引用本文： 王寧, 陳俊毅, 陳西淼, 朱倫井, 段江濤, 王燁, 貝朝涌. 慢病毒介導沉默 P75 神經生長因子受體基因對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(8): 1052-1058. doi: 10.7507/1002-1892.201912086 復制
P75 神經生長因子受體（P75 neurotrophin receptor，P75NTR）是一種神經營養因子的低親和力受體，屬于Ⅰ型糖蛋白，在多種正常與非正常組織、細胞中均有表達[1]。P75NTR 具有復雜的生物學功能，可以介導細胞增殖與分化，在不同的細胞、細胞發育階段以及局部環境中發揮不同的功能[2]。研究表明，P75NTR 在骨折局部組織中持續高表達，進而影響骨折愈合[3-5]，甚至造成骨缺損[6]。而骨缺損修復主要是由 BMSCs 定向成骨分化形成新的骨組織來完成，這一過程中 P75NTR 發揮的作用尚未明確。小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）是在轉錄水平上調節基因表達的雙鏈 RNA[7-9]，本研究利用 siRNA 慢病毒介導沉默大鼠 BMSCs 的 P75NTR 基因表達，觀察細胞成骨分化能力的變化，探討通過沉默 P75NTR 基因治療骨缺損的可行性，以期為臨床修復骨缺損提供新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
病毒感染增強液聚凝胺（Polybrene）、RNA 引物（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；L-DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；FBS、30% 丙烯酰胺、Tris、RIPA 裂解液、細胞凍存液、聚偏二氟乙烯膜、免疫組織化學染色試劑盒、MTT 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；一抗稀釋液、二抗稀釋液、增強型 BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；GAPDH、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠 IgG、兔抗 P75NTR 單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）單克隆抗體、兔抗鼠 Runx 相關轉錄因子 2（Runx related transcription factor 2，Runx2）單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；超敏發光液（北京 Bridgen 橋生物公司）；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；ALP 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；茜紅素 S 染色液、成骨分化誘導培養液及誘導分化專用血清、青-鏈霉素、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松 [Cyagen 賽業（蘇州）生物科技有限公司]。
CO2 培養箱、冷凍高速離心機（Thermo 公司，美國）；光學顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；濾光片型酶標儀、光柵型連續波長酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；PCR 儀、圖像分析系統（B&D 公司，美國）；凝膠成像分析系統、垂直電泳-轉膜系統（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 P75NTR 基因慢病毒載體構建及篩選
1.2.1 慢病毒載體構建
針對 P75NTR 目標基因序列，按照 RNA 干擾序列設計原則，設計 3 條 P75NTR-siRNA 序列，分別為 5'-GGCTGATGCTGAATGCGAAGA-3'（P75NTR-siRNA-1）、5'-GCAAGACCTTGTACCCAGTAC-3'（P75NTR-siRNA-2）、5'-GGGTTACCAGCCTGAACATAT-3'（P75NTR-siRNA-3）。同時設計陰性對照（negative control，NC）siRNA 序列為 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（NC-siRNA）。以上 siRNA 序列的設計、慢病毒載體構建、包裝及滴度檢測均由蘇州吉瑪基因股份有限公司完成。
1.2.2 慢病毒載體篩選
取本課題組前期研究培養、鑒定及保存的第 3 代 SD 大鼠 BMSCs[10-12]，分別采用 P75NTR-siRNA-1、P75NTR-siRNA-2、P75NTR-siRNA-3 進行轉染（siRNA-1 組、siRNA-2 組及 siRNA-3 組）；以 NC-siRNA 轉染的 BMSCs 作為陰性對照組，正常培養 BMSCs 作為空白對照組。轉染方法：轉染前 1 d 待 BMSCs 融合至 80%～90% 時，EDTA-胰蛋白酶消化并重懸細胞，以 10%FBS 調整細胞密度為 5×103 個/L 后接種至 6 孔板，每孔 2 mL。轉染當天取出 6 孔板，吸棄培養液，每孔加入 1 mL 常規培養液后，按照分組對應加入 4 μL 慢病毒載體（感染復數為 80）、5 μL Polybrene，震蕩搖勻。轉染 4 d 后吸棄培養基，無菌 PBS 洗 3 次，加入含 10%FBS 的完全培養基繼續培養。
檢測方法：① 細胞形態觀察。轉染后 3 d 倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態變化。
② 實時熒光定量 PCR 檢測 P75NTR 基因表達。取轉染后 4 d 各組細胞，按試劑盒說明書提取總 RNA 并逆轉錄合成 cDNA。采用 Primer 5.0 設計軟件設計引物，引物序列見表 1。反應體系：10×buffer1 2 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）0.8 μL、Taq Polymerase 0.2 μL、上下游引物各 0.4 μL、Template 1 μL，加入雙蒸水至 20 μL。反應條件：94℃、30 s；94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，72℃、6 min，循環 30 次。采用 2△△Ct法計算 P75NTR mRNA 相對表達量，計算 siRNA-1 組、siRNA-2 組及 siRNA-3 組的抑制率，觀察沉默效果；抑制率=（空白對照組測量值?siRNA 組測量值）/空白對照組測量值×100%。
表1
實時熒光定量 PCR 基因引物序列及產物大小
Table1.
