引用本文： 鄒敏, 孫嘉辰, 項舟. 負載IL-4及BMP-2的氧化石墨烯-羧甲基殼聚糖凝膠對骨免疫和骨修復的早期影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(8): 1044-1051. doi: 10.7507/1002-1892.201911068 復制
腫瘤、創傷、先天性疾病等原因導致的大范圍或節段性骨缺損修復一直是臨床難題，采用具有骨誘導性生物材料構建類似自體骨修復骨缺損的方法顯示了廣闊的應用前景。目前體外生物材料誘導骨形成的研究中，未考慮宿主固有炎癥反應，導致體內與體外研究結果不一致[1]。當生物材料植入體內時，首先在其表面黏附的細胞不是骨相關細胞，而是參與宿主免疫反應的免疫細胞，包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞等，其中巨噬細胞為主要參與者，在骨損傷早期和晚期骨重建中發揮著重要作用。巨噬細胞具有高度可塑性，可以分為經典活化的 M1 型和選擇活化的 M2 型，分別發揮促炎作用和抗炎作用。近年來，M2 型巨噬細胞及其亞型作為治療型巨噬細胞備受重視，不僅具有強大的抗炎作用，還具有促進細胞遷移增殖、細胞成熟、細胞外基質形成和血管形成[2-3]，調節干細胞以及成骨細胞、破骨細胞的功能活性等[4]重要作用，成為骨修復重建和骨免疫調節的研究熱點。IL-4 是免疫系統中重要的免疫細胞因子，能夠誘導巨噬細胞向 M2 型分化，在骨修復炎癥反應階段減輕局部炎癥，促進骨修復。然而，IL-4 半衰期非常短，在機體內的有效時間僅有 2～10 min，很容易被機體清除，阻礙了 IL-4 的體內研究[5-6]。
羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）是殼聚糖的衍生物，具有良好的水溶性以及天然生物相容性、降解性、抗菌等特性，可在交聯劑作用下形成凝膠，廣泛用作制備骨、軟骨、皮膚軟組織等的生物材料[7-8]。然而，單純 CMC 凝膠機械性能差，不能滿足組織生長環境的力學要求。近年來，氧化石墨烯（graphene oxide，GO）越來越受到關注，其在細胞黏附、增殖以及載藥、生物傳感等方面有著廣闊應用前景，成為生物領域研究的熱點[9-11]。有研究發現 CMC 與 GO 混合成膠后，CMC 機械強度明顯提高[12]。同時在載藥方面，GO 可以在不破壞蛋白分子結構條件下修飾結合所需負載的蛋白，并在其釋放過程中表現出持續緩釋作用，在減少用量的同時持續保持負載蛋白活性[13]。
因此，本研究通過 GO 負載 IL-4 和 BMP-2，制備具有緩釋功能的 GO-CMC 凝膠支架，探討該支架能否誘導巨噬細胞 M2 型分化以及通過釋放 IL-4 和 BMP-2 增強 BMSCs 成骨分化能力。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～5 周齡 SPF 級 SD 雌性大鼠 4 只，體質量 200～220 g，購于成都達碩生物科技有限公司。
IL-4、BMP-2（R&D 公司，美國）；L-DMEM、H-DMEM、FBS（GIBCO 公司，美國）；1640 培養基（HyClone 公司，美國）；CMC（羧甲基化≥80%；大連美侖生物技術有限公司）；GO 粉末（南京先豐納米材料有限公司）；CD68 抗體、CD206 抗體（Abcam 公司，美國）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］、N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）（Sigma 公司，美國）；BCIP/NBT ALP 顯色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；AKP 測試盒（南京建成有限公司）。
倒置熒光顯微鏡、掃描電鏡（Zeiss 公司，德國）；傅立葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR；熱電公司，美國）。
1.2 凝膠制備與表征
1.2.1 凝膠制備
將 CMC 置于 PBS 配置成 2%（W/V）溶液，然后加入 GO 溶液，使 GO 濃度為 0.01 %（W/V），GO 溶液在混合前加入交聯劑（0.1 mol/LEDC 及 0.025 mol/L NHS）活化 15 min。分別加入 PBS、IL-4（1 μg/mL）、BMP-2（2 μg/mL）以及 IL-4（1 μg/mL）+BMP-2（2 μg/mL），搖晃 2 h 使其與 CMC 溶液充分混合。加入交聯劑，混合均勻后移至 96 孔板中靜置 30 min，待其充分成膠后分別得到單純 GO-CMC 凝膠以及負載 IL-4、BMP-2 及 IL-4+BMP-2 的 GO-CMC 凝膠，切割成厚度約 2 mm 的樣品備用。另直接于 CMC 溶液中加入交聯劑制備單純 CMC 凝膠。將制備的凝膠置于 PBS 溶液中浸泡 72 h，每 24 小時換液 1 次，去除多余交聯劑及其副產物。
1.2.2 GO-CMC 凝膠表征觀測
① 大體觀察：觀察單純 CMC 凝膠和單純 GO-CMC 凝膠的形狀、顏色。
② 掃描電鏡觀察：將單純 CMC 凝膠和單純 GO-CMC 凝膠置于–20℃ 冰箱中 2 h，然后轉移至–80℃ 冰箱過夜并凍干，切片、噴金處理后，掃描電鏡觀察樣品微觀結構。
