生物公司，QIAGEN Plasmid Plus質粒抽提試劑盒和轉染試劑盒均購自德國QIAGEN公司，Trizol以及Lipofectamine2000均購自上海Invitrogen公司，Id1兔抗鼠/人單克隆抗體購自美國Calbioreagents公司，DMEM培養液和Opti-MEM? I減血清培養基均購自美國Gibco Industries公司。本實驗所用的細胞包括人HCC HepG2細胞以及239T細胞，均由筆者所在醫院實驗室提供；大腸桿菌感受態細胞DH5α購自上海吉凱基因化學技術有限公司。設備：Centricon Plus-20離心超濾管購自美國EMD Millipore公司，TP800 real time-PCR儀購自日本Takara公司，IX73型熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，3311型CO2培養箱購自美國Forma Scicentific公司，電泳槽、電泳儀、轉移槽和Molecular Imager顯影機均購自美國Bio-Rad公司；Oligo 7軟件為美國Molecular Biology Insights公司產品，Photoshop CS6軟件為美國Adobe公司產品，Beacon Designer2軟件為美國PREMIER Biosoft公司產品。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
人HepG2細胞置于含10%胎牛血清、0.1 mmol/L非必需氨基酸、5 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/mL氨芐青霉素和500μg/mL G418的DMEM培養液中，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中常規培養。239T細胞置于含10%胎牛血清、100μg/mL氨芐青霉素和500μg/mL G418的DMEM培養液中，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中常規培養。
1.2.2 Id1-小干擾RNA（siRNA）重組慢病毒干擾載體的構建與鑒定
根據Id1基因（GenBank?/EMBL提取號碼：NM_002165）的信息，按照siRNA干擾序列設計原則[14]，運用Oligo 7軟件設計4對可用的siRNA干擾序列（表 1）。根據Id1-siRNA干擾序列分別設計病毒載體構建框架，其兩端均含酶切位點粘性末端（AgeⅠ：ACCGGT；EcoRⅠ：GAATTC）。經BLAST分析確認4對干擾片段的特異性。同時設計錯配序列作為陰性對照：正義鏈為5′-CCGGT-TCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGT-GACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′，反義鏈為5′-AA-TTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAAGTT-CTCTACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。由上海銳賽生物技術有限公司分別合成上述單鏈。將合成的4對寡核苷酸鏈等量混勻，于95℃條件下作用5 min以退火，冷卻至室溫，以形成帶粘性末端的雙鏈DNA（ds DNA Oligo），見表 2。以AgeⅠ和EcoRⅠ酶切pGCSIL-GFP質粒使其線性化，利用T4 DNA連接酶將合成的雙鏈DNA與載體連接（連接步驟參照T4 DNA Ligase試劑盒說明書進行）。構建的4種特異性沉默Id1基因的重組慢病毒干擾載體分別為：pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3以及pCGSIL-GFP-Id1-4。采用CaCl2法制備感受態細胞DH5α，4組各取5μL過夜連接物轉化感受態細胞DH5α后（制備和轉化操作參照DH5α感受態細菌說明書進行），分別涂于含卡那霉素抗性（30 mg/L）的LB平板上，于37℃恒溫箱中培養過夜。于每個培養皿上選擇3個單克隆菌落接種于3 mL含卡那霉素抗性（30 mg/L）的LB培養液中，37℃恒溫搖床（250 r/min）培養過夜。經菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆，參照QIAGEN Plasmid Plus質粒抽提試劑盒說明書提取質粒，并送上海Invitrogen公司測序。同時構建Id1基因高表達載體（pGC-FU-Id1）以及含錯配序列的pGCSIL-GFP載體并測序，方法同上。
表1
4組含Id1干擾靶點的siRNA序列
Table1.
Four kinds of siRNA sequences with Id1 interference targets
表2
4組含Id1干擾靶點的寡聚單鏈DNA序列
Table2.