Gene primer sequence and product size in real-time fluorescent quatitative PCR
③ Western blot 檢測 P75NTR 蛋白表達。取轉染后 6 d 各組細胞，提取蛋白樣品，BCA 法測定蛋白濃度；配置 10% 丙烯酰胺凝膠，上樣；電泳液中電泳后轉膜，置于 5% 牛奶中封閉；加入 P75NTR 一抗工作液（1∶1 000），4℃ 孵育過夜；加入二抗（1∶8 000）室溫孵育 1 h；洗膜 3 次后加入發光工作液，凝膠成像儀中顯像；用 Image J 灰度分析軟件分析條帶灰度值，以與內參（GAPDH）灰度值比值作為 P75NTR 蛋白表達相對量。同上法計算 siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組的抑制率，觀察沉默效果。
結合上述兩項檢測結果，選取沉默效果最佳 P75NTR-siRNA 進行后續實驗。
1.3 沉默 P75NTR 基因對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響
1.3.1 實驗分組
取本課題組前期研究培養、鑒定及保存的第 3 代 SD 大鼠 BMSCs[10-12]，隨機分為 3 組，分別為慢病毒介導 P75NTR 沉默組（實驗組）、陰性對照組、空白對照組。空白對照組為正常培養 BMSCs；陰性對照組及實驗組分別采用 NC-siRNA 及篩選的 P75NTR-siRNA 慢病毒載體轉染 BMSCs，轉染方法同 1.2.2，取轉染 4 d 細胞進行以下觀測。
1.3.2 MTT 法檢測細胞增殖情況
將各組 BMSCs 接種于 96 孔板中，每孔 5×103個細胞，每組 3 個復孔。用含 10%FBS 的 L-DMEM 完全培養基培養細胞，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養。培養 1～8 d 各組取 3 孔，繼續培養 4 h 后棄上清，每孔加入 DMSO 震蕩 10 min，采用酶標儀于 490 nm 波長處檢測吸光度（A）值，繪制細胞增殖曲線。
1.3.3 BMSCs 成骨誘導分化培養及檢測
① 成骨誘導分化培養：取各組 BMSCs 采用 EDTA-胰蛋白酶消化后，以 2×104個/L 密度接種于 6 孔板，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 完全培養基 1 mL，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養。待細胞生長融合達 60%～70% 后吸棄培養液，加入含地塞米松 0.1 μmol/L、維生素 C 50 μmol/L、β-甘油磷酸鈉 10 mmol/L 的成骨誘導分化完全培養基繼續培養，每 3 天更換 1 次培養基。
② Western blot 檢測 OCN 及 Runx2 蛋白表達：誘導培養 3 d，參照 1.2.2 方法檢測各組細胞 OCN、Runx2 蛋白相對表達量。
③ 免疫組織化學染色觀察：誘導培養 7 d，將各組細胞接種于預置蓋玻片的培養皿進行細胞爬片，每個培養皿接種 4×104 個細胞，3 d 后行Ⅰ型膠原免疫組織化學染色。倒置顯微鏡下觀察細胞質內有棕黃色顆粒為陽性染色，隨機選取 5 個視野，用 Image-Pro Plus 圖像采集分析系統計算Ⅰ型膠原蛋白灰度值，即Ⅰ型膠原蛋白表達量。
④ ALP 檢測成骨分化情況：誘導培養 7、10、14 d，分別取各組細胞上清液，參照 ALP 檢測試劑盒說明書檢測 ALP 活力。
⑤ 茜素紅染色檢測礦化結節形成情況：誘導培養 7、14 d，取各組細胞吸棄成骨誘導分化培養基，PBS 沖洗 2 次，每孔加入 2 mL 4%多聚甲醛溶液，固定 30 min；吸棄多聚甲醛溶液， PBS 沖洗 2 次，每孔加入茜素紅 S 染色液 1 mL，染色 5 min；吸棄染液，PBS 沖洗 3 次。倒置顯微鏡下觀察染色效果。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 慢病毒載體篩選
2.1.1 細胞形態觀察
倒置顯微鏡下見各組細胞形態無明顯差異，呈長梭形貼壁生長，排列成輻射狀。見圖 1。
圖1
倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態（×100）
a. siRNA-1 組；b. siRNA-2 組；c. siRNA-3 組；d. 陰性對照組；e. 空白對照組
Figure1. Cell morphology observation of each group under inverted microscope (×100)a. siRNA-1 group; b. siRNA-2 group; c. siRNA-3 group;d. Negative control group; e. Blank control group
2.1.2 實時熒光定量 PCR 檢測
siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組、陰性對照組及空白對照組 P75NTR mRNA 相對表達量分別為 0.613±0.067、0.445±0.133、0.091±0.028、0.970±0.089、0.991±0.071。其中，siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組與空白對照組、陰性對照組比較，siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組抑制率分別為 38.1%±5.2%、55.1%±7.9%、90.8%±4.1%。
