引用本文： 李曉剛, 陸平, 靳文帝, 李波, 王春曉, 牛朝, 羅開元. 不同放射劑量的125Ⅰ粒子對人低分化胃癌細胞影響的動物實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(12): 1518-1523. doi: 10.7507/1007-9424.20140359 復制
125I粒子組織間植入作為一種新興的對腫瘤行放射治療的技術，目前已被廣泛應用于臨床各種惡性腫瘤的放射治療中[1-2]，其中在胃癌的治療中，其與外科手術相結合，取得了良好的臨床療效[3]。粒子組織間植入放射治療是解決術后局部復發及遠處轉移的有效方法，但其分子生物學機理尚不十分明確，多考慮與誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長并影響細胞增殖有關。細胞周期因子E（cyclinE）與細胞周期素依賴性激酶2（CDK2）均是細胞周期由G1期到S期的主要限速因子[4]。本實驗通過將125I粒子植入BGC823人低分化胃癌組織后，從細胞生長、凋亡、cyclinE表達等方面進行量化分析，以探討125I粒子組織間植入治療胃癌的機理及其合適的劑量，為臨床治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
SPF級BLAB nu/nu裸鼠64只，體質量17～22 g（平均20 g），4周齡，雄性，購自北京維通利華公司。主要材料：BGC823人低分化胃癌細胞系（中國科學院上海細胞庫）、125I粒子（放射性劑量分別為1.48×10-7、2.22×10-7及2.96×10-7 Bq，上海欣科醫藥公司）、DMEM培養液（美國Hyclone公司）、胎牛血清（烏拉圭GIBCO公司）、RNA提取試劑盒（美國BECKMAN COULTER公司）、抗人表皮生長因子抗體（Anti-hEGFR，美國R & D SYSTEMS公司）、PCR試劑盒（深圳匹基生物工程有限公司）、Ferme-ntas逆轉錄試劑盒（杭州主諾生物技術有限公司）以及DNA提純試劑盒（中國上海科敏生物科技有限公司）。主要設備：18G植入針（美國Mick Radio-Nuclear公司）、ABI實時熒光定量PCR（PT-PCR）儀（ABI7300，美國ABI公司）、流式細胞儀（MoFlo XDP，美國Beckman Coulter公司）、顯微拍攝系統（CH2型，日本NIKON公司）及Primer Premier 5.0軟件（加拿大Premier公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
將BGC823細胞復蘇后置于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，于37℃、飽和濕度、5% CO2的培養箱中進行培養，2～3 d傳代1次。取對數生長期細胞，用PBS緩沖液配制成5×107個/mL的細胞懸液，用于制備荷瘤鼠模型。
1.2.2 制備荷瘤鼠模型
接到裸鼠后，在SPF條件下于動物實驗室飼養2～3 d，以適應環境。取上述細胞懸液種植于裸鼠左肩胛皮下（1.00 mL），在SPF條件下于動物實驗室飼養3周左右，待腫瘤生長至0.7～1.2 cm時作為荷瘤鼠模型，用于后續實驗。
1.2.3 制備荷瘤鼠放射模型
將64只荷瘤鼠隨機分為4組（隨機數字表法）：空白對照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組16只。空白對照組僅植入1粒空白粒子（不含放射性元素）；低劑量組、中劑量組及高劑量組為實驗組，分別植入放射劑量為1.48×10-7、2.22×10-7及2.96×10-7 Bq的125I粒子。植入方法：測量腫瘤長短徑后，按照無菌原則用粒子植入針沿腫瘤長徑方向將粒子植入到腫瘤中央，使粒子到腫瘤各邊緣距離均＜1.0 cm。在SPF條件下于動物實驗室飼養，各飼養籠之間的距離＞50.0 cm。本實驗周期為28 d，時間較短，無裸鼠發生多個轉移瘤的情況，且實驗期間均無荷瘤裸鼠死亡。
1.2.4 測量腫瘤體積
分別于粒子植入前、植入后7、14、21及28 d，4組均隨機（隨機數字表法）抽取4只荷瘤鼠處死，剝取瘤體稱重，并測量腫瘤長短徑，計算腫瘤體積〔體積（mm3）=長徑（mm）×短徑（mm）2/2）〕。
1.2.5 流式細胞儀檢測腫瘤組織的細胞凋亡率
分別于植入粒子后14 d和28 d，取上述標本采用流式細胞法（FCM）檢測腫瘤組織的細胞凋亡率。取0.1 g腫瘤組織，以4℃預冷的PBS緩沖液洗滌2次，每次10 min；采用剪碎機械法[5]制備單細胞懸液樣品，然后加入PBS緩沖液，吹打收集的細胞，制成細胞懸液（1×103個/mL）；離心（2 000 r/min，r=13.5 cm，5 min），沉淀用PBS緩沖液洗滌2次，每次4 min；加入核糖核酸酶200.00μL，37℃孵育10 min；最后加入碘化丙啶（PI）1 000.00μL，染色30 min后上流式細胞儀分析。
1.2.6 RT-PCR法檢測cyclinE mRNA的表達