③ FTIR 檢測：將單純 CMC 凝膠和單純 GO-CMC 凝膠凍干后研磨成粉末，溴化鉀壓片后，采用 FTIR 對樣品進行分析。
④ 緩釋性能：將負載不同因子的 GO-CMC 凝膠樣品切片，片厚 2 mm、直徑 17.8 mm，置于 4 mL EP 管中，加入 3 mL PBS 溶液（pH7.0），置于搖床（37℃、80 r/min）。分別于 1、3、5、7、14、28、42、56 d 吸取 PBS 溶液（–20℃ 保存），同時添加 3 mL 新的 PBS 溶液。待各時間點收集完成后，ELISA 檢測 PBS 溶液中 IL-4、BMP-2 含量，繪制緩釋曲線，計算各時間點緩釋率。
1.3 GO-CMC 凝膠誘導巨噬細胞 M2 型分化
1.3.1 大鼠巨噬細胞分離培養
取 4 只 SD 大鼠斷頸處死，每只腹腔注射 10 mL 預冷 H-DMEM，靜置 5～7 min。在劍突下最薄弱處作 2 mm 長切口打開腹腔，用無菌巴氏吸管從切口進入腹腔吸取淡黃色液體，置于離心管中，以半徑 12 cm、1 000 r/min 離心 10 min；棄上清，加入含 10%FBS 的 H-DMEM 培養基重懸，調整細胞密度為 1.5×106個/mL，接種于放置細胞爬片的 6 孔板中，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 2 h 后更換培養基，去除未貼壁細胞及其他細胞，剩下貼壁細胞即為巨噬細胞，用于后續實驗。
1.3.2 誘導分化培養及觀測
將巨噬細胞接種至有 24 孔爬片的 Transwell 孔板下室中，調整細胞密度為 2×105個/孔，2 h 后首次換液，去除未貼壁細胞；取制備的單純 GO-CMC 凝膠（對照組）以及負載 IL-4、BMP-2、IL-4+BMP-2 的 GO-CMC 凝膠（分別為 IL-4 組、BMP-2 組、IL-4+BMP-2 組），分別置于 Transwell 孔板上室中；同時設置空白對照（無材料和因子）和陽性對照（僅有 IL-4）。培養 24 h 后取出細胞爬片行 CD206 免疫熒光檢測，熒光顯微鏡下觀察藍色熒光（DAPI）和紅色熒光（羅丹明）雙染者即為 M2 型陽性細胞，200 倍鏡下隨機取 5 個視野計算陽性率。
1.4 GO-CMC 凝膠誘導 BMSCs 成骨分化
1.4.1 誘導培養及分組
取前期研究分離培養的第 3 代 BMSCs 接種至 24 孔 Transwell 孔板下室中，調整細胞密度為 2×104個/孔，待細胞融合至 60%～70% 時，更換為成骨誘導培養基；同時取單純 GO-CMC 凝膠（對照組）以及負載 IL-4、BMP-2、IL-4+BMP-2 的 GO-CMC 凝膠（分別為 IL-4 組、BMP-2 組、IL-4+BMP-2 組），分別置于 Transwell 孔板上室中，每隔 2 d 換液 1 次。以單純 BMSCs 成骨誘導培養作為空白組。
1.4.2 觀測指標
① 早期成骨觀測：誘導培養 10 d 各組取 3 孔細胞，參照 BCIP/NBT ALP 顯色試劑盒說明書染色，光鏡下觀察細胞染色情況。參照 AKP 測試盒操作說明書檢測 ALP 蛋白、總蛋白含量，并計算 ALP 蛋白/總蛋白比值。② 晚期成骨觀測：誘導培養 21 d 后各組取 3 孔細胞行茜素紅染色，光鏡下觀察鈣結節染色情況。然后用 10% 氯化十六烷基吡啶溶解，采用全自動酶標儀于 562 nm 波長處讀取吸光度（A）值。
1.5 統計學方法
采用 GraphPad8.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 凝膠表征觀測
2.1.1 大體觀察
單純 CMC 凝膠呈淡黃色，半透明狀，含水量高，折光性強；單純 GO-CMC 凝膠呈棕色，半透明狀，含水量高，折光性強。見圖 1。
圖1
大體觀察
a. CMC 凝膠；b. GO-CMC 凝膠
Figure1. General observationa. CMC hydrogel; b. GO-CMC hydrogel
2.1.2 掃描電鏡觀察
單純 CMC 凝膠為疏松多孔結構，孔壁較薄且光滑；孔徑較大，達（311.5±17.0）nm。單純 GO-CMC 凝膠孔徑及孔壁厚度與單純 CMC 凝膠相比無明顯變化，但內壁粗糙度增加、表面積增大，同時可以觀察到孔壁上附著的 GO。見圖 2。
圖2
掃描電鏡觀察
a. CMC 凝膠（×35）；b. GO-CMC 凝膠（×35）；c. GO-CMC 凝膠孔壁附著的 GO（×2 000）
Figure2. SEM observationa. CMC hydrogel (×35); b. GO-CMC hydrogel (×35); c. GO attached to the wall of GO-CMC hydrogel (×2 000)
2.1.3 FTIR 檢測
單純 CMC 凝膠和單純 GO-CMC 凝膠的紅外光譜中可見 1 648 cm–1和 1 590 cm–1波長處分別出現波峰變化，說明在化學交聯劑作用下發生了化學鍵的結合（CMC 自身形成、CMC 與 GO 之間形成），形成了典型的酰胺鍵（-NHCO-）Ⅰ和Ⅱ，表明 CMC 發生聚合形成凝膠。見圖 3。
圖3
凝膠 FTIR 檢測
Figure3.