2.1.3 Western blot 檢測
siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組、陰性對照組及空白對照組 P75NTR 蛋白相對表達量分別為 0.244±0.028、0.192±0.017、0.040±0.012、0.391±0.023、0.412±0.013。siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組與空白對照組、陰性對照組比較，siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組抑制率分別為 40.8%±5.7%、53.4%±4.3%、90.3%±4.6%。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測各組 P75NTR 蛋白表達水平
Mr：相對分子質量 1：空白對照組 2：陰性對照組 3：siRNA-1 組 4：siRNA-2 組 5：siRNA-3 組
Figure2. Expression of P75NTR protein in each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: Negative control group 3: siRNA-1 group 4: siRNA-2 group 5: siRNA-3 group
結合實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測結果，P75NTR-siRNA-3 沉默效果最佳，選擇其進行后續實驗。
2.2 沉默 P75NTR 基因對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響
2.2.1 MTT 法檢測細胞增殖情況
隨培養時間延長，3 組 BMSCs 數量均逐漸增加。與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組細胞增殖明顯加快；從 3 d 開始實驗組 A 值明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
MTT 法檢測各組細胞增殖
Figure3.
Cell proliferation of each group detected by MTT assay
2.2.2 Western blot 檢測細胞 OCN 及 Runx2 蛋白表達
實驗組、陰性對照組及空白對照組 OCN 蛋白相對表達量分別為 1.113±0.204、0.611±0.181、0.605±0.113，Runx2 蛋白相對表達量分別為 1.793±0.190、0.967±0.314、0.918±0.261。實驗組 OCN 及 Runx2 蛋白相對表達量均明顯高于陰性對照組及空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測各組細胞 OCN 及 Runx2 蛋白表達水平 Mr：相對分子質量 1：空白對照組 2：陰性對照組 3：實驗組
Figure4.
Expressions of OCN and Runx2 proteins in cells of each group detected by Western blot
Mr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: Negative control group 3: Experimental group
2.2.3 免疫組織化學染色觀察 Ⅰ 型膠原表達
鏡下觀察各組細胞質內均可見棕黃色顆粒，實驗組染色程度強于空白對照組及陰性對照組，空白對照組與陰性對照組無明顯差異。見圖 5。Ⅰ 型膠原蛋白表達量空白對照組為 18.64±3.12、陽性對照組為 19.12±4.09、實驗組為 39.78±7.34。實驗組明顯高于其他兩組，差異有統計學意義（P<0.05）；陽性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖5
各組免疫組織化學染色觀察（倒置顯微鏡×200）
a. 空白對照組；b. 陰性對照組；c. 實驗組
Figure5. Immunohistochemical staining of each group (Inverted microscope×200)a. Blank control group; b. Negative control group; c. Experimental group
2.2.4 ALP 活力檢測
隨時間延長，各組細胞 ALP 活力均逐漸升高，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05）。各時間點，實驗組 ALP 活力均較空白對照組和陰性對照組增高，差異有統計學意義（P<0.05）；空白對照組和陽性對照組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
各時間點各組 ALP 活力比較（n=3，
）
Table2.
