引用本文： 劉劍, 李立, 張升寧, 李來邦, 王曉川. 大鼠原位肝移植術后早期死亡的原因分析及處理策略. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(12): 1524-1530. doi: 10.7507/1007-9424.20140360 復制
大鼠肝移植模型的建立是進行肝移植基礎研究的重要方法。由于動物小，操作復雜，且實驗期間動物存在明顯的病理變化，所以需要較長的培訓時間與重復操作才能掌握該項技術[1]。在實踐中筆者發現，大鼠接受肝移植術后存活時間較少超過24 h是肝移植技術的瓶頸，在達到該項要求后，實驗成功率會大幅提高。如何迅速提高動物的早期存活率（存活時間＞24 h）是我們盡快完成學習曲線的關鍵。因此，本實驗通過建立大鼠原位肝移植（orthotopic liver transplantation，OLT）模型，觀察大鼠術后的死亡情況，分析導致大鼠24 h內死亡的原因，希望能對后期肝移植動物實驗有新的啟示。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要試劑與材料
實驗動物為600只雄性清潔級雜系SD大鼠（供體和受體均為300只），10～12周齡，體質量230～250 g，均購自昆明醫科大學實驗動物中心（生產許可證：SCXK滇2011-0003，批號：2009-7），并飼養于昆明醫科大學云南省天然藥物藥理重點實驗室、SPF級動物飼養中心，飼養環境溫度為24℃。所有的實驗操作均參照《實驗動物和操作管理規程》[2]進行。每對供受體配對時供體的體質量略輕于受體，但體質量相差≤10 g。主要試劑：硫酸阿托品注射液、醫用乙醚、肝素鈉注射液、碘伏消毒液、乳酸林格液及地塞米松注射液。材料：顯微手術器械〔顯微外科組織鑷、持針器、血管阻斷鉗（Bulldog鉗）及無損傷血管鉗（Satinsky鉗）〕、結扎和吻合線、膽道支撐管、肝上下腔靜脈（SHIVC）套管、門靜脈套管、自制手術板、手術拉鉤、支架、麻醉器、棉球、紗布、各種規格的注射器、棉簽、穿剌針等。其中受體套管結扎線均為4-0縫線，自制的細絲線由4-0的縫線抽成8～12根而成，血管吻合線均采用7-0無損傷血管吻合線，關腹線均采用2-0縫線。膽道支撐管由硬膜外麻醉導管自制而成，支撐管的內徑為0.5 mm，長約0.5 cm，左右兩端削成60°的剖面。SHIVC和門靜脈套管均選用硬質薄壁的聚乙烯管，SHIVC套管的外徑為2.8 mm，內徑為2.5 mm，長度為1.5 mm；門靜脈套管的外徑為2.2 mm，內徑為2.0 mm，長度為1.5 mm；SHIVC套管和門靜脈套管均留有尾翼，寬約為套管周徑的3/8。
1.2 手術方法
1.2.1 液體配制
灌注液及保存液：乳酸林格液500 mL+肝素1.25×104 U+地塞米松5 mg，搖勻；沖洗液：0.9%生理鹽水100 mL+肝素0.25×104 U+地塞米松5 mg+5%碳酸氫鈉溶液30 mL，搖勻；驅血液以等體積的生理鹽水和5%碳酸氫鈉溶液配置。
1.2.2 術前準備
受體術前禁食6 h、不禁水，供體無嚴格要求。供受體均采用醫用乙醚吸入麻醉，麻醉前均給予肌注硫酸阿托品溶液（0.1 mg/kg）。
1.2.3 供體手術
大鼠呈仰臥位固定，胸腹部剃毛，碘伏消毒，鋪巾，取腹部大“十”字切口進腹。向下游離下腔靜脈至髂總靜脈，結扎右腎靜脈及右腎上腺靜脈待切斷。穿剌右腰靜脈的遠端，注入沖洗液2 mL，以完成供肝的肝素化。向近心端穿剌腹主動脈，并以2.5 mL/min的速度開始灌注0～4℃灌注液20 mL，灌注的同時給予冰屑澆灌在供肝表面。肝臟應充分灌注，使其顏色呈土黃色、質地均勻（圖 1）。剪開膈肌后阻斷胸主動脈，剪開右心耳，在右腎靜脈注入下腔靜脈以遠1 cm處切斷肝下下腔靜脈。按逆時針方向游離肝臟，切斷并結扎右腎動靜脈及下腔靜脈的后交通支，分離、結扎及切斷肝動脈。分離出膽總管，于膽總管前壁、距肝管匯合部4 mm處做一小口，插入膽道支撐管，予以結扎固定。解剖門靜脈，用自制的細絲線在靠近門靜脈處結扎胃冠狀靜脈后，于脾靜脈水平切斷門靜脈（圖 2）。游離、切斷并結扎左膈下靜脈，分離并切斷肝左葉與膈下食管段動靜脈的交通支，緊貼膈肌環切斷SHIVC。將肝臟完整切除后置于0～4℃的保存液中保存。
圖1
示供肝的灌注??圖 2示供肝門靜脈的游離??圖 3示供肝的套管(袖口)??圖 4示供肝與受體SHIVC的吻合??圖 5示受體肝下下腔靜脈套管??圖 6示受體完成OLT手術, 待關腹
Figure1.