Oligo sequences contained Id1 interference targets of 4 groups
1.2.3 Id1-RNA干擾（RNAi）有效靶點的篩選
轉染前24 h將對數生長期的293T細胞按每孔1×104個/mL接種于24孔板中，每種干擾載體設3個復孔。當細胞生長至80.0%～90.0%融合時，更換為400μL的Opti-MEM? I減血清培養基。將含Id1基因的pGC-FU-Id1重組質粒和針對不同干擾靶點的Id1-siRNA重組慢病毒干擾載體共同轉染293T細胞：每孔pGC-FU-Id1重組質粒的量均為0.5μg，Id1-siRNA重組載體的量均為0.5μg，Lipofectamine2000的體積均為2μL。將2種質粒（1μg）和Lipofectamine2000（2μL）分別溶解于Opti-MEM?I減血清培養基（48μL）中混勻，室溫靜置5 min后，再將稀釋好的質粒和Lipofectamine2000合并混勻，室溫靜置20 min。將混合液（100μL）加入293T細胞（轉染其他操作按試劑盒說明書進行），置于5% CO2培養箱中，37℃條件下培養6～8 h后，再換成新鮮的含10%胎牛血清的完全培養液。另以不轉染任何質粒的293T細胞作為空白對照組（CON組），以共轉染過表達質粒和pcDNA3.1空質粒的293T細胞作為空載體對照組（MOCK組），以共轉染過表達質粒和含錯配序列的pGCSIL-GFP載體的293T細胞作為陰性對照組（NC組）。將以上處理24 h后的293T細胞置于熒光顯微鏡下觀察（200倍），隨機選擇3個視野，計數綠色熒光陽性細胞數，并計算其所占比例（即轉染率）。轉染率＞90.0%為合格。收集處理36～48 h后的293T細胞，抽提總蛋白，調整樣品蛋白終濃度為2 g/L，行Western blot法檢測Id1蛋白的表達水平。每個樣品取相同的蛋白量，加入上樣緩沖液，于100℃條件下煮沸變性10 min；行12％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉膜于硝酸纖維素膜（NC膜）上；以10％脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Id1兔抗鼠/人單克隆抗體（1：100，12μL/孔），4℃孵育過夜；再以TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（1：5 000，12μL/孔），室溫孵育1 h；再以TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min；最后用化學發光試劑（ECL）法顯影。采用Photoshop CS6軟件分析Id1蛋白和β-actin條帶的灰度值，通過計算Id1蛋白條帶和β-actin條帶灰度值的比值作為Id1蛋白的相對表達水平，并計算Id1蛋白表達的相對抑制效率（1-實驗組平均蛋白表達水平/NC組平均蛋白表達水平×100%），以篩選目的Id1-siRNA重組慢病毒干擾載體。
1.2.4 慢病毒顆粒的包裝
以篩選出的干擾效果最佳的Id1-siRNA重組質粒（pCGSIL-GFP-Id1-4）組建慢病毒即Id1-RNAi-LV。抽提質粒方法同上。將293T細胞按6×105個/mL接種于15 cm培養皿中，培養過夜后換無血清培養基，將脂質體-質粒復合物（含pGCSIL-GFP-Id1-4重組質粒20μg，pHelper1.0載體15μg，pHelper2.0載體10μg）與相應體積的Opti-MEM?I減血清培養基混合均勻，將總體積調整為2.5 mL，加入到細胞培養皿中。另將100μLLipofectamine2000試劑與2.4 mL Opti-MEM? I培養基輕柔混合后，也小心地加入到細胞培養皿中，以進行轉染（轉染其他操作按試劑盒說明書進行）。轉染8 h后，更換為完全培養液。48 h后收集病毒原液進行離心濃縮（4 000×g，10 min），-80℃存儲以備進行滴度鑒定。對含錯配序列的pGCSIL-GFP載體也進行慢病毒包裝，方法同上。
1.2.5 滴度鑒定