Comparison of ALP activity between groups at different time points (n=3, 
)
2.2.5 茜素紅染色
成骨誘導培養 7 d，空白對照組及陰性對照組僅有極少紅色結節形成，實驗組可見較多紅色結節。14 d 時，空白對照組及陽性對照組仍為少量紅色結節，而實驗組出現大量紅色結節。見圖 6。
圖6
各組茜素紅染色觀察（倒置顯微鏡×100）
從左至右分別為空白對照組、陰性對照組、實驗組 a. 成骨誘導 7 d；b. 成骨誘導 14 d
Figure6. Alizarin red staining observation of each group (Inverted microscope×100)From left to right for blank control group, negative control group, and experimental group, respectively a. Osteogenic induction for 7 days; b. Osteogenic induction for 14 days
3 討論
本課題組前期 P75NTR 與骨缺損相關性研究發現，P75NTR 在骨折不愈合處明顯高表達[4]。為了進一步研究 P75NTR 在骨缺損中的作用，本次研究采用大鼠 BMSCs，以 siRNA 慢病毒沉默 P75NTR 基因后，觀察細胞成骨分化能力的變化。結果顯示，P75NTR 基因沉默后，大鼠 BMSCs 中的Ⅰ型膠原蛋白形成、ALP 活力、礦化結節形成能力均明顯提高，說明 P75NTR 基因沉默可增強大鼠 BMSCs 成骨分化能力。據此反向推理，P75NTR 基因表達上調可能使 BMSCs 增殖及成骨分化能力減弱，這可能是骨缺損發生的分子機制之一。
研究表明，NGF 的前體物質 pro-NGF 通過與 P75NTR 結合可以誘導細胞凋亡、抑制分化，但 NGF 與 P75NTR 結合可以發揮完全相反作用，誘導細胞增殖與分化，從而挽救受損的細胞[13-14]。目前，有關研究報道 P75NTR 參與的信號通路主要包括神經酰胺通路、JNK-p53-Bax 凋亡通路及 NF-κB 通路。結合本次研究結果，我們認為在神經酰胺通路中，沉默 P75NTR 基因后使得位于漿膜內表面的神經鞘磷脂、神經鞘磷脂酶不能被激活，從而不能生成足夠的神經酰胺，進而阻斷 JNK 通路引起的 BMSCs 凋亡，細胞增殖與凋亡的微環境失衡使 BMSCs 顯示較強的增殖活性。另一方面，沉默 P75NTR 基因后啟動核因子 NF-κB 通路，促進 BMSCs 增殖與分化。NGF 可以通過 P75NTR 與細胞內近端的 TRAF6 蛋白結合，啟動 IKK（IkB kinases）和 ERK 的降解，激活 NF-κB 通路。本研究中沉默 P75NTR 基因促進 BMSCs 增殖分化，可能是存在競爭性抑制的結果，即表達量的不同可產生不同的競爭效應（pro-NGF 與 NGF 競爭性結合不同表達量 P75NTR 引起不同效應）。正常水平的 P75NTR 與 pro-NGF 結合占優勢；P75NTR 水平下調后，則與 NGF 結合占優勢，從而使 BMSCs 增殖分化。此外，由于在 NF-κB 通路中 P75NTR 和 TrkA 有共同作用，TrkA 與 She 相結合也能啟動 IKK 和 ERK 通路激活 NF-κB 通路[15-16]，所以下調 P75NTR 水平后，TrkA 是否有可能由于代償性作用直接與 NGF 存在聯系，促進 BMSCs 的增殖與分化，有待進一步實驗驗證。
P75NTR 的復雜空間結構決定了其在細胞中具有獨特而重要的生物學效應。結合本次研究結果，我們認為下一步可以通過沉默 P75NTR 基因并聯合 NGF 過表達轉染 BMSCs 后植入骨缺損處，提高 NGF 水平，關閉 P75NTR 凋亡通道，從而修復骨缺損，這可能為骨組織工程修復骨缺損提供新思路。值得注意的是，本研究沉默 P75NTR 基因表達可促進大鼠 BMSCs 的成骨分化僅是體外細胞實驗，而骨缺損的形成是一個多因素參與過程，對于不同動物細胞、細胞種類、甚至細胞狀態等混雜因素都需要進一步實驗論證。對于 P75NTR 在骨組織修復方面所表現的雙重作用通路機制[1]，也需要更深入研究。
作者貢獻：貝朝涌負責實驗設計；王寧、陳俊毅負責實驗實施；陳西淼、朱倫井、段江濤負責文獻查詢及實驗評價；王燁負責實驗結果收集整理；王寧負責實驗結果統計分析及文章撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經桂林醫學院動物實驗倫理委員會批準（GLMC201805018）。
P75 神經生長因子受體（P75 neurotrophin receptor，P75NTR）是一種神經營養因子的低親和力受體，屬于Ⅰ型糖蛋白，在多種正常與非正常組織、細胞中均有表達[1]。P75NTR 具有復雜的生物學功能，可以介導細胞增殖與分化，在不同的細胞、細胞發育階段以及局部環境中發揮不同的功能[2]。研究表明，P75NTR 在骨折局部組織中持續高表達，進而影響骨折愈合[3-5]，甚至造成骨缺損[6]。而骨缺損修復主要是由 BMSCs 定向成骨分化形成新的骨組織來完成，這一過程中 P75NTR 發揮的作用尚未明確。小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）是在轉錄水平上調節基因表達的雙鏈 RNA[7-9]，本研究利用 siRNA 慢病毒介導沉默大鼠 BMSCs 的 P75NTR 基因表達，觀察細胞成骨分化能力的變化，探討通過沉默 P75NTR 基因治療骨缺損的可行性，以期為臨床修復骨缺損提供新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