FTIR analysis of hydrogel
2.1.4 負載因子凝膠的緩釋性能觀測
緩釋曲線提示各樣品均呈線性緩慢釋放因子，56 d 后緩釋率均未達 40%，未出現突釋現象。3 種負載不同因子的 GO-CMC 凝膠緩釋性能相似，其中負載 IL-4 的 GO-CMC 凝膠最大緩釋率為 38.3%，負載 BMP-2 的 GO-CMC 凝膠為 38.8%，負載 IL-4+BMP-2 的 GO-CMC 凝膠（IL-4 和 BMP-2 均值）為 37.2%。見圖 4。
圖4
負載不同因子的 GO-CMC 凝膠緩釋曲線
Figure4.
The sustained release curves of GO-CMC hydrogels loaded with different cytokines
2.2 GO-CMC 凝膠誘導巨噬細胞 M2 型分化
培養 24 h 后，IL-4 組、IL-4+BMP-2 組中可見大量 M2 型陽性細胞，陽性率分別為 88.67%±1.28%、89.20%±0.62%，組間差異無統計學意義（P>0.05）；對照組以及 BMP-2 組僅可見少量 M2 型陽性細胞，陽性率分別為 6.07%±0.57%、6.27%±0.91%，組間差異亦無統計學意義（P>0.05）；而 IL-4 組、IL-4+BMP-2 組與對照組、BMP-2 組間差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
各組 CD206 免疫熒光染色觀察
從左至右分別為光鏡（×100）下以及熒光顯微鏡（×100）下 DAPI 染色、羅丹明染色及二者重疊a. IL-4 組；b. BMP-2 組；c. IL-4+BMP-2 組；d. 對照組
Figure5. CD206 immunofluorescence staining of each groupFrom left to right for light microscope (×100) observation and DAPI staining, rhodamine staining, and the merge under fluorescence microscope (×100) a. IL-4 group; b. BMP-2 group; c. IL-4+BMP-2 group; d. Control group
2.3 GO-CMC 凝膠誘導 BMSCs 成骨分化
2.3.1 早期成骨觀測
成骨誘導培養 10 d 后，各組均可見藍紫色片狀沉積，其中 IL-4+BMP-2 組顏色最深、片狀沉積最大，其次分別為 BMP-2 組、IL-4 組、對照組及空白組。見圖 6。
圖6
成骨誘導培養 10 d 各組 ALP 染色觀察（×100）
a. 空白組；b. 對照組；c. IL-4 組；d. BMP-2 組；e. IL-4+BMP-2 組
Figure6. ALP staining observation of each group after osteogenic induction cultured for 10 days (×100)a. Blank group; b. Control group; c. IL-4 group; d. BMP-2 group; e. IL-4+BMP-2 group
半定量檢測顯示，空白組、對照組、IL-4 組、BMP-2 組、IL-4+BMP-2 組 ALP 蛋白/總蛋白比值分別為 1.43±0.11、1.42±0.02、1.58±0.03、1.72±0.02、1.96±0.08。IL-4+BMP-2 組及 BMP-2 組 ALP 蛋白/ 總蛋白比值明顯高于 IL-4 組、對照組及空白組，IL-4+BMP-2 組高于 BMP-2 組，IL-4 組高于對照組及空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）；對照組及空白組間差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.2 晚期成骨觀測
各組均可見橘紅色鈣化結節、成團聚集，其中 BMP-2 組以及 IL-4+BMP-2 組鈣化結節更多、橘紅色片狀更大。見圖 7。
圖7
成骨誘導培養 21 d 各組茜素紅染色觀察（×100）
a. 空白組；b. 對照組；c. IL-4 組；d. BMP-2 組；e. IL-4+BMP-2 組
Figure7. Alizarin red staining observation of each group after osteogenic induction cultured for 21 days (×100)a. Blank group; b. Control group; c. IL-4 group; d. BMP-2 group; e. IL-4+BMP-2 group