Perfusion of donor liver??Figure 2 Anatomised the portal vein of the donor liver??Figure 3 The cuff of the donor liver??Figure 4 The vascular anastomosis of SHIVC??Figure 5 The cuff of the recipient hepatic inferior vena cava??Figure 6 Abdominal closure would been performed when recipient operation was done
1.2.4 修整供肝
在0～4℃乳酸林格液中修整供肝。以無損傷血管鉗夾住袖套柄，并用橡皮泥固定血管鉗。將肝下下腔靜脈及門靜脈外翻，將血管袖套分別套在肝下下腔靜脈及門靜脈上（圖 3）。以顯微血管夾夾住肝下下腔靜脈，以防供肝血流復流時血液流出。小心翻轉肝臟，在SHIVC左側及右側各用7-0血管吻合線由外向內縫扎標記，以待吻合。
1.2.5 受體手術
大鼠呈仰臥位固定，胸腹部剃毛，碘伏消毒，鋪巾，取腹部自劍突至恥骨上的、約6 cm長的正中切口。逆時針分離肝臟，游離肝下下腔靜脈至右腎靜脈水平，并穿過其后方預置自制細絲線1根，以備肝下下腔靜脈吻合用。分離右腎上腺靜脈與肝下下腔靜脈的交通支，并用自制細絲線結扎后切斷。剪開肝后韌帶，游離、切斷并結扎肝動脈。分離出膽總管并剪斷，將處理好的膽總管附于腸管上方備用。仔細分離、切斷并結扎左膈下靜脈及肝左葉與膈下食管段動靜脈的交通支，剪開SHIVC后方與膈肌的粘連。進入無肝期之前，通過增加乙醚濃度及接觸面積加深麻醉程度，進入無肝期前停止乙醚吸入，并記錄無肝期開始時間。夾閉肝下下腔靜脈及門靜脈，于門靜脈分叉處穿剌，注入常溫驅血液2 mL。用無損傷血管鉗將SHIVC連同3 mm膈肌一并鉗夾以阻斷SHIVC。剪斷門靜脈，移出受體肝臟后徹底止血。將供體肝臟按原位置入受體腹腔，行供體與受體SHIVC的吻合（圖 4）。吻合時用7-0的血管吻合線從左向右、先后壁再前壁、連續全層外翻縫合，針距與縫合寬度相等（2～3 mm），至左角處、最后1針前用沖洗液沖出氣泡，鎖邊縫合后從內向外于受體側穿出，與左角吊線和結扎線打結后結束SHIVC的吻合[5-6]。插入門靜脈袖套管，用自制的細絲線結扎固定，開放門靜脈血管夾，此時無肝期結束。開放供體肝下下腔靜脈血管夾后，迅速將供體的肝下下腔靜脈套管插入受體肝下下腔靜脈，用自制的細絲線結扎固定（圖 5）。固定供體的膽道支撐管，用生理鹽水沖洗，將受體膽總管套入膽道支撐管，用自制的細絲線結扎固定，用大網膜覆蓋于膽總管表面（圖 6）。最后用溫熱的生理鹽水沖洗腹腔，復位腸管，吸出滲液后關腹，術畢。
1.2.6 術后處理
術后大鼠給予單籠飼養觀察，用紅外線燈加熱復溫，用棉布保暖，2 h后自由進食水，同時給予抗生素預防感染（肌注青霉素2×105 U，術后僅1次）。術后24 h內每小時觀察大鼠情況1次，截止至術后24 h。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（
2 結果
2.1 術后大鼠死亡情況
由于本實驗關注的重點為術后24 h內的死因，故術中死亡和存活超過24 h的大鼠未納入死因分析。本實驗以改良Kamada二袖套法[3-5]制作大鼠OLT模型300只，其中術中死亡37只（術中死亡組），占12.33%；術后6 h內死亡51只（＜6 h組），占17.00%；術后6～24 h內死亡76只（6～24 h組），占25.33%；術后24 h時仍存活136只（＞24 h組），占45.34%。＜6 h組死亡大鼠的前3位死因分別為術中失血過多、術后失血及血管栓塞，分別占27.45%、27.45%及15.69%，6～24 h組死亡大鼠的前3位死因分別為血管狹窄、術后出血及肺水腫，分別占27.63%、21.05%及19.74%（表 1）。＜6 h組和6～24 h組的死亡原因構成比較差異有統計學意義（χ2=10.21，P < 0.05），表明2組大鼠的死因構成不同。
表1
24 h內大鼠的死亡原因〔例（%）〕
Table1.