病毒感染增強液聚凝胺（Polybrene）、RNA 引物（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；L-DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；FBS、30% 丙烯酰胺、Tris、RIPA 裂解液、細胞凍存液、聚偏二氟乙烯膜、免疫組織化學染色試劑盒、MTT 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；一抗稀釋液、二抗稀釋液、增強型 BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；GAPDH、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠 IgG、兔抗 P75NTR 單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）單克隆抗體、兔抗鼠 Runx 相關轉錄因子 2（Runx related transcription factor 2，Runx2）單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；超敏發光液（北京 Bridgen 橋生物公司）；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；ALP 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；茜紅素 S 染色液、成骨分化誘導培養液及誘導分化專用血清、青-鏈霉素、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松 [Cyagen 賽業（蘇州）生物科技有限公司]。
CO2 培養箱、冷凍高速離心機（Thermo 公司，美國）；光學顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；濾光片型酶標儀、光柵型連續波長酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；PCR 儀、圖像分析系統（B&D 公司，美國）；凝膠成像分析系統、垂直電泳-轉膜系統（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 P75NTR 基因慢病毒載體構建及篩選
1.2.1 慢病毒載體構建
針對 P75NTR 目標基因序列，按照 RNA 干擾序列設計原則，設計 3 條 P75NTR-siRNA 序列，分別為 5'-GGCTGATGCTGAATGCGAAGA-3'（P75NTR-siRNA-1）、5'-GCAAGACCTTGTACCCAGTAC-3'（P75NTR-siRNA-2）、5'-GGGTTACCAGCCTGAACATAT-3'（P75NTR-siRNA-3）。同時設計陰性對照（negative control，NC）siRNA 序列為 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（NC-siRNA）。以上 siRNA 序列的設計、慢病毒載體構建、包裝及滴度檢測均由蘇州吉瑪基因股份有限公司完成。
1.2.2 慢病毒載體篩選
取本課題組前期研究培養、鑒定及保存的第 3 代 SD 大鼠 BMSCs[10-12]，分別采用 P75NTR-siRNA-1、P75NTR-siRNA-2、P75NTR-siRNA-3 進行轉染（siRNA-1 組、siRNA-2 組及 siRNA-3 組）；以 NC-siRNA 轉染的 BMSCs 作為陰性對照組，正常培養 BMSCs 作為空白對照組。轉染方法：轉染前 1 d 待 BMSCs 融合至 80%～90% 時，EDTA-胰蛋白酶消化并重懸細胞，以 10%FBS 調整細胞密度為 5×103 個/L 后接種至 6 孔板，每孔 2 mL。轉染當天取出 6 孔板，吸棄培養液，每孔加入 1 mL 常規培養液后，按照分組對應加入 4 μL 慢病毒載體（感染復數為 80）、5 μL Polybrene，震蕩搖勻。轉染 4 d 后吸棄培養基，無菌 PBS 洗 3 次，加入含 10%FBS 的完全培養基繼續培養。
檢測方法：① 細胞形態觀察。轉染后 3 d 倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態變化。
② 實時熒光定量 PCR 檢測 P75NTR 基因表達。取轉染后 4 d 各組細胞，按試劑盒說明書提取總 RNA 并逆轉錄合成 cDNA。采用 Primer 5.0 設計軟件設計引物，引物序列見表 1。反應體系：10×buffer1 2 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）0.8 μL、Taq Polymerase 0.2 μL、上下游引物各 0.4 μL、Template 1 μL，加入雙蒸水至 20 μL。反應條件：94℃、30 s；94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，72℃、6 min，循環 30 次。采用 2△△Ct法計算 P75NTR mRNA 相對表達量，計算 siRNA-1 組、siRNA-2 組及 siRNA-3 組的抑制率，觀察沉默效果；抑制率=（空白對照組測量值?siRNA 組測量值）/空白對照組測量值×100%。
表1
實時熒光定量 PCR 基因引物序列及產物大小
Table1.