采用逐孔稀釋法滴定病毒滴度。測定前24 h，將293T細胞鋪于96孔板中（4×104個/孔）。取8個無菌離心管，每管加入90μL無血清培養基。取待測定的病毒原液10μL加入到第1個離心管中混勻，再從中取10μL加入到第2個管中，以此進行梯度稀釋，繼續相同的操作直到最后1管（第1管含10μL病毒原液，第8管含1×10-6μL病毒原液）。選取所需的細胞孔，吸去90μL培養基丟棄后，加入90μL分別稀釋好的病毒溶液，放入37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。再輕柔加入完全培養基100μL，操作時避免吹起細胞。4 d后于熒光顯微鏡下（100倍）觀察熒光細胞的數量。熒光細胞數隨稀釋倍數的增加而減少，計數最后2個有熒光的管中熒光細胞的克隆數。假設克隆數分別為X和Y，則病毒滴度（TU/mL）=（X＋Y×10）×1 000/2/X孔中病毒原液的含量（μL）。含錯配序列的慢病毒的病毒滴度和Id1-RNAI-LV相同。
1.2.6 慢病毒感染HepG2細胞
用0.25%胰酶消化處于對數生長期的HepG2細胞，制成細胞懸液（1×105個/mL）。將含約5×104個細胞的懸液接種于6孔板中，加入2 mL DMEM培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養，直至培養細胞密度達到約80.0%時進行病毒感染。以包裝好的Id1-RNAi-LV感染HepG2細胞（Id1-RNAi-LV組）。根據滴定值于DMEM培養基中加入適量的病毒，使MOI=10（MOI為病毒數與細胞數量的比值）。若細胞生長良好，繼續培養24 h后更換培養基；如果觀察到明顯的細胞毒性效應（如細胞體積縮小、連接消失等），則立即更換培養基。感染3 d后于熒光顯微鏡（100倍）下觀察細胞綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，如表達GFP的細胞比例大于50%，則繼續培養2 d后，收集細胞分別行real time-PCR（操作和反應體系同試劑盒說明書，Id1 mRNA的表達水平采用2-ΔΔCt法計算）和Western blot檢測（方法同上）；若感染率低于50%，需重新進行感染實驗。實驗中采用未感染任何病毒的HepG2細胞為空白對照組（VCON組），采用感染含錯配序列慢病毒的HepG2細胞為陰性對照組（VNC組），感染操作同上（每組設3個復孔）。計算Id1-RNAi-LV組的相對抑制率，相對抑制效率=1-Id1-RNAi-LV組Id1蛋白或mRNA的表達水平/VNC組對應蛋白或mRNA的表達水平×100%。
1.3 統計學方法
采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（
2 結果
2.1 Id1-siRNA重組慢病毒干擾載體的鑒定結果
經上海Invitrogen公司測序證實，本實驗所得的特異性沉默Id1基因的4種siRNA重組慢病毒干擾載體（pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）的測序結果均與設計合成的靶向鏈一致，表明均構建成功。經測序，真核表達載體（pGC-FU-Id1）和含錯配序列的pCGSIL-GFP載體也構建成功。
2.2 沉默效率最高的Id1-siRNA重組慢病毒干擾載體的篩選結果
經熒光顯微鏡觀察發現，pCGSIL-GFP-Id1-1組、pCGSIL-GFP-Id1-2組、pCGSIL-GFP-Id1-3組、pCGSIL-GFP-Id1-4組、MOCK組及NC組的轉染率均在90.0%以上（CON組無轉染率結果），符合要求。7組293T細胞中Id1蛋白的表達水平結果見圖 1。由圖 1可見，與其余5組比較（除CON組外），pCGSIL-GFP-Id1-4組Id1蛋白的表達水平最低（P < 0.05），提示pCGSIL-GFP-Id1-4具有最高的沉默效率，其相對抑制效率為76.8%。
圖1
7組293T細胞中Id1蛋白的SDS-PAGE電泳結果和表達水平結果。1A：SDS-PAGE電泳結果；1B：Id1蛋白的表達水平結果，與其他5組比較（除CON組外），* P < 0.05；1：CON組；2：MOCK組；3：NC組；4：pCGSIL-GFP-Id1-1組；5：pCGSIL-GFP-Id1-2組；6：pCGSIL-GFP-Id1-3組；7：pCGSIL-GFP-Id1-4組??圖 2不同稀釋倍數的Id1-RNAi-LV感染293T細胞后的熒光細胞觀察結果（倒置熒光顯微鏡×100）。3A：病毒原液；3B：10倍；3C：1×102倍；3D：1×103倍；3E：1×104倍；3F：1×105倍；3G：1×106倍；3H：1×107倍??圖 33組HepG2細胞中Id1 mRNA及其蛋白的SDS-PAGE電泳結果和表達水平結果。3A：Id1蛋白的SDS-PAGE電泳結果；3B：Id1 mRNA及其蛋白的表達水平結果，與其余2組比較，* P < 0.05；1：VCON組；2：VNC組；3：Id1-RNAi-LV組
Figure1.
