本文為研究 Snail1 基因對喉鱗癌細胞株 Hep-2 緊密連接蛋白表達及遷移能力的影響，將含有 Snail1 基因的短發夾 RNA（Sh-RNA）的質粒轉染喉鱗癌細胞株 Hep-2，培養出可穩定傳代的 Snail1 基因沉默的細胞（命名為 Sh-snail1 細胞）。課題組以蛋白免疫印跡技術檢測緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表達是否發生變化。然后設計傷口愈合實驗檢測其遷移能力，再以蛋白免疫印跡技術檢測與細胞遷移能力密切相關的 RhoGTP 酶家族重要成員 RhoA、Cdc42 蛋白的表達變化。結果表明，Sh-snail1 細胞緊密連接關鍵蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達明顯上調，遷移能力明顯減弱，且 RhoA、Cdc42 蛋白表達下調。該研究表明，喉鱗癌 Hep-2 細胞通過下調 Snail1 基因的表達使細胞間連接更加緊密，同時抑制 Hep-2 細胞的遷移能力，下調 RhoA、Cdc42 蛋白的表達。本文研究結果證實，Snail1 基因與 Hep-2 細胞轉移過程中的細胞間緊密連接打開以及細胞遷移能力增強密切相關，為靶向治療喉鱗癌提供分子機制的研究依據。
引用本文： 劉雙鳳, 沈陽, 馮唐, 劉肖珩. Snail1 基因沉默對喉鱗癌 Hep-2 細胞緊密連接蛋白表達及遷移能力的影響 . 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(4): 591-596. doi: 10.7507/1001-5515.201702005 復制
引言
喉部鱗狀細胞癌（簡稱：喉鱗癌）是喉頸部最常見的惡性腫瘤，其發病率逐年上升。隨著醫療技術的發展，喉鱗癌的預后有所改善，但是 5 年生存率仍僅有 60% 左右[1]。喉鱗癌是否發生轉移是決定預后的重要指標[2]。由于癌細胞轉移的機制非常復雜，但其細胞間連接打開及細胞遷移速度加快是轉移的必要步驟，有效阻斷該過程對腫瘤的治療非常必要。
研究表明，轉錄因子 Snail1 在包括喉鱗癌在內的多種惡性腫瘤組織中高表達[3]，癌細胞中高表達的轉錄因子 Snail1 可以促進癌細胞遷移[4-5]，但目前國內在 Snail1 基因對細胞間連接的影響及其遷移機制方面的研究較少。另一方面，緊密連接是細胞間連接的重要組成部分，主要由閉鎖小帶（Zonula occludens-1，ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）和閉合蛋白（Claudin）組成，它們避免了細胞表面的頂端和底端膜蛋白的紊亂，作為柵欄或屏障維持上皮細胞的極性[6]。文獻報道，RhoGTP 酶超家族是肌動蛋白細胞骨架的重要調節因子，與細胞運動密切相關，至少由 14 個亞族組成，其中 RhoA 和 Cdc42 是 RhoGTP 酶的核心成員[7]。RhoA 和 Cdc42 可直接觸發并參與肌動蛋白組裝形成細胞的應力纖維和絲狀偽足，并可進一步通過調節細胞骨架蛋白、膜運動和細胞黏附促使細胞運動[8]。
RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術，是將與目的基因 mRNA 關鍵位點序列一致的小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）或短發卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）導入細胞內，引起目的基因 mRNA 降解，從而促使基因沉默，相應蛋白表達下調。shRNA 是一段具有緊密發卡環的 RNA 序列，通過質粒等載體導入細胞內后可被傳遞到子代細胞中，在細胞內持續生成 siRNA，使目的基因持續沉默。為進一步研究阻斷 Snail1 基因對喉鱗癌細胞的細胞間連接及癌細胞遷移的影響，我們將裝載有 Snail1 基因 shRNA 的質粒轉入喉鱗癌細胞株 Hep-2 細胞中，篩選并培養出可穩定傳代的 Snail1 基因表達下調的 Hep-2 細胞，命名為 Sh-snail 細胞，觀察其對喉鱗癌細胞間緊密連接主要成分 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表達的影響，以及對喉鱗癌細胞遷移能力、遷移相關蛋白 RhoA 和 Cdc42 蛋白表達的調控作用，進一步為喉鱗癌患者靶向治療提供分子機制的研究依據。
1 材料與方法
1.1 細胞株來源
人喉鱗癌細胞株 Hep-2 購自中國科學院細胞庫（目錄號：TCHu21）。
1.2 儀器與試劑