半定量檢測顯示，IL-4+BMP-2 組、BMP-2 組、IL-4 組、對照組及空白組A值分別為 0.377±0.009、0.327±0.007、0.255±0.006、0.228±0.015、0.214±0.009。IL-4+BMP-2 組及 BMP-2 組明顯高于 IL-4 組、對照組及空白組，IL-4+BMP-2 組高于 BMP-2 組，IL-4 組高于對照組及空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）；對照組及空白組間差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
本研究通過 GO 負載 IL-4 和 BMP-2 兩種生物活性因子與 CMC 溶液混合，成功制備 GO-CMC 凝膠支架，其不僅能誘導巨噬細胞向 M2 型分化，同時緩釋的 IL-4 和 BMP-2 均可以在體外增強 BMSCs 成骨分化能力。近年來，骨誘導材料的免疫調節越來越受到重視，被認為是組織再生的重要影響因素[14-16]。CMC 作為天然多糖類，不僅具有良好的生物相容性及降解性，還具有抗菌特性，這些特性使其在生物材料工程領域得到廣泛應用[17]。GO 由于表面含有大量羥基、羧基等功能基團，被修飾后能作為載體，負載多種生物蛋白分子，在保持其生物活性同時表現出緩慢釋放的特性[18]。表征觀察顯示該凝膠支架具有疏松多孔結構，孔徑在 300 nm 左右，有利于營養物質的交換及代謝產物的排出，同時其內壁粗糙，增加了細胞及蛋白分子的黏附面積；FTIR 檢測提示在 1 648 cm?1和 1 590 cm?1波長處分別形成了典型的酰胺鍵（-NHCO-）的波峰變化，表明 GO 和 CMC 或者其自身發生了交聯，產生了新的化學鍵，形成了穩定的凝膠結構。
骨骼系統與免疫系統形成了一個新的研究方向，稱為“骨免疫學”。例如，免疫細胞產生的細胞因子（如 TGF-β 和 IL-4）在分化早期可誘導成骨細胞遷移、增殖或分泌骨細胞外基質，而 IL-1β 和 TNF-α 可抑制成骨細胞分化[19]。基于此，本研究應用 IL-4 誘導巨噬細胞向 M2 型分化，從而達到促進 BMSCs 增殖和成骨分化的目的。Zheng 等[20]比較了不同劑量 IL-4 誘導巨噬細胞分化的效果，以期提供一種精確的主動免疫調節機制，從而達到增強成骨和成血管目的。研究發現當單次 IL-4 用量為 10 ng 時，巨噬細胞分化為 M1 型與 M2 型比例最適合，促進成骨和成血管作用也最強。本研究選擇 IL-4 濃度為 1 μg/mL，單個凝膠支架單次緩釋劑量與 Zheng 等[20]實驗劑量相似。BMP-2 作為成骨誘導因子的研究很多，不同文獻報道的使用劑量各不相 同[21-22]，由于 GO 負載因子后呈現緩慢釋放趨勢，因此本研究采用 BMP-2 的使用劑量為 2 μg/mL，與 Lee 等[12]實驗研究劑量一致。研究表明，GO 負載 BMP-2 緩慢釋放的特性不僅可以持續釋放因子作用于目的細胞，避免突釋所帶來的不良效果，同時也可減少用量，進而減少副作用并降低成本[1]。
本研究 GO-CMC 凝膠誘導巨噬細胞 M2 型分化檢測結果顯示，負載 IL-4 的凝膠支架組（IL-4、IL-4+BMP-2 組）均成功誘導巨噬細胞 M2 型分化，表明凝膠支架在與巨噬細胞共培養中釋放一定量 IL-4，能誘導巨噬細胞向 M2 型分化，為組織修復提供有力的細胞微環境，為后續體內實驗奠定了基礎。有研究證實巨噬細胞可以通過分泌多種因子，如 BMP-2、TNF-α、抑瘤素等，調控骨形成[23-25]。因此，下一步需要對 IL-4 誘導巨噬細胞 M2 型分化和 BMSCs 的共培養體系進行實驗研究，探索其增強 BMSCs 成骨分化形成的機制。
目前，M0、M1、M2 型巨噬細胞對 BMSCs 成骨分化的影響仍存在爭議[26]。研究發現盡管 M1 型巨噬細胞在成骨早期和中期顯著促進共培養的 MSCs 成骨分化，但未觀察到其對 MSCs 礦化作用的增強[23]。與此相反，M2 型巨噬細胞增強了共培養的 MSCs 礦化，并且這種作用和巨噬細胞與 MSCs 的比例成正相關。此外，BMP-2 和抑瘤素參與不同亞型巨噬細胞和 MSCs 之間的相互作用，從而刺激后者的成骨分化。另有研究發現，M0 型巨噬細胞增強細胞的成骨能力，但與 M1 型和 M2 型巨噬細胞相比，細胞形成片層的能力受損[27]。相比之下，M2 型巨噬細胞不僅能促進培養細胞的成骨分化潛能，還表現出形成穩健細胞片層的能力。
通過對 BMSCs 成骨誘導研究，我們發現 IL-4+BMP-2 組 ALP 染色最深、片狀沉積最大，半定量檢測結果提示其早期成骨蛋白含量最高；而茜素紅染色同樣表明負載兩種因子的凝膠誘導 BMSCs 成骨分化作用明顯強于單一因子或不含因子凝膠，提示 IL-4 的參與提高了 BMSCs 的成骨分化能力，而具體機制目前尚不清楚，已成為研究熱點[1，28-30]。