Gene primer sequence and product size in real-time fluorescent quatitative PCR
③ Western blot 檢測 P75NTR 蛋白表達。取轉染后 6 d 各組細胞，提取蛋白樣品，BCA 法測定蛋白濃度；配置 10% 丙烯酰胺凝膠，上樣；電泳液中電泳后轉膜，置于 5% 牛奶中封閉；加入 P75NTR 一抗工作液（1∶1 000），4℃ 孵育過夜；加入二抗（1∶8 000）室溫孵育 1 h；洗膜 3 次后加入發光工作液，凝膠成像儀中顯像；用 Image J 灰度分析軟件分析條帶灰度值，以與內參（GAPDH）灰度值比值作為 P75NTR 蛋白表達相對量。同上法計算 siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組的抑制率，觀察沉默效果。
結合上述兩項檢測結果，選取沉默效果最佳 P75NTR-siRNA 進行后續實驗。
1.3 沉默 P75NTR 基因對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響
1.3.1 實驗分組
取本課題組前期研究培養、鑒定及保存的第 3 代 SD 大鼠 BMSCs[10-12]，隨機分為 3 組，分別為慢病毒介導 P75NTR 沉默組（實驗組）、陰性對照組、空白對照組。空白對照組為正常培養 BMSCs；陰性對照組及實驗組分別采用 NC-siRNA 及篩選的 P75NTR-siRNA 慢病毒載體轉染 BMSCs，轉染方法同 1.2.2，取轉染 4 d 細胞進行以下觀測。
1.3.2 MTT 法檢測細胞增殖情況
將各組 BMSCs 接種于 96 孔板中，每孔 5×103個細胞，每組 3 個復孔。用含 10%FBS 的 L-DMEM 完全培養基培養細胞，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養。培養 1～8 d 各組取 3 孔，繼續培養 4 h 后棄上清，每孔加入 DMSO 震蕩 10 min，采用酶標儀于 490 nm 波長處檢測吸光度（A）值，繪制細胞增殖曲線。
1.3.3 BMSCs 成骨誘導分化培養及檢測
① 成骨誘導分化培養：取各組 BMSCs 采用 EDTA-胰蛋白酶消化后，以 2×104個/L 密度接種于 6 孔板，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 完全培養基 1 mL，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養。待細胞生長融合達 60%～70% 后吸棄培養液，加入含地塞米松 0.1 μmol/L、維生素 C 50 μmol/L、β-甘油磷酸鈉 10 mmol/L 的成骨誘導分化完全培養基繼續培養，每 3 天更換 1 次培養基。
② Western blot 檢測 OCN 及 Runx2 蛋白表達：誘導培養 3 d，參照 1.2.2 方法檢測各組細胞 OCN、Runx2 蛋白相對表達量。
③ 免疫組織化學染色觀察：誘導培養 7 d，將各組細胞接種于預置蓋玻片的培養皿進行細胞爬片，每個培養皿接種 4×104 個細胞，3 d 后行Ⅰ型膠原免疫組織化學染色。倒置顯微鏡下觀察細胞質內有棕黃色顆粒為陽性染色，隨機選取 5 個視野，用 Image-Pro Plus 圖像采集分析系統計算Ⅰ型膠原蛋白灰度值，即Ⅰ型膠原蛋白表達量。
④ ALP 檢測成骨分化情況：誘導培養 7、10、14 d，分別取各組細胞上清液，參照 ALP 檢測試劑盒說明書檢測 ALP 活力。
⑤ 茜素紅染色檢測礦化結節形成情況：誘導培養 7、14 d，取各組細胞吸棄成骨誘導分化培養基，PBS 沖洗 2 次，每孔加入 2 mL 4%多聚甲醛溶液，固定 30 min；吸棄多聚甲醛溶液， PBS 沖洗 2 次，每孔加入茜素紅 S 染色液 1 mL，染色 5 min；吸棄染液，PBS 沖洗 3 次。倒置顯微鏡下觀察染色效果。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 慢病毒載體篩選
2.1.1 細胞形態觀察
倒置顯微鏡下見各組細胞形態無明顯差異，呈長梭形貼壁生長，排列成輻射狀。見圖 1。
圖1
倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態（×100）
a. siRNA-1 組；b. siRNA-2 組；c. siRNA-3 組；d. 陰性對照組；e. 空白對照組
Figure1. Cell morphology observation of each group under inverted microscope (×100)a. siRNA-1 group; b. siRNA-2 group; c. siRNA-3 group;d. Negative control group; e. Blank control group
2.1.2 實時熒光定量 PCR 檢測
siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組、陰性對照組及空白對照組 P75NTR mRNA 相對表達量分別為 0.613±0.067、0.445±0.133、0.091±0.028、0.970±0.089、0.991±0.071。其中，siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組與空白對照組、陰性對照組比較，siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組抑制率分別為 38.1%±5.2%、55.1%±7.9%、90.8%±4.1%。