于植入粒子后14 d和28 d，采用RT-PCR法檢測腫瘤組織中cyclinE mRNA的表達。cyclinE基因的上游引物序列為5′-GGAGCGGGATGCGAAGGAGC-3′，下游引物序列為5′-AGCGGGGAGCCTCTGGAT-GG-3′（擴增長度為297 bp）。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的上游引物序列為5′-GCATGGCCT-TCCGTGTCCCC-3′，下游引物序列為5′-GGCTGG-GGTCCAGGGGTCT-3′（擴增長度為339 bp）。本實驗所需引物均由引物設計軟件Primer Premier 5.0設計，并且經由美國國立生物技術信息中心（NCBI）中的BLAST比對以驗證引物的準確性及可靠性。所有引物均由廈門浩博生物技術有限公司協助完成。取0.1 g腫瘤組織，按常規Trizol法提取總RNA，于-80℃冰箱中保存。本實驗提取的RNA的濃度為1×10-3 ng/L，符合實驗要求。取5μg RNA，逆轉錄為cDNA，逆轉錄步驟按試劑盒操作說明書進行，并以cDNA為模板進行PCR擴增。25.00μL PCR反應體系為：cDNA 2.00μL，Mg2+ 1.60μL，TaqDNA多聚酶0.20μL，10μmol/L的上下游引物各0.40μL，10μmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.50μL，10×PCR緩沖液2.50μL，核苷酸膠體染料（SYBR-GreenⅠ）0.13μL，再以焦碳酸二乙酯（DEPC）水補足至25.00μL。反應條件：95℃10 min預變性；95℃15 s變性，59.5℃25 s退火，72℃1 min延伸，共40個循環。PCR結束后采用溶解曲線確定產物的特異性，以得出循環閾值（threshold cycle，Ct），并計算目的基因的表達水平。cyclinE mRNA的表達水平采用公式2-△△Ct計算。
1.3 統計學方法
實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 4組裸鼠的腫瘤體積
除空白對照組外（空白對照組的變化不大），低、中及高劑量組的腫瘤體積隨時間延長均呈下降趨勢。①植入前4組裸鼠的腫瘤體積比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②植入粒子后7、14及21 d，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的腫瘤體積均較小（P < 0.05）；而后3組之間的差異無統計學意義（P > 0.05）。③28 d時，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的腫瘤體積均較小（P < 0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組的腫瘤體積均較大（P < 0.05），而中劑量組與高劑量組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 1。
表1
各時點4組裸鼠的腫瘤體積和質量（n=4，2.2 4組裸鼠的腫瘤質量
除空白對照組外（空白對照組的變化不大），低、中及高劑量組的腫瘤質量隨時間延長均呈下降趨勢。①植入前和植入后7 d，4組裸鼠的腫瘤質量比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。②植入粒子后14 d和21 d，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的腫瘤質量均較輕（P < 0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組的瘤體質量均較重（P < 0.05），而中劑量組與高劑量組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。③28 d時，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的腫瘤質量均較輕（P < 0.05），且后3組兩兩比較差異均有統計學意義，低、中及高劑量組的瘤體質量依次增加（P < 0.05），見表 1。
2.3 4組裸鼠腫瘤組織的細胞凋亡率
①植入粒子后14 d，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的凋亡率均較高（P < 0.05），但后3組比較差異無統計學差異（P > 0.05）。②28 d時，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的凋亡率均較高（P < 0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組的凋亡率均較低（P < 0.05），但中劑量組和高劑量組的凋亡率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。③同組內與14 d比較，28 d時除空白對照組的差異無統計學意義外（P > 0.05），其余3組的凋亡率水平均較高（P < 0.05），見表 2和圖 1。
表2
4組裸鼠腫瘤組織的細胞凋亡率及cyclinE mRNA表達水平結果（n=4）
Table2.