Causes of death in rats who died during 24 hours after operation〔case(%)〕
2.2 4組大鼠手術各階段所用時間比較
4組大鼠的供體手術時間、熱缺血時間及無肝期至手術結束時間的差異均無統計學意義（P > 0.05），但4組大鼠的冷缺血時間和無肝期均不同或不全相同（P < 0.05）。在冷缺血時間方面，術中死亡組長于＜6 h組、6～24 h組和＞24 h組（P < 0.05），且＜6 h組和6～24 h組均長于＞24 h組（P < 0.05），但＜6 h組和6～24 h組的差異無統計學意義（P > 0.05）；在無肝期方面，術中死亡組的無肝期長于＜6 h組、6～24 h組和＞24 h組（P < 0.05），但后3組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 2。提示縮短冷缺血時間及無肝期能夠減少動物的早期死亡。
表2
4組大鼠手術各階段所用時間比較（min，3 討論
生存時間長于24 h是大鼠OLT模型成功的重要指標[6-8]，所以對OLT術后24 h內死因的研究是十分必要的。現關于OLT術后動物存活時間短于24 h的原因研究得較少，一般認為，術中失血過多或術后出血是其主要的死因。大多研究[9-12]并未將24 h內死亡的情況進行細分，而是進行籠統分析，導致我們在術后早期除了關注出血外沒有對其他因素加以關注。本實驗結果表明，除了出血原因以外，還存在血管栓塞、血管狹窄、肺水腫、麻醉過深等其他原因。同時還發現，手術中存在嚴重失誤操作的大鼠就算能度過手術，也極少能存活超過6 h，考慮原因為大鼠存在嚴重的不能糾正的血流動力學紊亂，導致心肺功能衰竭而死亡；而大鼠存活超過6 h后，理論上，動物的血流動力學變化趨于平穩，麻醉的影響已經完全消除。因此，6～24 h內死亡的大鼠不能單純用術中失血過多或術后出血解釋，故本實驗將24 h內死亡的動物細分為＜6 h及6～24 h兩組，這有助于深入了解大鼠死亡的真正原因。
3.1 大鼠早期死亡的原因分析及對策
本實驗結果顯示，大鼠早期死亡的原因主要有：術中失血過多、術后出血、血管栓塞、血管狹窄、肺水腫及麻醉過深。其中，造成大鼠于6 h內死亡的原因主要有術中出血過多、術后出血及血管栓塞，其中出血是其關鍵死因，同以往研究[9]結論相符。造成大鼠于6～24 h內死亡的主要原因為血管狹窄、術后出血及肺水腫，出血不是其首要死因。6～24 h組大鼠的死因中，血管栓塞、血管狹窄及肺水腫這3個因素是既往文獻[9-12]未加以重視的問題。上述因素必須在訓練中予以足夠重視。現就血管栓塞、血管狹窄、肺水腫及出血的原因及改進策略分述如下。
3.1.1 血管栓塞
血管栓塞為＜6 h組大鼠的第3位死因，為6～24 h組的第4位死因，因此不可小視。術后血管栓塞常見有2種形式。一為SHIVC、肝下下腔靜脈或門靜脈血栓形成，這種大血管栓塞將嚴重影響循環系統的功能，能迅速導致動物死亡。這種血管栓塞多是由于血流動力學紊亂致血流太慢，最終導致形成血管栓塞，大鼠發生該類血管栓塞時存活時間往往不會超過6 h [13-14]。第二種形式是肝內大面積微血管血栓形成，此時僅少量血液通過肝臟回流入心臟，持續加重后會造成動物死亡。造成肝內微血管血栓的原因可能有很多，如在翻動肝臟時的擠壓對肝臟的機械性損傷、缺血再灌注損傷、休克及酸中毒[15-16]。因此，在后續的實驗中，我們可做以下改進：①灌注徹底，供肝游離時動作輕柔，操作順序以顯露肝下下腔靜脈為起點、逆時針進行，最大限度地減少肝臟的翻動。②在無肝期開始之前驅除肝臟殘血，同時給予碳酸氫鈉以堿化血液。③無肝期中、行門靜脈插管前經門靜脈套管注入常溫生理鹽水約1～2 mL后，再開放肝下下腔靜脈套管上方的阻斷夾以排出供肝內的冷灌注液；稍開放受體門靜脈的血管夾以排出門靜脈內的高凝血液及血凝塊；再用肝素生理鹽水沖洗門靜脈管腔，迅速插入門靜脈袖套管。④根據手術失血或失液情況，可經供體肝下下腔靜脈緩慢補入常溫的生理鹽水或等滲的碳酸氫鈉溶液以糾酸，三管吻合之后立即給予37℃溫熱生理鹽水以促進復溫。
3.1.2 血管狹窄