綜上述，本研究通過 GO 負載 IL-4 和 BMP-2，與 CMC 構建復合凝膠支架，體外實驗表明該支架不僅可以誘導巨噬細胞 M2 型分化，并且釋放的兩種因子均能增強 BMSCs 成骨分化能力，為體內實驗奠定了良好基礎，同時為骨缺損修復及骨免疫調節提供了新的策略。但目前對于巨噬細胞調控 BMSCs 成骨分化的機制仍不明確，兩者相互關系仍需進一步探索，對于骨誘導生物材料精確的免疫調控也需進一步研究。
作者貢獻：鄒敏負責實驗設計及實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；孫嘉辰負責實驗設計及實施、統計分析、文章撰寫；項舟審核實驗內容，對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準（2020072A）。
腫瘤、創傷、先天性疾病等原因導致的大范圍或節段性骨缺損修復一直是臨床難題，采用具有骨誘導性生物材料構建類似自體骨修復骨缺損的方法顯示了廣闊的應用前景。目前體外生物材料誘導骨形成的研究中，未考慮宿主固有炎癥反應，導致體內與體外研究結果不一致[1]。當生物材料植入體內時，首先在其表面黏附的細胞不是骨相關細胞，而是參與宿主免疫反應的免疫細胞，包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞等，其中巨噬細胞為主要參與者，在骨損傷早期和晚期骨重建中發揮著重要作用。巨噬細胞具有高度可塑性，可以分為經典活化的 M1 型和選擇活化的 M2 型，分別發揮促炎作用和抗炎作用。近年來，M2 型巨噬細胞及其亞型作為治療型巨噬細胞備受重視，不僅具有強大的抗炎作用，還具有促進細胞遷移增殖、細胞成熟、細胞外基質形成和血管形成[2-3]，調節干細胞以及成骨細胞、破骨細胞的功能活性等[4]重要作用，成為骨修復重建和骨免疫調節的研究熱點。IL-4 是免疫系統中重要的免疫細胞因子，能夠誘導巨噬細胞向 M2 型分化，在骨修復炎癥反應階段減輕局部炎癥，促進骨修復。然而，IL-4 半衰期非常短，在機體內的有效時間僅有 2～10 min，很容易被機體清除，阻礙了 IL-4 的體內研究[5-6]。
羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）是殼聚糖的衍生物，具有良好的水溶性以及天然生物相容性、降解性、抗菌等特性，可在交聯劑作用下形成凝膠，廣泛用作制備骨、軟骨、皮膚軟組織等的生物材料[7-8]。然而，單純 CMC 凝膠機械性能差，不能滿足組織生長環境的力學要求。近年來，氧化石墨烯（graphene oxide，GO）越來越受到關注，其在細胞黏附、增殖以及載藥、生物傳感等方面有著廣闊應用前景，成為生物領域研究的熱點[9-11]。有研究發現 CMC 與 GO 混合成膠后，CMC 機械強度明顯提高[12]。同時在載藥方面，GO 可以在不破壞蛋白分子結構條件下修飾結合所需負載的蛋白，并在其釋放過程中表現出持續緩釋作用，在減少用量的同時持續保持負載蛋白活性[13]。
因此，本研究通過 GO 負載 IL-4 和 BMP-2，制備具有緩釋功能的 GO-CMC 凝膠支架，探討該支架能否誘導巨噬細胞 M2 型分化以及通過釋放 IL-4 和 BMP-2 增強 BMSCs 成骨分化能力。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～5 周齡 SPF 級 SD 雌性大鼠 4 只，體質量 200～220 g，購于成都達碩生物科技有限公司。
IL-4、BMP-2（R&D 公司，美國）；L-DMEM、H-DMEM、FBS（GIBCO 公司，美國）；1640 培養基（HyClone 公司，美國）；CMC（羧甲基化≥80%；大連美侖生物技術有限公司）；GO 粉末（南京先豐納米材料有限公司）；CD68 抗體、CD206 抗體（Abcam 公司，美國）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］、N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）（Sigma 公司，美國）；BCIP/NBT ALP 顯色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；AKP 測試盒（南京建成有限公司）。
倒置熒光顯微鏡、掃描電鏡（Zeiss 公司，德國）；傅立葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR；熱電公司，美國）。
1.2 凝膠制備與表征
1.2.1 凝膠制備