The results of tumor cell apoptosis rates and expression levels of cyclinE mRNA in nude mice of 4 groups (n=4)
圖1
示粒子植入28 d時4組裸鼠腫瘤細胞的流式細胞圖。1A：空白對照組；1B：低劑量組；1C：中劑量組；1D：高劑量組??圖 2 28 d時3個實驗組裸鼠的腫瘤組織行RT-PCR檢測的溶解曲線及擴增曲線。2A：低劑量組的溶解曲線；2B：低劑量組的擴增曲線；2C：中劑量組的溶解曲線；2D：中劑量組的擴增曲線；2E：高劑量組的溶解曲線；2F：高劑量組的擴增曲線
Figure1.
Flow diagrams of tumor cells in nude mice of 4 groups on 28th day after 125I implantation. 1A: Blank control group; 1B: Low dose group; 1C: Middle dose group; 1D: High dose group??Figure 2 Dissolve curves and amplification curves of tumor tissues in nude mice of 4 groups on 28th day after 125I implantation. 2A: Dissolve curve of low dose group; 2B: Amplification curve of low dose group; 2C: Dissolve curve of middle dose group; 2D: Amplification curve of middle dose group; 2E: Dissolve curve of high dose group; 1F: Amplification curve of high dose group
2.4 4組裸鼠腫瘤組織中cyclinE mRNA的表達
①植入粒子后14 d，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的cyclinE mRNA表達水平均較低（P < 0.05），而后3組間的差異無統計學意義（P > 0.05）。②28 d時，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的cyclinE mRNA表達水平均較低（P < 0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組的cyclinE mRNA表達水平均較高（P < 0.05），但中劑量組和高劑量組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。③同組內與14 d比較，28 d時除空白對照組的差異無統計學意義外（P > 0.05），其余3組的cyclinE mRNA表達水平均較低（P < 0.05），見表 2和圖 2。
3 討論
通過植入放射性粒子以近距離治療惡性腫瘤是一種新的放療手段，其中125I粒子是目前組織間放療最常用的放射性粒子。它是一種人工合成的同位素，半衰期為60.1 d，相對較長；相比傳統體外放射治療，其具有精度高、創傷小、射線殺傷半徑適當等優點[6]。在衰變過程中，大部分衰變能量經內轉換而釋放X射線和γ射線，其中低能量的γ射線持續照射可以抑制腫瘤細胞的有絲分裂，引發腫瘤細胞損傷而導致腫瘤細胞凋亡[7]。低分化結腸腺癌因其惡性程度較高，增殖能力較強而預后不佳[8-10]。國外文獻[11]報道，以125I放射粒子組織間植入治療結腸腺癌時，除射線直接造成的細胞死亡外，其還具有誘導細胞凋亡的作用，提示其是一種有效的治療方法。
3.1 125I粒子能抑制人低分化胃癌細胞的增殖
腫瘤細胞的增殖能力是決定其生長速度的重要因素。本實驗結果顯示，荷瘤鼠胃癌瘤體經125I粒子體外照射后，均出現體積減小、質量減輕的現象，提示腫瘤細胞的生長速度放緩，表明125I粒子組織間植入可以明顯抑制胃癌瘤體的生長，延長瘤體的倍增時間；并且這種效應隨照射時間的延長而逐漸明顯，低劑量組植入28 d時其瘤體體積和質量較其余3組均較小（輕），效果較好。考慮與其放射線直接破壞癌細胞DNA雙鍵，并通過激活與細胞凋亡相關的基因而誘導細胞程序性死亡有關[12]。