＜6 h組中因血管狹窄而死亡的大鼠占5.88%，所占比例較低；而6～24 h組中血管狹窄為大鼠死亡的第1位死因，必須加以重視。血管狹窄包括吻合血管或結扎插管血管的狹窄。血管的扭轉是造成血管狹窄的重要原因。吻合血管狹窄多因縫合邊距過大，收線后造成吻合口收縮，吻合口縮小，影響血液回流入心臟，致外周血液淤積，最終造成心功能衰竭[17]。在以后的實驗中我們應注意上述問題。注意對位和防止扭轉是避免血管狹窄的前提條件。在訓練時應用更細的無損傷縫線來進行精確地對合吻合，并縮小邊距，適當縮短針距，同時應注意牽線張力適度；吻合后應繃直吻合口使縫線更緊，以防止吻合血管狹窄。
3.1.3 肺水腫
肝移植手術的創傷較大，并且圍手術期的病理和生理變化復雜，如手術引起的失血、門靜脈和下腔靜脈阻斷引起的回心血量驟減導致的缺血及缺血再灌注損傷，均會導致全身多個臟器受到影響，其中肺被認為是最早和最易受累的器官[18]。據報道[19-20]，OLT術后肺水腫的發生率為34.2％～77.8％，發展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）者占7.8％～23.6％，發展為ARDS后患者的死亡率高達76.5％。本實驗結果顯示，＜6 h組大鼠因肺水腫而死亡者占7.84%，而6～24 h組大鼠因肺水腫而死亡者占19.74%，因此應對肺水腫加以重視。因肺水腫死亡的大鼠存在肺部腫脹，切開肺實質可見紅色的泡沫液流出。雖然上述病理生理變化不可避免，但可采取以下措施以盡量改善無肝期造成的血流動力學紊亂：①在無肝期開始時給予門靜脈推注2～4 mL含有肝素及碳酸氫鈉的生理鹽水以進行驅血，同時其可減少肝臟切除時的失血、補充血容量及中和酸中毒；②為避免前負荷迅速上升對肺造成損傷，在開放SHIVC時不立即完全解除阻斷，而是緩慢開放上腔靜脈后，夾閉SHIVC數秒后再完全開放上腔靜脈血流。
3.1.4 術中失血過多及術后出血
＜6 h組大鼠的死因中，術中失血過多及術后出血并列居于首位，均占27.45%；而6～24 h組因術中出血過多而死亡者占3.95%，因術后出血而死亡者占21.05%，術中失血過多所占比例降低。存活＜6 h大鼠的術后出血主要為SHIVC、門靜脈和肝下下腔靜脈出血。由于出血迅速，大鼠多在6 h內死亡[21]。本實驗6～24 h組死亡大鼠的術后出血主要表現為2種情況：一為腎上腺靜脈及肝下下腔靜脈后方的靜脈叢出血，二為SHIVC吻合口后壁滲血。大鼠術后能夠存活數小時則說明出血量少，但若上述情況無法改善，最終也會導致大鼠死亡。這說明術中徹底止血仍是非常重要的，尤其是在供體實驗時，由于供體已處于灌注狀態，若手法粗暴，則造成的上述血管的損傷或出血難以發現[22]。
3.2 冷缺血時間和無肝期對術后生存期的影響
國外[23]及國內[24]均有文獻報道，縮短無肝期及熱缺血時間是術后存活的關鍵因素，如果無肝期超過30 min，則術后存活的概率很低。本實驗結果顯示，術中死亡組大鼠的無肝期長于其余3組（P < 0.05），提示無肝期是影響術后生存時間的重要因素，縮短無肝期是手術成功的必要條件；但實驗同時也發現，＜6 h組、6～24 h組和＞24 h組的無肝期比較差異無統計學意義（P > 0.05），提示控制無肝期并不是手術成功的充分條件，在控制無肝期的同時我們還必須提高吻合、插管等步驟的質量。縮短無肝期要求簡化一切不必要的操作，提高關鍵環節的質量。吻合與插管是無肝期的關鍵操作，在無肝期前做好吻合與插管的準備是很重要的。
本實驗結果還顯示，冷缺血時間與大鼠的存活時間有關，＞24 h組的冷缺血時間明顯短于其余3組，提示縮短冷缺血時間有助于大鼠的長期存活。筆者認為，其原因有以下2個方面。其一，冷缺血時間包括了無肝期，無肝期縮短使冷缺血時間同時縮短。其二，冷缺血期移植肝在保存液中有不同程度的肝細胞損傷，出現細胞水腫或壞死，且這種損傷是時間依賴性的[25]；同時，長時間的低溫、缺氧及酸中毒也導致了移植肝內的微血管內皮損傷，在血管再通后造成微血栓而導致肝細胞不可逆轉的損傷[26]。因此，筆者提出了相應的改進策略：通過反復操作縮短供體手術時間；同時在供肝的灌注開始后，由另一組人員開始受體肝臟的分離與切除，在多次實驗的基礎上，確認兩邊實驗銜接的時間，確保在無肝期開始前完成供肝的切除及修肝，從而縮短冷缺血時間。
筆者在后期實驗中將實驗操作按上述策略針對性地加以改進，取得了良好的效果，但由于篇幅所限，將予以后續報道。總之，穩定的大鼠肝移植模型的建立并不是一個簡單的照本宣科的過程，需要我們對失敗經歷進行總結，并不斷完善，才能盡快地提高手術技巧，獲得成功。最后希望本實驗的經驗和改進策略能夠為同行提供參考。