將 CMC 置于 PBS 配置成 2%（W/V）溶液，然后加入 GO 溶液，使 GO 濃度為 0.01 %（W/V），GO 溶液在混合前加入交聯劑（0.1 mol/LEDC 及 0.025 mol/L NHS）活化 15 min。分別加入 PBS、IL-4（1 μg/mL）、BMP-2（2 μg/mL）以及 IL-4（1 μg/mL）+BMP-2（2 μg/mL），搖晃 2 h 使其與 CMC 溶液充分混合。加入交聯劑，混合均勻后移至 96 孔板中靜置 30 min，待其充分成膠后分別得到單純 GO-CMC 凝膠以及負載 IL-4、BMP-2 及 IL-4+BMP-2 的 GO-CMC 凝膠，切割成厚度約 2 mm 的樣品備用。另直接于 CMC 溶液中加入交聯劑制備單純 CMC 凝膠。將制備的凝膠置于 PBS 溶液中浸泡 72 h，每 24 小時換液 1 次，去除多余交聯劑及其副產物。
1.2.2 GO-CMC 凝膠表征觀測
① 大體觀察：觀察單純 CMC 凝膠和單純 GO-CMC 凝膠的形狀、顏色。
② 掃描電鏡觀察：將單純 CMC 凝膠和單純 GO-CMC 凝膠置于–20℃ 冰箱中 2 h，然后轉移至–80℃ 冰箱過夜并凍干，切片、噴金處理后，掃描電鏡觀察樣品微觀結構。
③ FTIR 檢測：將單純 CMC 凝膠和單純 GO-CMC 凝膠凍干后研磨成粉末，溴化鉀壓片后，采用 FTIR 對樣品進行分析。
④ 緩釋性能：將負載不同因子的 GO-CMC 凝膠樣品切片，片厚 2 mm、直徑 17.8 mm，置于 4 mL EP 管中，加入 3 mL PBS 溶液（pH7.0），置于搖床（37℃、80 r/min）。分別于 1、3、5、7、14、28、42、56 d 吸取 PBS 溶液（–20℃ 保存），同時添加 3 mL 新的 PBS 溶液。待各時間點收集完成后，ELISA 檢測 PBS 溶液中 IL-4、BMP-2 含量，繪制緩釋曲線，計算各時間點緩釋率。
1.3 GO-CMC 凝膠誘導巨噬細胞 M2 型分化
1.3.1 大鼠巨噬細胞分離培養
取 4 只 SD 大鼠斷頸處死，每只腹腔注射 10 mL 預冷 H-DMEM，靜置 5～7 min。在劍突下最薄弱處作 2 mm 長切口打開腹腔，用無菌巴氏吸管從切口進入腹腔吸取淡黃色液體，置于離心管中，以半徑 12 cm、1 000 r/min 離心 10 min；棄上清，加入含 10%FBS 的 H-DMEM 培養基重懸，調整細胞密度為 1.5×106個/mL，接種于放置細胞爬片的 6 孔板中，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 2 h 后更換培養基，去除未貼壁細胞及其他細胞，剩下貼壁細胞即為巨噬細胞，用于后續實驗。
1.3.2 誘導分化培養及觀測
將巨噬細胞接種至有 24 孔爬片的 Transwell 孔板下室中，調整細胞密度為 2×105個/孔，2 h 后首次換液，去除未貼壁細胞；取制備的單純 GO-CMC 凝膠（對照組）以及負載 IL-4、BMP-2、IL-4+BMP-2 的 GO-CMC 凝膠（分別為 IL-4 組、BMP-2 組、IL-4+BMP-2 組），分別置于 Transwell 孔板上室中；同時設置空白對照（無材料和因子）和陽性對照（僅有 IL-4）。培養 24 h 后取出細胞爬片行 CD206 免疫熒光檢測，熒光顯微鏡下觀察藍色熒光（DAPI）和紅色熒光（羅丹明）雙染者即為 M2 型陽性細胞，200 倍鏡下隨機取 5 個視野計算陽性率。
1.4 GO-CMC 凝膠誘導 BMSCs 成骨分化
1.4.1 誘導培養及分組
取前期研究分離培養的第 3 代 BMSCs 接種至 24 孔 Transwell 孔板下室中，調整細胞密度為 2×104個/孔，待細胞融合至 60%～70% 時，更換為成骨誘導培養基；同時取單純 GO-CMC 凝膠（對照組）以及負載 IL-4、BMP-2、IL-4+BMP-2 的 GO-CMC 凝膠（分別為 IL-4 組、BMP-2 組、IL-4+BMP-2 組），分別置于 Transwell 孔板上室中，每隔 2 d 換液 1 次。以單純 BMSCs 成骨誘導培養作為空白組。
1.4.2 觀測指標
① 早期成骨觀測：誘導培養 10 d 各組取 3 孔細胞，參照 BCIP/NBT ALP 顯色試劑盒說明書染色，光鏡下觀察細胞染色情況。參照 AKP 測試盒操作說明書檢測 ALP 蛋白、總蛋白含量，并計算 ALP 蛋白/總蛋白比值。② 晚期成骨觀測：誘導培養 21 d 后各組取 3 孔細胞行茜素紅染色，光鏡下觀察鈣結節染色情況。然后用 10% 氯化十六烷基吡啶溶解，采用全自動酶標儀于 562 nm 波長處讀取吸光度（A）值。
1.5 統計學方法
采用 GraphPad8.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 凝膠表征觀測
2.1.1 大體觀察