裝載有 Snail 基因 shRNA 的質粒由美國 Genecoperia 公司構建，質粒轉染試劑盒、RNA 提取試劑盒、定量反轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購買于德國 QIAGEN 公司；Snail1 抗體、ZO-1 抗體、Occludin 抗體、Claudin-5 抗體、Cdc42 抗體、RhoA 抗體均購自美國 Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京鼎國生物科技有限公司；Western blot 及細胞培養常規試劑均購自上海碧云天生物科技有限公司；CK2 型倒置相差顯微鏡購自日本 Olympus 公司；TE2000 型熒光顯微鏡購自日本 Nikon 公司；酶標儀、蛋白垂直電泳儀、凝膠成像系統購自美國 Bio-Rad 公司。
1.3 研究方法
1.3.1 實驗分組 本課題組取對數生長期的 Hep-2 細胞為對照組；同時，為排除質粒自身對 Hep-2 細胞各指標的影響，我們將空載質粒轉染入 Hep-2 細胞，設立并命名為 Sh-mock 細胞組；將裝載有 Snail1 基因 shRNA 的質粒轉入喉鱗癌細胞株 Hep-2 細胞中，篩選并培養出可穩定傳代的 Snail1 基因表達下調的 Hep-2 細胞，命名為 Sh-snail1 細胞，作為實驗組。
1.3.2 培養穩定轉染的 Sh-snail1 細胞及 Sh-mock 細胞 將對數生長期的 Hep-2 細胞種于 6 孔板中，高糖杜氏改良培養基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（含 10% 胎牛血清）培養細胞長至 80% 融合度時（37℃，5%CO2），加入裝載有 Snail1 基因 shRNA 的質粒（靶序列為 GAGTAAT GGCTGTCACTTG）或空載質粒（靶序列為 GCTT CGCGCCGTAGTCTTA）、質粒轉染試劑（QIAGEN 公司的一種非脂質體高效脂類轉染試劑）、培養液混合液等。轉染 24 h 后，加入含 0.4 μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 高糖培養基，于 37℃，5%CO2 條件下培養，至穩定轉染的細胞簇形成。胰蛋白酶消化并收集 Sh-snail1 細胞及 Sh-mock 細胞，移入培養瓶中，再以 0.2 μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 高糖培養基培養至 2 種細胞各自生長融合達 100%，備用。
1.3.3 熒光定量 PCR 定量檢測 Snail1 mRNA 表達水平 分別對 Hep-2 細胞（對照組）、Sh-mock 細胞、Sh-snail1 細胞進行總 RNA 提取，根據說明書將 RNA 逆轉錄合成 cDNA。采用 SYBR Green 熒光染料法，取 2 μL 反轉錄產物擴增合成 Snail mRNA 基因片段。引物參照文獻[9]設計，委托四川甲骨基因科技有限公司合成。GAPDH 為內參，所用引物序列分別為：Snail1 上游引物：5’-TATGCTGCCT TCCCAGGCTTG-3’；Snail1 下游引物：5’-ATGTGCATCTTGAGGGCACCC-3’。GAPDH 上游引物：5’-GGCGTTTTGCAATGCAGATGTAG-3’；GAPDH 下游引物：5’-CACAGGAGCCG TCACTTCTCTTG-3’。PCR 條件：95.0℃ 變性 3 min，再按下列熱循環參數：95.0℃ 下 10 s，57.0℃ 下 30 s、72.0℃ 下 30 s，共 40 個循環。從熒光定量 PCR 動力學曲線中判讀熒光閾值循環數（cycle threshod，Ct）值，計算??Ct，??Ct=[未知樣品 Ct 值–GAPDH 的 Ct 值]–[校正樣品 Ct 值–校正樣品 GAPDH 的 Ct 值]，根據 2–??Ct 計算相對表達量，每組重復三次，利用數據分析作圖軟件 Origin8.0 計算出均值及標準差，并匯出柱狀圖。