3.2 125I粒子劑量與放射性抗拒
本實驗結果顯示，14 d時，低、中及高劑量組的凋亡率比較差異無統計學意義（P > 0.05），但28 d時低劑量組的凋亡率較中劑量組和高劑量組均高（P < 0.05）；且同組內與14 d比較，3個實驗組28 d時的凋亡率均較高（P < 0.05）。該結果提示，125I放射粒子作用于BGC823人低分化胃癌細胞的過程中，隨著照射時間延長，低劑量組的腫瘤生長抑制作用更明顯。這說明可能存在如下機理：腫瘤細胞為了盡量減少輻射對自身的毒性作用，增強了自身生存的保護性反應，這也是腫瘤放射性抗拒的體現[13-15]。
3.3 細胞周期蛋白與放射性抗拒
cyclinE和CDK2均是控制細胞從G1晚期進入S期的限速蛋白因子，其過表達可以促使細胞由G1期向S期過渡，使細胞增生失控而出現惡性腫瘤式增殖[16]。其在正常組織中一般呈低表達，而在惡性腫瘤組織中呈高表達[17]。有文獻[18-23]報道，cyclinE-CDK2復合物與細胞周期依賴性激酶特異性抑制蛋白（p27KIP1）相結合后，在細胞周期的G1/S期調控中起抑制作用，從而影響腫瘤細胞的放射敏感性，說明cyclinE與腫瘤細胞的放射性抗拒相關。有研究[24-25]發現，細胞周期運行的起始因子即cyclinD1可下調p27KIP1的表達，增強腫瘤細胞的放射敏感性。本實驗結果也恰恰證實了這一結論：在空白對照組中cyclinE mRNA呈高表達，而在3個實驗組中cyclinE mRNA的表達下調；在28 d時，低劑量組的cyclinE mRNA表達水平最低。該結果說明，腫瘤細胞出現了放射性抗拒，并隨放射劑量的增加而增強。
125I粒子組織間植入作為一種新興的對腫瘤行放射治療的技術，目前已被廣泛應用于臨床各種惡性腫瘤的放射治療中[1-2]，其中在胃癌的治療中，其與外科手術相結合，取得了良好的臨床療效[3]。粒子組織間植入放射治療是解決術后局部復發及遠處轉移的有效方法，但其分子生物學機理尚不十分明確，多考慮與誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長并影響細胞增殖有關。細胞周期因子E（cyclinE）與細胞周期素依賴性激酶2（CDK2）均是細胞周期由G1期到S期的主要限速因子[4]。本實驗通過將125I粒子植入BGC823人低分化胃癌組織后，從細胞生長、凋亡、cyclinE表達等方面進行量化分析，以探討125I粒子組織間植入治療胃癌的機理及其合適的劑量，為臨床治療提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
SPF級BLAB nu/nu裸鼠64只，體質量17～22 g（平均20 g），4周齡，雄性，購自北京維通利華公司。主要材料：BGC823人低分化胃癌細胞系（中國科學院上海細胞庫）、125I粒子（放射性劑量分別為1.48×10-7、2.22×10-7及2.96×10-7 Bq，上海欣科醫藥公司）、DMEM培養液（美國Hyclone公司）、胎牛血清（烏拉圭GIBCO公司）、RNA提取試劑盒（美國BECKMAN COULTER公司）、抗人表皮生長因子抗體（Anti-hEGFR，美國R & D SYSTEMS公司）、PCR試劑盒（深圳匹基生物工程有限公司）、Ferme-ntas逆轉錄試劑盒（杭州主諾生物技術有限公司）以及DNA提純試劑盒（中國上海科敏生物科技有限公司）。主要設備：18G植入針（美國Mick Radio-Nuclear公司）、ABI實時熒光定量PCR（PT-PCR）儀（ABI7300，美國ABI公司）、流式細胞儀（MoFlo XDP，美國Beckman Coulter公司）、顯微拍攝系統（CH2型，日本NIKON公司）及Primer Premier 5.0軟件（加拿大Premier公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