單純 CMC 凝膠呈淡黃色，半透明狀，含水量高，折光性強；單純 GO-CMC 凝膠呈棕色，半透明狀，含水量高，折光性強。見圖 1。
圖1
大體觀察
a. CMC 凝膠；b. GO-CMC 凝膠
Figure1. General observationa. CMC hydrogel; b. GO-CMC hydrogel
2.1.2 掃描電鏡觀察
單純 CMC 凝膠為疏松多孔結構，孔壁較薄且光滑；孔徑較大，達（311.5±17.0）nm。單純 GO-CMC 凝膠孔徑及孔壁厚度與單純 CMC 凝膠相比無明顯變化，但內壁粗糙度增加、表面積增大，同時可以觀察到孔壁上附著的 GO。見圖 2。
圖2
掃描電鏡觀察
a. CMC 凝膠（×35）；b. GO-CMC 凝膠（×35）；c. GO-CMC 凝膠孔壁附著的 GO（×2 000）
Figure2. SEM observationa. CMC hydrogel (×35); b. GO-CMC hydrogel (×35); c. GO attached to the wall of GO-CMC hydrogel (×2 000)
2.1.3 FTIR 檢測
單純 CMC 凝膠和單純 GO-CMC 凝膠的紅外光譜中可見 1 648 cm–1和 1 590 cm–1波長處分別出現波峰變化，說明在化學交聯劑作用下發生了化學鍵的結合（CMC 自身形成、CMC 與 GO 之間形成），形成了典型的酰胺鍵（-NHCO-）Ⅰ和Ⅱ，表明 CMC 發生聚合形成凝膠。見圖 3。
圖3
凝膠 FTIR 檢測
Figure3.
FTIR analysis of hydrogel
2.1.4 負載因子凝膠的緩釋性能觀測
緩釋曲線提示各樣品均呈線性緩慢釋放因子，56 d 后緩釋率均未達 40%，未出現突釋現象。3 種負載不同因子的 GO-CMC 凝膠緩釋性能相似，其中負載 IL-4 的 GO-CMC 凝膠最大緩釋率為 38.3%，負載 BMP-2 的 GO-CMC 凝膠為 38.8%，負載 IL-4+BMP-2 的 GO-CMC 凝膠（IL-4 和 BMP-2 均值）為 37.2%。見圖 4。
圖4
負載不同因子的 GO-CMC 凝膠緩釋曲線
Figure4.
The sustained release curves of GO-CMC hydrogels loaded with different cytokines
2.2 GO-CMC 凝膠誘導巨噬細胞 M2 型分化
培養 24 h 后，IL-4 組、IL-4+BMP-2 組中可見大量 M2 型陽性細胞，陽性率分別為 88.67%±1.28%、89.20%±0.62%，組間差異無統計學意義（P>0.05）；對照組以及 BMP-2 組僅可見少量 M2 型陽性細胞，陽性率分別為 6.07%±0.57%、6.27%±0.91%，組間差異亦無統計學意義（P>0.05）；而 IL-4 組、IL-4+BMP-2 組與對照組、BMP-2 組間差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
各組 CD206 免疫熒光染色觀察
從左至右分別為光鏡（×100）下以及熒光顯微鏡（×100）下 DAPI 染色、羅丹明染色及二者重疊a. IL-4 組；b. BMP-2 組；c. IL-4+BMP-2 組；d. 對照組
Figure5. CD206 immunofluorescence staining of each groupFrom left to right for light microscope (×100) observation and DAPI staining, rhodamine staining, and the merge under fluorescence microscope (×100) a. IL-4 group; b. BMP-2 group; c. IL-4+BMP-2 group; d. Control group
2.3 GO-CMC 凝膠誘導 BMSCs 成骨分化
2.3.1 早期成骨觀測
成骨誘導培養 10 d 后，各組均可見藍紫色片狀沉積，其中 IL-4+BMP-2 組顏色最深、片狀沉積最大，其次分別為 BMP-2 組、IL-4 組、對照組及空白組。見圖 6。
圖6
成骨誘導培養 10 d 各組 ALP 染色觀察（×100）
a. 空白組；b. 對照組；c. IL-4 組；d. BMP-2 組；e. IL-4+BMP-2 組
Figure6. ALP staining observation of each group after osteogenic induction cultured for 10 days (×100)a. Blank group; b. Control group; c. IL-4 group; d. BMP-2 group; e. IL-4+BMP-2 group