1.3.4 Western blot 檢測蛋白表達水平 Hep-2 細胞、Sh-mock 細胞、Sh-snail1 細胞于細胞培養瓶中培養至細胞融合度達 100%，加入細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑），裂解后用細胞刮子刮取細胞，震蕩后離心取上清，采用 2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。蛋白每孔上樣 50 μg 后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳結束后取膠，并將膠上的蛋白濕轉至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。分別于膜上孵育一抗，4℃ 過夜；然后以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后孵育二抗，室溫下處理 1 h；漂洗后，滴加電化學發光曝光液，凝膠成像系統中曝光，再采用圖像處理軟件 Image J 進行灰度分析，將目的條帶與內參的比值作為半定量指標，用 Origin8.0 分析數據并匯出柱狀圖。
1.3.5 傷口愈合實驗 將 Hep-2 細胞、Sh-mock 細胞、Sh-snail1 細胞種于 6 孔板中，當細胞融合度達 90% 時，用無血清 DMEM 培養基培養過夜，用 100 μL 的槍頭在單層細胞上做“十”字形劃痕。PBS 清洗 3 次。分別于 0 h、24 h，在倒置顯微鏡下拍照。
1.3.6 統計學處理 上述實驗采用 SPSS17.0 軟件進行單因素方差分析或 t 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 穩定轉染的 Hep-2 細胞 Snail1 mRNA 及 Snail1 蛋白表達情況
2.1.1 熒光定量 PCR 驗證 Sh-snail1 細胞 Snail1 基因的 mRNA 表達情況 熒光定量 PCR 檢測對照組細胞、Sh-mock 細胞及 Sh-snail1 細胞 Snail1 基因的 mRNA 表達情況。結果證實，Sh-snail1 細胞 Snail1 mRNA 水平明顯低于對照組，干擾后 Snail1 mRNA 下調（P<0.05）。而 Sh-mock 細胞組與對照組相比，Snail1 mRNA 的表達量差異沒有統計學意義（P>0.05），如圖 1 所示。
圖1
PCR 檢測 Snail1 基因沉默效率（n=3）
*
*
2.1.2 Western blot 驗證 Sh-snail1 細胞 Snail1 蛋白表達情況 Western blot 檢測對照組、Sh-mock 組及 Sh-snail1 細胞 Snail1 蛋白表達情況。如圖 2 所示，Sh-snail1 細胞的 Snail1 蛋白水平明顯低于對照組，說明 Sh-snail1 細胞的 Snail1 基因表達被成功干擾，與對照組相比，Snail1 蛋白表達下降的差異存在統計學意義（P<0.05）。而 Sh-mock 組與對照組的 Snail1 蛋白表達水平的差異沒有統計學意義（P>0.05）。
圖2
Western blot 檢測 Snail1 基因沉默效率（n=3）
*
*
2.2 Snail1 基因沉默對 Hep-2 細胞緊密連接相關蛋白的影響
本文采用 Western blot 技術檢測 Snail1 基因沉默對 3 組細胞的 ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白表達的影響。如圖 3 所示，Sh-snail1 細胞的 ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白表達水平均明顯高于對照組（P<0.05）。而 Sh-mock 組與對照組相比，ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白水平差異沒有統計學意義（P>0.05）。
圖3
Snail1 基因沉默后緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達變化（n=3）
*
*
2.3 Snail1 基因沉默對 Hep-2 細胞遷移能力的影響
本文的傷口愈合實驗是為了研究 Snail1 基因沉默后 Sh-snail1 細胞的遷移能力。我們分別將對照組、Sh-mock 細胞、Sh-snail1 細胞做標準化劃痕處理，24 h 后倒置顯微鏡下觀察細胞遷移距離。如圖 4 所示，Sh-snail1 細胞 24 h 遷移距離明顯小于對照組（P<0.05），證實 Sh-snail1 細胞遷能力明顯減弱。Sh-mock 細胞 24 h 遷移距離與對照組的差異無統計學意義（P>0.05）。
圖4
Snail1 基因沉默對 Hep-2 細胞遷移能力的影響（n=3）
*
*
2.4 Snail1 基因沉默對 Hep-2 細胞遷移相關蛋白 RhoA 和 Cdc42 表達的影響