大鼠肝移植模型的建立是進行肝移植基礎研究的重要方法。由于動物小，操作復雜，且實驗期間動物存在明顯的病理變化，所以需要較長的培訓時間與重復操作才能掌握該項技術[1]。在實踐中筆者發現，大鼠接受肝移植術后存活時間較少超過24 h是肝移植技術的瓶頸，在達到該項要求后，實驗成功率會大幅提高。如何迅速提高動物的早期存活率（存活時間＞24 h）是我們盡快完成學習曲線的關鍵。因此，本實驗通過建立大鼠原位肝移植（orthotopic liver transplantation，OLT）模型，觀察大鼠術后的死亡情況，分析導致大鼠24 h內死亡的原因，希望能對后期肝移植動物實驗有新的啟示。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要試劑與材料
實驗動物為600只雄性清潔級雜系SD大鼠（供體和受體均為300只），10～12周齡，體質量230～250 g，均購自昆明醫科大學實驗動物中心（生產許可證：SCXK滇2011-0003，批號：2009-7），并飼養于昆明醫科大學云南省天然藥物藥理重點實驗室、SPF級動物飼養中心，飼養環境溫度為24℃。所有的實驗操作均參照《實驗動物和操作管理規程》[2]進行。每對供受體配對時供體的體質量略輕于受體，但體質量相差≤10 g。主要試劑：硫酸阿托品注射液、醫用乙醚、肝素鈉注射液、碘伏消毒液、乳酸林格液及地塞米松注射液。材料：顯微手術器械〔顯微外科組織鑷、持針器、血管阻斷鉗（Bulldog鉗）及無損傷血管鉗（Satinsky鉗）〕、結扎和吻合線、膽道支撐管、肝上下腔靜脈（SHIVC）套管、門靜脈套管、自制手術板、手術拉鉤、支架、麻醉器、棉球、紗布、各種規格的注射器、棉簽、穿剌針等。其中受體套管結扎線均為4-0縫線，自制的細絲線由4-0的縫線抽成8～12根而成，血管吻合線均采用7-0無損傷血管吻合線，關腹線均采用2-0縫線。膽道支撐管由硬膜外麻醉導管自制而成，支撐管的內徑為0.5 mm，長約0.5 cm，左右兩端削成60°的剖面。SHIVC和門靜脈套管均選用硬質薄壁的聚乙烯管，SHIVC套管的外徑為2.8 mm，內徑為2.5 mm，長度為1.5 mm；門靜脈套管的外徑為2.2 mm，內徑為2.0 mm，長度為1.5 mm；SHIVC套管和門靜脈套管均留有尾翼，寬約為套管周徑的3/8。
1.2 手術方法
1.2.1 液體配制
灌注液及保存液：乳酸林格液500 mL+肝素1.25×104 U+地塞米松5 mg，搖勻；沖洗液：0.9%生理鹽水100 mL+肝素0.25×104 U+地塞米松5 mg+5%碳酸氫鈉溶液30 mL，搖勻；驅血液以等體積的生理鹽水和5%碳酸氫鈉溶液配置。
1.2.2 術前準備
受體術前禁食6 h、不禁水，供體無嚴格要求。供受體均采用醫用乙醚吸入麻醉，麻醉前均給予肌注硫酸阿托品溶液（0.1 mg/kg）。
1.2.3 供體手術
大鼠呈仰臥位固定，胸腹部剃毛，碘伏消毒，鋪巾，取腹部大“十”字切口進腹。向下游離下腔靜脈至髂總靜脈，結扎右腎靜脈及右腎上腺靜脈待切斷。穿剌右腰靜脈的遠端，注入沖洗液2 mL，以完成供肝的肝素化。向近心端穿剌腹主動脈，并以2.5 mL/min的速度開始灌注0～4℃灌注液20 mL，灌注的同時給予冰屑澆灌在供肝表面。肝臟應充分灌注，使其顏色呈土黃色、質地均勻（圖 1）。剪開膈肌后阻斷胸主動脈，剪開右心耳，在右腎靜脈注入下腔靜脈以遠1 cm處切斷肝下下腔靜脈。按逆時針方向游離肝臟，切斷并結扎右腎動靜脈及下腔靜脈的后交通支，分離、結扎及切斷肝動脈。分離出膽總管，于膽總管前壁、距肝管匯合部4 mm處做一小口，插入膽道支撐管，予以結扎固定。解剖門靜脈，用自制的細絲線在靠近門靜脈處結扎胃冠狀靜脈后，于脾靜脈水平切斷門靜脈（圖 2）。游離、切斷并結扎左膈下靜脈，分離并切斷肝左葉與膈下食管段動靜脈的交通支，緊貼膈肌環切斷SHIVC。將肝臟完整切除后置于0～4℃的保存液中保存。
圖1
示供肝的灌注??圖 2示供肝門靜脈的游離??圖 3示供肝的套管(袖口)??圖 4示供肝與受體SHIVC的吻合??圖 5示受體肝下下腔靜脈套管??圖 6示受體完成OLT手術, 待關腹
Figure1.