SDS-PAGE electrophoresis results and expression level results of Id1 protein in 293T cells of 7 groups．1A: Results of SDS-PAGE electro-phoresis; 1B: The expression levels of Id1 protein in 7 groups, compared with other 5 groups (except for CON group), *P < 0.05; 1: CON group; 2: MOCK group; 3: NC group; 4: pCGSIL-GFP-Id1-1 group; 5: pCGSIL-GFP-Id1-2 group; 6: pCGSIL-GFP-Id1-3 group; 7: pCGSIL-GFP-Id1-4 group??Figure 2 Fluorescent cells observation results of 293T cells in different diluted times after infection of Id1-RNAi-LV (Inverted fluorescence microscope ×100). 2A: No diluted; 2B: Diluted 10 times; 2C: Diluted 1×102 times; 2D: Diluted 1×103 times; 2E: Diluted 1×104 times; 2F: Diluted 1×105 times; 2G: Diluted 1×106 times; 2H: Diluted 1×107 times??Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis results and expression level results of Id1 mRNA and its protein in HepG2 cells of 3 groups. 3A: Results of SDS-PAGE electrophoresis of Id1 protein; 3B: The expression levels of Id1 mRNA and its protein in 3 groups, compared with other 2 groups, * P < 0.05; 1: VCON group; 2: VNC group; 3: Id1-RNAi-LV group
2.3 慢病毒顆粒的滴度測定結果
本實驗所構建的Id1-siRNA-LV的病毒滴度為2.0×109 TU/mL，說明Id1-siRNA-LV包裝成功。熒光顯微鏡下見熒光顯影細胞的數量隨稀釋倍數的增加而減少，在稀釋1×107倍的情況下，視野中仍可見熒光顯影細胞（圖 2）。
2.4 Id1-RNAi-LV感染HepG2細胞的效果
real time-PCR結果表明，Id1-RNAi-LV組Id1 mRNA的表達水平較VCON組和VNC組低（P < 0.05），相對抑制效率為55.0%；而VCON組與VNC組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。Western blot結果表明，Id1-RNAi-LV組Id1蛋白的表達水平較VCON組和VNC組低（P < 0.05），相對抑制效率為38.8%；而VCON組與VNC組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 3。該結果提示，Id1-RNAi-LV對HepG2細胞Id1 mRNA及其蛋白的表達均具有抑制作用。
3 討論