RhoGTP 酶在細胞遷移中發揮重要作用，RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白是其重要組成成分。本文以 Western blot 技術檢測 RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白在 3 組細胞中的表達，發現 Snail1 基因沉默后，Sh-snail1 細胞的 RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白水平明顯下調，低于對照組（P<0.05）。而 Sh-mock 組與對照組相比，RhoA 和 Cdc42 蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05），如圖 5 所示。
圖5
Snail1 基因沉默后 RhoA 和 Cdc42 的表達變化（n=3）
*
*
3 討論
Occludins、Claudins 和連接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs），3 種蛋白形成緊密連接的頂端和底端區域。ZO-1 在緊密連接中起中樞作用，調控緊密連接的組裝。各種緊密連接蛋白的穩定表達避免了細胞表面的頂端和底端膜蛋白的紊亂，它們作為柵欄或屏障維持上皮細胞的極性[10]。在本研究中，Snail1 基因的沉默上調了 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達，使 Hep-2 細胞間連接變得更加緊密，有利于維持細胞形態及極性不變。
RhoGTP 酶超家族在細胞運動中起著非常重要的作用。它們可參與調節肌動蛋白動力和控制肌動蛋白重組，其中 RhoA 可促進肌動蛋白應力纖維的形成，Cdc42 則主要促進絲狀偽足的形成[11]。另外，Cdc42 可直接激活 p21 激活激酶 1（p21 activated kinase，PAK1）參與細胞運動[12]。我們在實驗中發現 Sh-snail1 細胞的 RhoA 和 Cdc42 表達減弱，說明阻斷 Snail1 基因表達可下調 RhoA 和 Cdc42，這極有可能是 Snail1 基因沉默導致細胞遷移能力減弱的重要原因。
Snail 家族成員作為鋅指轉錄因子參與胚胎發育等多種機體發育過程，其家族成員 Snail1 蛋白在哺乳動物的發育早期非常重要[13]，大量研究證實轉錄因子 Snail1 通過下調 E-cad 蛋白，促發癌細胞由上皮樣細胞轉化為間充質樣細胞（epithelial-mesenchymal transition，EMT），從而促進腫瘤細胞轉移[14]。可是對于 Snail1 蛋白與緊密連接蛋白和 RhoGTP 酶超家族之間的關系研究較少。由于細胞緊密間連接的打開和細胞遷移速度的加快是細胞遷移的必要因素，我們的研究初步闡明了抑制 Snail1 基因的表達可以上調緊密連接關鍵蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表達水平；同時可以下調 RhoA 和 Cdc42 并抑制 Hep-2 細胞的遷移，從而減弱癌細胞的轉移能力。因此，本文研究結果證實 Snail1 基因與 Hep-2 細胞轉移過程中的細胞間緊密連接打開、細胞遷移能力增強密切相關，為進一步證實 Snail1 基因作為預防腫瘤發展轉移的重要靶點提供分子機制的研究依據。
引言
喉部鱗狀細胞癌（簡稱：喉鱗癌）是喉頸部最常見的惡性腫瘤，其發病率逐年上升。隨著醫療技術的發展，喉鱗癌的預后有所改善，但是 5 年生存率仍僅有 60% 左右[1]。喉鱗癌是否發生轉移是決定預后的重要指標[2]。由于癌細胞轉移的機制非常復雜，但其細胞間連接打開及細胞遷移速度加快是轉移的必要步驟，有效阻斷該過程對腫瘤的治療非常必要。
研究表明，轉錄因子 Snail1 在包括喉鱗癌在內的多種惡性腫瘤組織中高表達[3]，癌細胞中高表達的轉錄因子 Snail1 可以促進癌細胞遷移[4-5]，但目前國內在 Snail1 基因對細胞間連接的影響及其遷移機制方面的研究較少。另一方面，緊密連接是細胞間連接的重要組成部分，主要由閉鎖小帶（Zonula occludens-1，ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）和閉合蛋白（Claudin）組成，它們避免了細胞表面的頂端和底端膜蛋白的紊亂，作為柵欄或屏障維持上皮細胞的極性[6]。文獻報道，RhoGTP 酶超家族是肌動蛋白細胞骨架的重要調節因子，與細胞運動密切相關，至少由 14 個亞族組成，其中 RhoA 和 Cdc42 是 RhoGTP 酶的核心成員[7]。RhoA 和 Cdc42 可直接觸發并參與肌動蛋白組裝形成細胞的應力纖維和絲狀偽足，并可進一步通過調節細胞骨架蛋白、膜運動和細胞黏附促使細胞運動[8]。
RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術，是將與目的基因 mRNA 關鍵位點序列一致的小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）或短發卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）導入細胞內，引起目的基因 mRNA 降解，從而促使基因沉默，相應蛋白表達下調。shRNA 是一段具有緊密發卡環的 RNA 序列，通過質粒等載體導入細胞內后可被傳遞到子代細胞中，在細胞內持續生成 siRNA，使目的基因持續沉默。為進一步研究阻斷 Snail1 基因對喉鱗癌細胞的細胞間連接及癌細胞遷移的影響，我們將裝載有 Snail1 基因 shRNA 的質粒轉入喉鱗癌細胞株 Hep-2 細胞中，篩選并培養出可穩定傳代的 Snail1 基因表達下調的 Hep-2 細胞，命名為 Sh-snail 細胞，觀察其對喉鱗癌細胞間緊密連接主要成分 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表達的影響，以及對喉鱗癌細胞遷移能力、遷移相關蛋白 RhoA 和 Cdc42 蛋白表達的調控作用，進一步為喉鱗癌患者靶向治療提供分子機制的研究依據。
1 材料與方法
1.1 細胞株來源
人喉鱗癌細胞株 Hep-2 購自中國科學院細胞庫（目錄號：TCHu21）。
1.2 儀器與試劑
裝載有 Snail 基因 shRNA 的質粒由美國 Genecoperia 公司構建，質粒轉染試劑盒、RNA 提取試劑盒、定量反轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購買于德國 QIAGEN 公司；Snail1 抗體、ZO-1 抗體、Occludin 抗體、Claudin-5 抗體、Cdc42 抗體、RhoA 抗體均購自美國 Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京鼎國生物科技有限公司；Western blot 及細胞培養常規試劑均購自上海碧云天生物科技有限公司；CK2 型倒置相差顯微鏡購自日本 Olympus 公司；TE2000 型熒光顯微鏡購自日本 Nikon 公司；酶標儀、蛋白垂直電泳儀、凝膠成像系統購自美國 Bio-Rad 公司。
1.3 研究方法
1.3.1 實驗分組 本課題組取對數生長期的 Hep-2 細胞為對照組；同時，為排除質粒自身對 Hep-2 細胞各指標的影響，我們將空載質粒轉染入 Hep-2 細胞，設立并命名為 Sh-mock 細胞組；將裝載有 Snail1 基因 shRNA 的質粒轉入喉鱗癌細胞株 Hep-2 細胞中，篩選并培養出可穩定傳代的 Snail1 基因表達下調的 Hep-2 細胞，命名為 Sh-snail1 細胞，作為實驗組。
1.3.2 培養穩定轉染的 Sh-snail1 細胞及 Sh-mock 細胞 將對數生長期的 Hep-2 細胞種于 6 孔板中，高糖杜氏改良培養基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（含 10% 胎牛血清）培養細胞長至 80% 融合度時（37℃，5%CO2），加入裝載有 Snail1 基因 shRNA 的質粒（靶序列為 GAGTAAT GGCTGTCACTTG）或空載質粒（靶序列為 GCTT CGCGCCGTAGTCTTA）、質粒轉染試劑（QIAGEN 公司的一種非脂質體高效脂類轉染試劑）、培養液混合液等。轉染 24 h 后，加入含 0.4 μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 高糖培養基，于 37℃，5%CO2 條件下培養，至穩定轉染的細胞簇形成。胰蛋白酶消化并收集 Sh-snail1 細胞及 Sh-mock 細胞，移入培養瓶中，再以 0.2 μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 高糖培養基培養至 2 種細胞各自生長融合達 100%，備用。