Perfusion of donor liver??Figure 2 Anatomised the portal vein of the donor liver??Figure 3 The cuff of the donor liver??Figure 4 The vascular anastomosis of SHIVC??Figure 5 The cuff of the recipient hepatic inferior vena cava??Figure 6 Abdominal closure would been performed when recipient operation was done
1.2.4 修整供肝
在0～4℃乳酸林格液中修整供肝。以無損傷血管鉗夾住袖套柄，并用橡皮泥固定血管鉗。將肝下下腔靜脈及門靜脈外翻，將血管袖套分別套在肝下下腔靜脈及門靜脈上（圖 3）。以顯微血管夾夾住肝下下腔靜脈，以防供肝血流復流時血液流出。小心翻轉肝臟，在SHIVC左側及右側各用7-0血管吻合線由外向內縫扎標記，以待吻合。
1.2.5 受體手術
大鼠呈仰臥位固定，胸腹部剃毛，碘伏消毒，鋪巾，取腹部自劍突至恥骨上的、約6 cm長的正中切口。逆時針分離肝臟，游離肝下下腔靜脈至右腎靜脈水平，并穿過其后方預置自制細絲線1根，以備肝下下腔靜脈吻合用。分離右腎上腺靜脈與肝下下腔靜脈的交通支，并用自制細絲線結扎后切斷。剪開肝后韌帶，游離、切斷并結扎肝動脈。分離出膽總管并剪斷，將處理好的膽總管附于腸管上方備用。仔細分離、切斷并結扎左膈下靜脈及肝左葉與膈下食管段動靜脈的交通支，剪開SHIVC后方與膈肌的粘連。進入無肝期之前，通過增加乙醚濃度及接觸面積加深麻醉程度，進入無肝期前停止乙醚吸入，并記錄無肝期開始時間。夾閉肝下下腔靜脈及門靜脈，于門靜脈分叉處穿剌，注入常溫驅血液2 mL。用無損傷血管鉗將SHIVC連同3 mm膈肌一并鉗夾以阻斷SHIVC。剪斷門靜脈，移出受體肝臟后徹底止血。將供體肝臟按原位置入受體腹腔，行供體與受體SHIVC的吻合（圖 4）。吻合時用7-0的血管吻合線從左向右、先后壁再前壁、連續全層外翻縫合，針距與縫合寬度相等（2～3 mm），至左角處、最后1針前用沖洗液沖出氣泡，鎖邊縫合后從內向外于受體側穿出，與左角吊線和結扎線打結后結束SHIVC的吻合[5-6]。插入門靜脈袖套管，用自制的細絲線結扎固定，開放門靜脈血管夾，此時無肝期結束。開放供體肝下下腔靜脈血管夾后，迅速將供體的肝下下腔靜脈套管插入受體肝下下腔靜脈，用自制的細絲線結扎固定（圖 5）。固定供體的膽道支撐管，用生理鹽水沖洗，將受體膽總管套入膽道支撐管，用自制的細絲線結扎固定，用大網膜覆蓋于膽總管表面（圖 6）。最后用溫熱的生理鹽水沖洗腹腔，復位腸管，吸出滲液后關腹，術畢。
1.2.6 術后處理
術后大鼠給予單籠飼養觀察，用紅外線燈加熱復溫，用棉布保暖，2 h后自由進食水，同時給予抗生素預防感染（肌注青霉素2×105 U，術后僅1次）。術后24 h內每小時觀察大鼠情況1次，截止至術后24 h。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（
2 結果
2.1 術后大鼠死亡情況
由于本實驗關注的重點為術后24 h內的死因，故術中死亡和存活超過24 h的大鼠未納入死因分析。本實驗以改良Kamada二袖套法[3-5]制作大鼠OLT模型300只，其中術中死亡37只（術中死亡組），占12.33%；術后6 h內死亡51只（＜6 h組），占17.00%；術后6～24 h內死亡76只（6～24 h組），占25.33%；術后24 h時仍存活136只（＞24 h組），占45.34%。＜6 h組死亡大鼠的前3位死因分別為術中失血過多、術后失血及血管栓塞，分別占27.45%、27.45%及15.69%，6～24 h組死亡大鼠的前3位死因分別為血管狹窄、術后出血及肺水腫，分別占27.63%、21.05%及19.74%（表 1）。＜6 h組和6～24 h組的死亡原因構成比較差異有統計學意義（χ2=10.21，P < 0.05），表明2組大鼠的死因構成不同。
表1
24 h內大鼠的死亡原因〔例（%）〕
Table1.