將BGC823細胞復蘇后置于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，于37℃、飽和濕度、5% CO2的培養箱中進行培養，2～3 d傳代1次。取對數生長期細胞，用PBS緩沖液配制成5×107個/mL的細胞懸液，用于制備荷瘤鼠模型。
1.2.2 制備荷瘤鼠模型
接到裸鼠后，在SPF條件下于動物實驗室飼養2～3 d，以適應環境。取上述細胞懸液種植于裸鼠左肩胛皮下（1.00 mL），在SPF條件下于動物實驗室飼養3周左右，待腫瘤生長至0.7～1.2 cm時作為荷瘤鼠模型，用于后續實驗。
1.2.3 制備荷瘤鼠放射模型
將64只荷瘤鼠隨機分為4組（隨機數字表法）：空白對照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組16只。空白對照組僅植入1粒空白粒子（不含放射性元素）；低劑量組、中劑量組及高劑量組為實驗組，分別植入放射劑量為1.48×10-7、2.22×10-7及2.96×10-7 Bq的125I粒子。植入方法：測量腫瘤長短徑后，按照無菌原則用粒子植入針沿腫瘤長徑方向將粒子植入到腫瘤中央，使粒子到腫瘤各邊緣距離均＜1.0 cm。在SPF條件下于動物實驗室飼養，各飼養籠之間的距離＞50.0 cm。本實驗周期為28 d，時間較短，無裸鼠發生多個轉移瘤的情況，且實驗期間均無荷瘤裸鼠死亡。
1.2.4 測量腫瘤體積
分別于粒子植入前、植入后7、14、21及28 d，4組均隨機（隨機數字表法）抽取4只荷瘤鼠處死，剝取瘤體稱重，并測量腫瘤長短徑，計算腫瘤體積〔體積（mm3）=長徑（mm）×短徑（mm）2/2）〕。
1.2.5 流式細胞儀檢測腫瘤組織的細胞凋亡率
分別于植入粒子后14 d和28 d，取上述標本采用流式細胞法（FCM）檢測腫瘤組織的細胞凋亡率。取0.1 g腫瘤組織，以4℃預冷的PBS緩沖液洗滌2次，每次10 min；采用剪碎機械法[5]制備單細胞懸液樣品，然后加入PBS緩沖液，吹打收集的細胞，制成細胞懸液（1×103個/mL）；離心（2 000 r/min，r=13.5 cm，5 min），沉淀用PBS緩沖液洗滌2次，每次4 min；加入核糖核酸酶200.00μL，37℃孵育10 min；最后加入碘化丙啶（PI）1 000.00μL，染色30 min后上流式細胞儀分析。
1.2.6 RT-PCR法檢測cyclinE mRNA的表達
于植入粒子后14 d和28 d，采用RT-PCR法檢測腫瘤組織中cyclinE mRNA的表達。cyclinE基因的上游引物序列為5′-GGAGCGGGATGCGAAGGAGC-3′，下游引物序列為5′-AGCGGGGAGCCTCTGGAT-GG-3′（擴增長度為297 bp）。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的上游引物序列為5′-GCATGGCCT-TCCGTGTCCCC-3′，下游引物序列為5′-GGCTGG-GGTCCAGGGGTCT-3′（擴增長度為339 bp）。本實驗所需引物均由引物設計軟件Primer Premier 5.0設計，并且經由美國國立生物技術信息中心（NCBI）中的BLAST比對以驗證引物的準確性及可靠性。所有引物均由廈門浩博生物技術有限公司協助完成。取0.1 g腫瘤組織，按常規Trizol法提取總RNA，于-80℃冰箱中保存。本實驗提取的RNA的濃度為1×10-3 ng/L，符合實驗要求。取5μg RNA，逆轉錄為cDNA，逆轉錄步驟按試劑盒操作說明書進行，并以cDNA為模板進行PCR擴增。25.00μL PCR反應體系為：cDNA 2.00μL，Mg2+ 1.60μL，TaqDNA多聚酶0.20μL，10μmol/L的上下游引物各0.40μL，10μmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.50μL，10×PCR緩沖液2.50μL，核苷酸膠體染料（SYBR-GreenⅠ）0.13μL，再以焦碳酸二乙酯（DEPC）水補足至25.00μL。反應條件：95℃10 min預變性；95℃15 s變性，59.5℃25 s退火，72℃1 min延伸，共40個循環。PCR結束后采用溶解曲線確定產物的特異性，以得出循環閾值（threshold cycle，Ct），并計算目的基因的表達水平。cyclinE mRNA的表達水平采用公式2-△△Ct計算。