Id1參與了人類腫瘤的發生、發展以及侵襲過程。最初的研究[15-17]發現，正常人類原代細胞轉染Id1基因后發生p53和視網膜母細胞瘤抑制蛋白（Rb）通路的失活，Id1基因可修復由p53基因介導的DNA損傷，并且通過引起Rb蛋白的過磷酸化而啟動細胞周期進程，促進細胞增殖。因此認為，Id1基因可能起到癌基因的作用。目前已經在超過15種人類腫瘤中發現了Id1基因轉錄和轉譯水平的表達上調[6]。如在前列腺癌中，Id1蛋白的表達隨著Gleason等級的升高（提示腫瘤惡性程度）和分化程度的變差而上調[8]。在卵巢癌中，低分化癌細胞和較差預后患者的癌組織標本中均檢測出了高水平表達的Id1蛋白[7]。高表達的Id1蛋白被認為是早期宮頸癌預后較差的標志[10]。這些結果表明，Id1蛋白不僅是介導腫瘤發生的因子，也可能是腫瘤發展過程中的關鍵因子。在腫瘤侵襲過程中，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）起到了重要的作用，其可調節基底膜的降解和重塑細胞外基質。研究[18]也發現，持續表達的Id1蛋白可增加乳腺細胞衰老過程中MMP蛋白的表達水平，促進乳腺細胞的能動性和侵襲性，將Id1基因轉入非侵襲性乳腺癌細胞后可促進細胞的增殖和侵襲。此外，在腫瘤發展過程中，Id1蛋白還參與促進腫瘤血管生成，提高腫瘤對化療藥物的耐受性。如前列腺癌細胞系轉染Id1基因后可促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）啟動子的表達，而敲除Id1基因后，不僅可下調VEGF基因的轉錄活性，也能抑制VEGF的分泌[19]。在前列腺癌和鼻咽癌細胞中，異位表達的Id1蛋白引起了腫瘤對紫杉醇的耐藥[20-21]。除了紫杉醇，Id1蛋白表達上調還與前列腺癌細胞對阿霉素和環磷酰胺的耐藥有關[22]。但目前對Id1基因和HCC關系的研究仍較少。目前已發現，過度表達的Id1蛋白可以通過抑制與細胞衰老有關的p16INK4a/Rb信號轉導通路而介導HCC的增殖[23]。經轉化生長因子-β1（TGF-β1）介導的Id1抑制通路可能在HCC細胞的生長抑制和部分分化中均起到重要作用[13]。此外，研究[12]還發現，Id1蛋白的高表達可能是預測慢性肝炎肝硬變患者HCC發生風險的指標。因此，在揭示HCC發生和發展的研究過程中，我們不能忽視Id1基因在其中所起的重要作用。
RNAi技術通過細胞內的RNA酶Dicer，將雙鏈的RNA分子降解為21～23堿基對大小的siRNA，后者再結合核酶復合物形成RNA誘導沉默復合物，之后再定位并切割對應的mRNA，從而達到抑制同源基因表達的效果[24]。但由于siRNA的易降解性，需要特定的載體以維持其長期穩定的RNAi效果。2003年，Stewart等[25]首次報道了慢病毒介導的RNAi在Hela細胞和原代樹突細胞中的應用。慢病毒屬逆轉錄病毒，慢病毒載體是在其基礎上通過重組改造而成的，其表達效率和安全性均更高[26]。慢病毒載體的主要結構包括3個部分，分別為包裝質粒、包膜質粒和轉移質粒。將3種質粒經重組改造后感染293T細胞，即可產生存在復制缺陷的HIV病毒[27]。這種病毒在宿主體內不但可以長期穩定表達，而且免疫反應輕微，并且可同時兼容多個轉錄啟動子。將慢病毒載體高效感染和整合的特性，結合RNAi對同源基因特異性抑制的特性，即構成了慢病毒載體介導的RNAi。它對原代培養的人巨噬細胞、造血干細胞等各類哺乳動物細胞均具有有效的RNAi效果。由于慢病毒載體能夠將外源基因安全和高效地轉入動物或人體內，并能夠使目的基因高效、穩定且持續表達，故在臨床中特別是在腫瘤治療中具有很好的應用前景。
本實驗設計、篩選并成功構建了人Id1慢病毒干擾載體，并成功實現慢病毒的包裝，病毒滴度為2.0×109 TU/mL。將包裝好的慢病毒（Id1-RNAi-LV）感染HepG2細胞后，與VCON組和VNC組比較，其Id1 mRNA和蛋白的表達水平均較低，表明慢病毒干擾載體構建成功。本實驗構建的慢病毒干擾載體可用于研究Id1基因沉默對HCC發生和發展過程的影響，有助于進一步了解在HCC形成過程中與Id1基因相關的分子通路，以及尋找有效的HCC基因治療靶點；同時其有助于研究Id1基因與HCC腫瘤耐藥間的關系。如果抑制Id1基因的表達可以降低腫瘤對化療藥物的耐受作用，那么將Id1慢病毒干擾載體結合至化療藥物上共同使用則可能增強藥物介導的凋亡并逆轉腫瘤的抗藥性。此外，本實驗成功構建的Id1慢病毒干擾載體對有Id1參與的其他人類腫瘤的研究也具有重要價值。