Causes of death in rats who died during 24 hours after operation〔case(%)〕
2.2 4組大鼠手術各階段所用時間比較
4組大鼠的供體手術時間、熱缺血時間及無肝期至手術結束時間的差異均無統計學意義（P > 0.05），但4組大鼠的冷缺血時間和無肝期均不同或不全相同（P < 0.05）。在冷缺血時間方面，術中死亡組長于＜6 h組、6～24 h組和＞24 h組（P < 0.05），且＜6 h組和6～24 h組均長于＞24 h組（P < 0.05），但＜6 h組和6～24 h組的差異無統計學意義（P > 0.05）；在無肝期方面，術中死亡組的無肝期長于＜6 h組、6～24 h組和＞24 h組（P < 0.05），但后3組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見表 2。提示縮短冷缺血時間及無肝期能夠減少動物的早期死亡。
表2
4組大鼠手術各階段所用時間比較（min，3 討論
生存時間長于24 h是大鼠OLT模型成功的重要指標[6-8]，所以對OLT術后24 h內死因的研究是十分必要的。現關于OLT術后動物存活時間短于24 h的原因研究得較少，一般認為，術中失血過多或術后出血是其主要的死因。大多研究[9-12]并未將24 h內死亡的情況進行細分，而是進行籠統分析，導致我們在術后早期除了關注出血外沒有對其他因素加以關注。本實驗結果表明，除了出血原因以外，還存在血管栓塞、血管狹窄、肺水腫、麻醉過深等其他原因。同時還發現，手術中存在嚴重失誤操作的大鼠就算能度過手術，也極少能存活超過6 h，考慮原因為大鼠存在嚴重的不能糾正的血流動力學紊亂，導致心肺功能衰竭而死亡；而大鼠存活超過6 h后，理論上，動物的血流動力學變化趨于平穩，麻醉的影響已經完全消除。因此，6～24 h內死亡的大鼠不能單純用術中失血過多或術后出血解釋，故本實驗將24 h內死亡的動物細分為＜6 h及6～24 h兩組，這有助于深入了解大鼠死亡的真正原因。
3.1 大鼠早期死亡的原因分析及對策
本實驗結果顯示，大鼠早期死亡的原因主要有：術中失血過多、術后出血、血管栓塞、血管狹窄、肺水腫及麻醉過深。其中，造成大鼠于6 h內死亡的原因主要有術中出血過多、術后出血及血管栓塞，其中出血是其關鍵死因，同以往研究[9]結論相符。造成大鼠于6～24 h內死亡的主要原因為血管狹窄、術后出血及肺水腫，出血不是其首要死因。6～24 h組大鼠的死因中，血管栓塞、血管狹窄及肺水腫這3個因素是既往文獻[9-12]未加以重視的問題。上述因素必須在訓練中予以足夠重視。現就血管栓塞、血管狹窄、肺水腫及出血的原因及改進策略分述如下。
3.1.1 血管栓塞
血管栓塞為＜6 h組大鼠的第3位死因，為6～24 h組的第4位死因，因此不可小視。術后血管栓塞常見有2種形式。一為SHIVC、肝下下腔靜脈或門靜脈血栓形成，這種大血管栓塞將嚴重影響循環系統的功能，能迅速導致動物死亡。這種血管栓塞多是由于血流動力學紊亂致血流太慢，最終導致形成血管栓塞，大鼠發生該類血管栓塞時存活時間往往不會超過6 h [13-14]。第二種形式是肝內大面積微血管血栓形成，此時僅少量血液通過肝臟回流入心臟，持續加重后會造成動物死亡。造成肝內微血管血栓的原因可能有很多，如在翻動肝臟時的擠壓對肝臟的機械性損傷、缺血再灌注損傷、休克及酸中毒[15-16]。因此，在后續的實驗中，我們可做以下改進：①灌注徹底，供肝游離時動作輕柔，操作順序以顯露肝下下腔靜脈為起點、逆時針進行，最大限度地減少肝臟的翻動。②在無肝期開始之前驅除肝臟殘血，同時給予碳酸氫鈉以堿化血液。③無肝期中、行門靜脈插管前經門靜脈套管注入常溫生理鹽水約1～2 mL后，再開放肝下下腔靜脈套管上方的阻斷夾以排出供肝內的冷灌注液；稍開放受體門靜脈的血管夾以排出門靜脈內的高凝血液及血凝塊；再用肝素生理鹽水沖洗門靜脈管腔，迅速插入門靜脈袖套管。④根據手術失血或失液情況，可經供體肝下下腔靜脈緩慢補入常溫的生理鹽水或等滲的碳酸氫鈉溶液以糾酸，三管吻合之后立即給予37℃溫熱生理鹽水以促進復溫。
3.1.2 血管狹窄