1.3 統計學方法
實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 4組裸鼠的腫瘤體積
除空白對照組外（空白對照組的變化不大），低、中及高劑量組的腫瘤體積隨時間延長均呈下降趨勢。①植入前4組裸鼠的腫瘤體積比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②植入粒子后7、14及21 d，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的腫瘤體積均較小（P < 0.05）；而后3組之間的差異無統計學意義（P > 0.05）。③28 d時，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的腫瘤體積均較小（P < 0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組的腫瘤體積均較大（P < 0.05），而中劑量組與高劑量組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 1。
表1
各時點4組裸鼠的腫瘤體積和質量（n=4，2.2 4組裸鼠的腫瘤質量
除空白對照組外（空白對照組的變化不大），低、中及高劑量組的腫瘤質量隨時間延長均呈下降趨勢。①植入前和植入后7 d，4組裸鼠的腫瘤質量比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。②植入粒子后14 d和21 d，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的腫瘤質量均較輕（P < 0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組的瘤體質量均較重（P < 0.05），而中劑量組與高劑量組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。③28 d時，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的腫瘤質量均較輕（P < 0.05），且后3組兩兩比較差異均有統計學意義，低、中及高劑量組的瘤體質量依次增加（P < 0.05），見表 1。
2.3 4組裸鼠腫瘤組織的細胞凋亡率
①植入粒子后14 d，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的凋亡率均較高（P < 0.05），但后3組比較差異無統計學差異（P > 0.05）。②28 d時，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的凋亡率均較高（P < 0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組的凋亡率均較低（P < 0.05），但中劑量組和高劑量組的凋亡率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。③同組內與14 d比較，28 d時除空白對照組的差異無統計學意義外（P > 0.05），其余3組的凋亡率水平均較高（P < 0.05），見表 2和圖 1。
表2
4組裸鼠腫瘤組織的細胞凋亡率及cyclinE mRNA表達水平結果（n=4）
Table2.
The results of tumor cell apoptosis rates and expression levels of cyclinE mRNA in nude mice of 4 groups (n=4)
圖1
示粒子植入28 d時4組裸鼠腫瘤細胞的流式細胞圖。1A：空白對照組；1B：低劑量組；1C：中劑量組；1D：高劑量組??圖 2 28 d時3個實驗組裸鼠的腫瘤組織行RT-PCR檢測的溶解曲線及擴增曲線。2A：低劑量組的溶解曲線；2B：低劑量組的擴增曲線；2C：中劑量組的溶解曲線；2D：中劑量組的擴增曲線；2E：高劑量組的溶解曲線；2F：高劑量組的擴增曲線
Figure1.