2.1.3 Western blot 檢測
siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組、陰性對照組及空白對照組 P75NTR 蛋白相對表達量分別為 0.244±0.028、0.192±0.017、0.040±0.012、0.391±0.023、0.412±0.013。siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組與空白對照組、陰性對照組比較，siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。siRNA-1 組、siRNA-2 組、siRNA-3 組抑制率分別為 40.8%±5.7%、53.4%±4.3%、90.3%±4.6%。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測各組 P75NTR 蛋白表達水平
Mr：相對分子質量 1：空白對照組 2：陰性對照組 3：siRNA-1 組 4：siRNA-2 組 5：siRNA-3 組
Figure2. Expression of P75NTR protein in each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: Negative control group 3: siRNA-1 group 4: siRNA-2 group 5: siRNA-3 group
結合實時熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測結果，P75NTR-siRNA-3 沉默效果最佳，選擇其進行后續實驗。
2.2 沉默 P75NTR 基因對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響
2.2.1 MTT 法檢測細胞增殖情況
隨培養時間延長，3 組 BMSCs 數量均逐漸增加。與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組細胞增殖明顯加快；從 3 d 開始實驗組 A 值明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
MTT 法檢測各組細胞增殖
Figure3.
Cell proliferation of each group detected by MTT assay
2.2.2 Western blot 檢測細胞 OCN 及 Runx2 蛋白表達
實驗組、陰性對照組及空白對照組 OCN 蛋白相對表達量分別為 1.113±0.204、0.611±0.181、0.605±0.113，Runx2 蛋白相對表達量分別為 1.793±0.190、0.967±0.314、0.918±0.261。實驗組 OCN 及 Runx2 蛋白相對表達量均明顯高于陰性對照組及空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測各組細胞 OCN 及 Runx2 蛋白表達水平 Mr：相對分子質量 1：空白對照組 2：陰性對照組 3：實驗組
Figure4.
Expressions of OCN and Runx2 proteins in cells of each group detected by Western blot
Mr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: Negative control group 3: Experimental group
2.2.3 免疫組織化學染色觀察 Ⅰ 型膠原表達
鏡下觀察各組細胞質內均可見棕黃色顆粒，實驗組染色程度強于空白對照組及陰性對照組，空白對照組與陰性對照組無明顯差異。見圖 5。Ⅰ 型膠原蛋白表達量空白對照組為 18.64±3.12、陽性對照組為 19.12±4.09、實驗組為 39.78±7.34。實驗組明顯高于其他兩組，差異有統計學意義（P<0.05）；陽性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖5
各組免疫組織化學染色觀察（倒置顯微鏡×200）
a. 空白對照組；b. 陰性對照組；c. 實驗組
Figure5. Immunohistochemical staining of each group (Inverted microscope×200)a. Blank control group; b. Negative control group; c. Experimental group
2.2.4 ALP 活力檢測
隨時間延長，各組細胞 ALP 活力均逐漸升高，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05）。各時間點，實驗組 ALP 活力均較空白對照組和陰性對照組增高，差異有統計學意義（P<0.05）；空白對照組和陽性對照組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
各時間點各組 ALP 活力比較（n=3，）
Table2.