＜6 h組中因血管狹窄而死亡的大鼠占5.88%，所占比例較低；而6～24 h組中血管狹窄為大鼠死亡的第1位死因，必須加以重視。血管狹窄包括吻合血管或結扎插管血管的狹窄。血管的扭轉是造成血管狹窄的重要原因。吻合血管狹窄多因縫合邊距過大，收線后造成吻合口收縮，吻合口縮小，影響血液回流入心臟，致外周血液淤積，最終造成心功能衰竭[17]。在以后的實驗中我們應注意上述問題。注意對位和防止扭轉是避免血管狹窄的前提條件。在訓練時應用更細的無損傷縫線來進行精確地對合吻合，并縮小邊距，適當縮短針距，同時應注意牽線張力適度；吻合后應繃直吻合口使縫線更緊，以防止吻合血管狹窄。
3.1.3 肺水腫
肝移植手術的創傷較大，并且圍手術期的病理和生理變化復雜，如手術引起的失血、門靜脈和下腔靜脈阻斷引起的回心血量驟減導致的缺血及缺血再灌注損傷，均會導致全身多個臟器受到影響，其中肺被認為是最早和最易受累的器官[18]。據報道[19-20]，OLT術后肺水腫的發生率為34.2％～77.8％，發展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）者占7.8％～23.6％，發展為ARDS后患者的死亡率高達76.5％。本實驗結果顯示，＜6 h組大鼠因肺水腫而死亡者占7.84%，而6～24 h組大鼠因肺水腫而死亡者占19.74%，因此應對肺水腫加以重視。因肺水腫死亡的大鼠存在肺部腫脹，切開肺實質可見紅色的泡沫液流出。雖然上述病理生理變化不可避免，但可采取以下措施以盡量改善無肝期造成的血流動力學紊亂：①在無肝期開始時給予門靜脈推注2～4 mL含有肝素及碳酸氫鈉的生理鹽水以進行驅血，同時其可減少肝臟切除時的失血、補充血容量及中和酸中毒；②為避免前負荷迅速上升對肺造成損傷，在開放SHIVC時不立即完全解除阻斷，而是緩慢開放上腔靜脈后，夾閉SHIVC數秒后再完全開放上腔靜脈血流。
3.1.4 術中失血過多及術后出血
＜6 h組大鼠的死因中，術中失血過多及術后出血并列居于首位，均占27.45%；而6～24 h組因術中出血過多而死亡者占3.95%，因術后出血而死亡者占21.05%，術中失血過多所占比例降低。存活＜6 h大鼠的術后出血主要為SHIVC、門靜脈和肝下下腔靜脈出血。由于出血迅速，大鼠多在6 h內死亡[21]。本實驗6～24 h組死亡大鼠的術后出血主要表現為2種情況：一為腎上腺靜脈及肝下下腔靜脈后方的靜脈叢出血，二為SHIVC吻合口后壁滲血。大鼠術后能夠存活數小時則說明出血量少，但若上述情況無法改善，最終也會導致大鼠死亡。這說明術中徹底止血仍是非常重要的，尤其是在供體實驗時，由于供體已處于灌注狀態，若手法粗暴，則造成的上述血管的損傷或出血難以發現[22]。
3.2 冷缺血時間和無肝期對術后生存期的影響
國外[23]及國內[24]均有文獻報道，縮短無肝期及熱缺血時間是術后存活的關鍵因素，如果無肝期超過30 min，則術后存活的概率很低。本實驗結果顯示，術中死亡組大鼠的無肝期長于其余3組（P < 0.05），提示無肝期是影響術后生存時間的重要因素，縮短無肝期是手術成功的必要條件；但實驗同時也發現，＜6 h組、6～24 h組和＞24 h組的無肝期比較差異無統計學意義（P > 0.05），提示控制無肝期并不是手術成功的充分條件，在控制無肝期的同時我們還必須提高吻合、插管等步驟的質量。縮短無肝期要求簡化一切不必要的操作，提高關鍵環節的質量。吻合與插管是無肝期的關鍵操作，在無肝期前做好吻合與插管的準備是很重要的。
本實驗結果還顯示，冷缺血時間與大鼠的存活時間有關，＞24 h組的冷缺血時間明顯短于其余3組，提示縮短冷缺血時間有助于大鼠的長期存活。筆者認為，其原因有以下2個方面。其一，冷缺血時間包括了無肝期，無肝期縮短使冷缺血時間同時縮短。其二，冷缺血期移植肝在保存液中有不同程度的肝細胞損傷，出現細胞水腫或壞死，且這種損傷是時間依賴性的[25]；同時，長時間的低溫、缺氧及酸中毒也導致了移植肝內的微血管內皮損傷，在血管再通后造成微血栓而導致肝細胞不可逆轉的損傷[26]。因此，筆者提出了相應的改進策略：通過反復操作縮短供體手術時間；同時在供肝的灌注開始后，由另一組人員開始受體肝臟的分離與切除，在多次實驗的基礎上，確認兩邊實驗銜接的時間，確保在無肝期開始前完成供肝的切除及修肝，從而縮短冷缺血時間。
筆者在后期實驗中將實驗操作按上述策略針對性地加以改進，取得了良好的效果，但由于篇幅所限，將予以后續報道。總之，穩定的大鼠肝移植模型的建立并不是一個簡單的照本宣科的過程，需要我們對失敗經歷進行總結，并不斷完善，才能盡快地提高手術技巧，獲得成功。最后希望本實驗的經驗和改進策略能夠為同行提供參考。