Flow diagrams of tumor cells in nude mice of 4 groups on 28th day after 125I implantation. 1A: Blank control group; 1B: Low dose group; 1C: Middle dose group; 1D: High dose group??Figure 2 Dissolve curves and amplification curves of tumor tissues in nude mice of 4 groups on 28th day after 125I implantation. 2A: Dissolve curve of low dose group; 2B: Amplification curve of low dose group; 2C: Dissolve curve of middle dose group; 2D: Amplification curve of middle dose group; 2E: Dissolve curve of high dose group; 1F: Amplification curve of high dose group
2.4 4組裸鼠腫瘤組織中cyclinE mRNA的表達
①植入粒子后14 d，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的cyclinE mRNA表達水平均較低（P < 0.05），而后3組間的差異無統計學意義（P > 0.05）。②28 d時，與空白對照組比較，低、中及高劑量組的cyclinE mRNA表達水平均較低（P < 0.05）；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組的cyclinE mRNA表達水平均較高（P < 0.05），但中劑量組和高劑量組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。③同組內與14 d比較，28 d時除空白對照組的差異無統計學意義外（P > 0.05），其余3組的cyclinE mRNA表達水平均較低（P < 0.05），見表 2和圖 2。
3 討論
通過植入放射性粒子以近距離治療惡性腫瘤是一種新的放療手段，其中125I粒子是目前組織間放療最常用的放射性粒子。它是一種人工合成的同位素，半衰期為60.1 d，相對較長；相比傳統體外放射治療，其具有精度高、創傷小、射線殺傷半徑適當等優點[6]。在衰變過程中，大部分衰變能量經內轉換而釋放X射線和γ射線，其中低能量的γ射線持續照射可以抑制腫瘤細胞的有絲分裂，引發腫瘤細胞損傷而導致腫瘤細胞凋亡[7]。低分化結腸腺癌因其惡性程度較高，增殖能力較強而預后不佳[8-10]。國外文獻[11]報道，以125I放射粒子組織間植入治療結腸腺癌時，除射線直接造成的細胞死亡外，其還具有誘導細胞凋亡的作用，提示其是一種有效的治療方法。
3.1 125I粒子能抑制人低分化胃癌細胞的增殖
腫瘤細胞的增殖能力是決定其生長速度的重要因素。本實驗結果顯示，荷瘤鼠胃癌瘤體經125I粒子體外照射后，均出現體積減小、質量減輕的現象，提示腫瘤細胞的生長速度放緩，表明125I粒子組織間植入可以明顯抑制胃癌瘤體的生長，延長瘤體的倍增時間；并且這種效應隨照射時間的延長而逐漸明顯，低劑量組植入28 d時其瘤體體積和質量較其余3組均較小（輕），效果較好。考慮與其放射線直接破壞癌細胞DNA雙鍵，并通過激活與細胞凋亡相關的基因而誘導細胞程序性死亡有關[12]。
3.2 125I粒子劑量與放射性抗拒
本實驗結果顯示，14 d時，低、中及高劑量組的凋亡率比較差異無統計學意義（P > 0.05），但28 d時低劑量組的凋亡率較中劑量組和高劑量組均高（P < 0.05）；且同組內與14 d比較，3個實驗組28 d時的凋亡率均較高（P < 0.05）。該結果提示，125I放射粒子作用于BGC823人低分化胃癌細胞的過程中，隨著照射時間延長，低劑量組的腫瘤生長抑制作用更明顯。這說明可能存在如下機理：腫瘤細胞為了盡量減少輻射對自身的毒性作用，增強了自身生存的保護性反應，這也是腫瘤放射性抗拒的體現[13-15]。
3.3 細胞周期蛋白與放射性抗拒
cyclinE和CDK2均是控制細胞從G1晚期進入S期的限速蛋白因子，其過表達可以促使細胞由G1期向S期過渡，使細胞增生失控而出現惡性腫瘤式增殖[16]。其在正常組織中一般呈低表達，而在惡性腫瘤組織中呈高表達[17]。有文獻[18-23]報道，cyclinE-CDK2復合物與細胞周期依賴性激酶特異性抑制蛋白（p27KIP1）相結合后，在細胞周期的G1/S期調控中起抑制作用，從而影響腫瘤細胞的放射敏感性，說明cyclinE與腫瘤細胞的放射性抗拒相關。有研究[24-25]發現，細胞周期運行的起始因子即cyclinD1可下調p27KIP1的表達，增強腫瘤細胞的放射敏感性。本實驗結果也恰恰證實了這一結論：在空白對照組中cyclinE mRNA呈高表達，而在3個實驗組中cyclinE mRNA的表達下調；在28 d時，低劑量組的cyclinE mRNA表達水平最低。該結果說明，腫瘤細胞出現了放射性抗拒，并隨放射劑量的增加而增強。