1.3.3 熒光定量 PCR 定量檢測 Snail1 mRNA 表達水平 分別對 Hep-2 細胞（對照組）、Sh-mock 細胞、Sh-snail1 細胞進行總 RNA 提取，根據說明書將 RNA 逆轉錄合成 cDNA。采用 SYBR Green 熒光染料法，取 2 μL 反轉錄產物擴增合成 Snail mRNA 基因片段。引物參照文獻[9]設計，委托四川甲骨基因科技有限公司合成。GAPDH 為內參，所用引物序列分別為：Snail1 上游引物：5’-TATGCTGCCT TCCCAGGCTTG-3’；Snail1 下游引物：5’-ATGTGCATCTTGAGGGCACCC-3’。GAPDH 上游引物：5’-GGCGTTTTGCAATGCAGATGTAG-3’；GAPDH 下游引物：5’-CACAGGAGCCG TCACTTCTCTTG-3’。PCR 條件：95.0℃ 變性 3 min，再按下列熱循環參數：95.0℃ 下 10 s，57.0℃ 下 30 s、72.0℃ 下 30 s，共 40 個循環。從熒光定量 PCR 動力學曲線中判讀熒光閾值循環數（cycle threshod，Ct）值，計算??Ct，??Ct=[未知樣品 Ct 值–GAPDH 的 Ct 值]–[校正樣品 Ct 值–校正樣品 GAPDH 的 Ct 值]，根據 2–??Ct 計算相對表達量，每組重復三次，利用數據分析作圖軟件 Origin8.0 計算出均值及標準差，并匯出柱狀圖。
1.3.4 Western blot 檢測蛋白表達水平 Hep-2 細胞、Sh-mock 細胞、Sh-snail1 細胞于細胞培養瓶中培養至細胞融合度達 100%，加入細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑），裂解后用細胞刮子刮取細胞，震蕩后離心取上清，采用 2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。蛋白每孔上樣 50 μg 后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳結束后取膠，并將膠上的蛋白濕轉至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。分別于膜上孵育一抗，4℃ 過夜；然后以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后孵育二抗，室溫下處理 1 h；漂洗后，滴加電化學發光曝光液，凝膠成像系統中曝光，再采用圖像處理軟件 Image J 進行灰度分析，將目的條帶與內參的比值作為半定量指標，用 Origin8.0 分析數據并匯出柱狀圖。
1.3.5 傷口愈合實驗 將 Hep-2 細胞、Sh-mock 細胞、Sh-snail1 細胞種于 6 孔板中，當細胞融合度達 90% 時，用無血清 DMEM 培養基培養過夜，用 100 μL 的槍頭在單層細胞上做“十”字形劃痕。PBS 清洗 3 次。分別于 0 h、24 h，在倒置顯微鏡下拍照。
1.3.6 統計學處理 上述實驗采用 SPSS17.0 軟件進行單因素方差分析或 t 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 穩定轉染的 Hep-2 細胞 Snail1 mRNA 及 Snail1 蛋白表達情況
2.1.1 熒光定量 PCR 驗證 Sh-snail1 細胞 Snail1 基因的 mRNA 表達情況 熒光定量 PCR 檢測對照組細胞、Sh-mock 細胞及 Sh-snail1 細胞 Snail1 基因的 mRNA 表達情況。結果證實，Sh-snail1 細胞 Snail1 mRNA 水平明顯低于對照組，干擾后 Snail1 mRNA 下調（P<0.05）。而 Sh-mock 細胞組與對照組相比，Snail1 mRNA 的表達量差異沒有統計學意義（P>0.05），如圖 1 所示。
圖1
PCR 檢測 Snail1 基因沉默效率（n=3）
*
*
2.1.2 Western blot 驗證 Sh-snail1 細胞 Snail1 蛋白表達情況 Western blot 檢測對照組、Sh-mock 組及 Sh-snail1 細胞 Snail1 蛋白表達情況。如圖 2 所示，Sh-snail1 細胞的 Snail1 蛋白水平明顯低于對照組，說明 Sh-snail1 細胞的 Snail1 基因表達被成功干擾，與對照組相比，Snail1 蛋白表達下降的差異存在統計學意義（P<0.05）。而 Sh-mock 組與對照組的 Snail1 蛋白表達水平的差異沒有統計學意義（P>0.05）。
圖2
Western blot 檢測 Snail1 基因沉默效率（n=3）
*
*
2.2 Snail1 基因沉默對 Hep-2 細胞緊密連接相關蛋白的影響
本文采用 Western blot 技術檢測 Snail1 基因沉默對 3 組細胞的 ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白表達的影響。如圖 3 所示，Sh-snail1 細胞的 ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白表達水平均明顯高于對照組（P<0.05）。而 Sh-mock 組與對照組相比，ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白水平差異沒有統計學意義（P>0.05）。