Comparison of ALP activity between groups at different time points (n=3, )
2.2.5 茜素紅染色
成骨誘導培養 7 d，空白對照組及陰性對照組僅有極少紅色結節形成，實驗組可見較多紅色結節。14 d 時，空白對照組及陽性對照組仍為少量紅色結節，而實驗組出現大量紅色結節。見圖 6。
圖6
各組茜素紅染色觀察（倒置顯微鏡×100）
從左至右分別為空白對照組、陰性對照組、實驗組 a. 成骨誘導 7 d；b. 成骨誘導 14 d
Figure6. Alizarin red staining observation of each group (Inverted microscope×100)From left to right for blank control group, negative control group, and experimental group, respectively a. Osteogenic induction for 7 days; b. Osteogenic induction for 14 days
3 討論
本課題組前期 P75NTR 與骨缺損相關性研究發現，P75NTR 在骨折不愈合處明顯高表達[4]。為了進一步研究 P75NTR 在骨缺損中的作用，本次研究采用大鼠 BMSCs，以 siRNA 慢病毒沉默 P75NTR 基因后，觀察細胞成骨分化能力的變化。結果顯示，P75NTR 基因沉默后，大鼠 BMSCs 中的Ⅰ型膠原蛋白形成、ALP 活力、礦化結節形成能力均明顯提高，說明 P75NTR 基因沉默可增強大鼠 BMSCs 成骨分化能力。據此反向推理，P75NTR 基因表達上調可能使 BMSCs 增殖及成骨分化能力減弱，這可能是骨缺損發生的分子機制之一。
研究表明，NGF 的前體物質 pro-NGF 通過與 P75NTR 結合可以誘導細胞凋亡、抑制分化，但 NGF 與 P75NTR 結合可以發揮完全相反作用，誘導細胞增殖與分化，從而挽救受損的細胞[13-14]。目前，有關研究報道 P75NTR 參與的信號通路主要包括神經酰胺通路、JNK-p53-Bax 凋亡通路及 NF-κB 通路。結合本次研究結果，我們認為在神經酰胺通路中，沉默 P75NTR 基因后使得位于漿膜內表面的神經鞘磷脂、神經鞘磷脂酶不能被激活，從而不能生成足夠的神經酰胺，進而阻斷 JNK 通路引起的 BMSCs 凋亡，細胞增殖與凋亡的微環境失衡使 BMSCs 顯示較強的增殖活性。另一方面，沉默 P75NTR 基因后啟動核因子 NF-κB 通路，促進 BMSCs 增殖與分化。NGF 可以通過 P75NTR 與細胞內近端的 TRAF6 蛋白結合，啟動 IKK（IkB kinases）和 ERK 的降解，激活 NF-κB 通路。本研究中沉默 P75NTR 基因促進 BMSCs 增殖分化，可能是存在競爭性抑制的結果，即表達量的不同可產生不同的競爭效應（pro-NGF 與 NGF 競爭性結合不同表達量 P75NTR 引起不同效應）。正常水平的 P75NTR 與 pro-NGF 結合占優勢；P75NTR 水平下調后，則與 NGF 結合占優勢，從而使 BMSCs 增殖分化。此外，由于在 NF-κB 通路中 P75NTR 和 TrkA 有共同作用，TrkA 與 She 相結合也能啟動 IKK 和 ERK 通路激活 NF-κB 通路[15-16]，所以下調 P75NTR 水平后，TrkA 是否有可能由于代償性作用直接與 NGF 存在聯系，促進 BMSCs 的增殖與分化，有待進一步實驗驗證。
P75NTR 的復雜空間結構決定了其在細胞中具有獨特而重要的生物學效應。結合本次研究結果，我們認為下一步可以通過沉默 P75NTR 基因并聯合 NGF 過表達轉染 BMSCs 后植入骨缺損處，提高 NGF 水平，關閉 P75NTR 凋亡通道，從而修復骨缺損，這可能為骨組織工程修復骨缺損提供新思路。值得注意的是，本研究沉默 P75NTR 基因表達可促進大鼠 BMSCs 的成骨分化僅是體外細胞實驗，而骨缺損的形成是一個多因素參與過程，對于不同動物細胞、細胞種類、甚至細胞狀態等混雜因素都需要進一步實驗論證。對于 P75NTR 在骨組織修復方面所表現的雙重作用通路機制[1]，也需要更深入研究。
作者貢獻：貝朝涌負責實驗設計；王寧、陳俊毅負責實驗實施；陳西淼、朱倫井、段江濤負責文獻查詢及實驗評價；王燁負責實驗結果收集整理；王寧負責實驗結果統計分析及文章撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經桂林醫學院動物實驗倫理委員會批準（GLMC201805018）。