圖3
Snail1 基因沉默后緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達變化（n=3）
*
*
2.3 Snail1 基因沉默對 Hep-2 細胞遷移能力的影響
本文的傷口愈合實驗是為了研究 Snail1 基因沉默后 Sh-snail1 細胞的遷移能力。我們分別將對照組、Sh-mock 細胞、Sh-snail1 細胞做標準化劃痕處理，24 h 后倒置顯微鏡下觀察細胞遷移距離。如圖 4 所示，Sh-snail1 細胞 24 h 遷移距離明顯小于對照組（P<0.05），證實 Sh-snail1 細胞遷能力明顯減弱。Sh-mock 細胞 24 h 遷移距離與對照組的差異無統計學意義（P>0.05）。
圖4
Snail1 基因沉默對 Hep-2 細胞遷移能力的影響（n=3）
*
*
2.4 Snail1 基因沉默對 Hep-2 細胞遷移相關蛋白 RhoA 和 Cdc42 表達的影響
RhoGTP 酶在細胞遷移中發揮重要作用，RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白是其重要組成成分。本文以 Western blot 技術檢測 RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白在 3 組細胞中的表達，發現 Snail1 基因沉默后，Sh-snail1 細胞的 RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白水平明顯下調，低于對照組（P<0.05）。而 Sh-mock 組與對照組相比，RhoA 和 Cdc42 蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05），如圖 5 所示。
圖5
Snail1 基因沉默后 RhoA 和 Cdc42 的表達變化（n=3）
*
*
3 討論
Occludins、Claudins 和連接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs），3 種蛋白形成緊密連接的頂端和底端區域。ZO-1 在緊密連接中起中樞作用，調控緊密連接的組裝。各種緊密連接蛋白的穩定表達避免了細胞表面的頂端和底端膜蛋白的紊亂，它們作為柵欄或屏障維持上皮細胞的極性[10]。在本研究中，Snail1 基因的沉默上調了 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達，使 Hep-2 細胞間連接變得更加緊密，有利于維持細胞形態及極性不變。
RhoGTP 酶超家族在細胞運動中起著非常重要的作用。它們可參與調節肌動蛋白動力和控制肌動蛋白重組，其中 RhoA 可促進肌動蛋白應力纖維的形成，Cdc42 則主要促進絲狀偽足的形成[11]。另外，Cdc42 可直接激活 p21 激活激酶 1（p21 activated kinase，PAK1）參與細胞運動[12]。我們在實驗中發現 Sh-snail1 細胞的 RhoA 和 Cdc42 表達減弱，說明阻斷 Snail1 基因表達可下調 RhoA 和 Cdc42，這極有可能是 Snail1 基因沉默導致細胞遷移能力減弱的重要原因。
Snail 家族成員作為鋅指轉錄因子參與胚胎發育等多種機體發育過程，其家族成員 Snail1 蛋白在哺乳動物的發育早期非常重要[13]，大量研究證實轉錄因子 Snail1 通過下調 E-cad 蛋白，促發癌細胞由上皮樣細胞轉化為間充質樣細胞（epithelial-mesenchymal transition，EMT），從而促進腫瘤細胞轉移[14]。可是對于 Snail1 蛋白與緊密連接蛋白和 RhoGTP 酶超家族之間的關系研究較少。由于細胞緊密間連接的打開和細胞遷移速度的加快是細胞遷移的必要因素，我們的研究初步闡明了抑制 Snail1 基因的表達可以上調緊密連接關鍵蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表達水平；同時可以下調 RhoA 和 Cdc42 并抑制 Hep-2 細胞的遷移，從而減弱癌細胞的轉移能力。因此，本文研究結果證實 Snail1 基因與 Hep-2 細胞轉移過程中的細胞間緊密連接打開、細胞遷移能力增強密切相關，為進一步證實 Snail1 基因作為預防腫瘤發展轉移的重要靶點提供分子機制的研究依據。