半定量檢測顯示，空白組、對照組、IL-4 組、BMP-2 組、IL-4+BMP-2 組 ALP 蛋白/總蛋白比值分別為 1.43±0.11、1.42±0.02、1.58±0.03、1.72±0.02、1.96±0.08。IL-4+BMP-2 組及 BMP-2 組 ALP 蛋白/ 總蛋白比值明顯高于 IL-4 組、對照組及空白組，IL-4+BMP-2 組高于 BMP-2 組，IL-4 組高于對照組及空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）；對照組及空白組間差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.2 晚期成骨觀測
各組均可見橘紅色鈣化結節、成團聚集，其中 BMP-2 組以及 IL-4+BMP-2 組鈣化結節更多、橘紅色片狀更大。見圖 7。
圖7
成骨誘導培養 21 d 各組茜素紅染色觀察（×100）
a. 空白組；b. 對照組；c. IL-4 組；d. BMP-2 組；e. IL-4+BMP-2 組
Figure7. Alizarin red staining observation of each group after osteogenic induction cultured for 21 days (×100)a. Blank group; b. Control group; c. IL-4 group; d. BMP-2 group; e. IL-4+BMP-2 group
半定量檢測顯示，IL-4+BMP-2 組、BMP-2 組、IL-4 組、對照組及空白組A值分別為 0.377±0.009、0.327±0.007、0.255±0.006、0.228±0.015、0.214±0.009。IL-4+BMP-2 組及 BMP-2 組明顯高于 IL-4 組、對照組及空白組，IL-4+BMP-2 組高于 BMP-2 組，IL-4 組高于對照組及空白組，差異均有統計學意義（P<0.05）；對照組及空白組間差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
本研究通過 GO 負載 IL-4 和 BMP-2 兩種生物活性因子與 CMC 溶液混合，成功制備 GO-CMC 凝膠支架，其不僅能誘導巨噬細胞向 M2 型分化，同時緩釋的 IL-4 和 BMP-2 均可以在體外增強 BMSCs 成骨分化能力。近年來，骨誘導材料的免疫調節越來越受到重視，被認為是組織再生的重要影響因素[14-16]。CMC 作為天然多糖類，不僅具有良好的生物相容性及降解性，還具有抗菌特性，這些特性使其在生物材料工程領域得到廣泛應用[17]。GO 由于表面含有大量羥基、羧基等功能基團，被修飾后能作為載體，負載多種生物蛋白分子，在保持其生物活性同時表現出緩慢釋放的特性[18]。表征觀察顯示該凝膠支架具有疏松多孔結構，孔徑在 300 nm 左右，有利于營養物質的交換及代謝產物的排出，同時其內壁粗糙，增加了細胞及蛋白分子的黏附面積；FTIR 檢測提示在 1 648 cm?1和 1 590 cm?1波長處分別形成了典型的酰胺鍵（-NHCO-）的波峰變化，表明 GO 和 CMC 或者其自身發生了交聯，產生了新的化學鍵，形成了穩定的凝膠結構。
骨骼系統與免疫系統形成了一個新的研究方向，稱為“骨免疫學”。例如，免疫細胞產生的細胞因子（如 TGF-β 和 IL-4）在分化早期可誘導成骨細胞遷移、增殖或分泌骨細胞外基質，而 IL-1β 和 TNF-α 可抑制成骨細胞分化[19]。基于此，本研究應用 IL-4 誘導巨噬細胞向 M2 型分化，從而達到促進 BMSCs 增殖和成骨分化的目的。Zheng 等[20]比較了不同劑量 IL-4 誘導巨噬細胞分化的效果，以期提供一種精確的主動免疫調節機制，從而達到增強成骨和成血管目的。研究發現當單次 IL-4 用量為 10 ng 時，巨噬細胞分化為 M1 型與 M2 型比例最適合，促進成骨和成血管作用也最強。本研究選擇 IL-4 濃度為 1 μg/mL，單個凝膠支架單次緩釋劑量與 Zheng 等[20]實驗劑量相似。BMP-2 作為成骨誘導因子的研究很多，不同文獻報道的使用劑量各不相 同[21-22]，由于 GO 負載因子后呈現緩慢釋放趨勢，因此本研究采用 BMP-2 的使用劑量為 2 μg/mL，與 Lee 等[12]實驗研究劑量一致。研究表明，GO 負載 BMP-2 緩慢釋放的特性不僅可以持續釋放因子作用于目的細胞，避免突釋所帶來的不良效果，同時也可減少用量，進而減少副作用并降低成本[1]。
本研究 GO-CMC 凝膠誘導巨噬細胞 M2 型分化檢測結果顯示，負載 IL-4 的凝膠支架組（IL-4、IL-4+BMP-2 組）均成功誘導巨噬細胞 M2 型分化，表明凝膠支架在與巨噬細胞共培養中釋放一定量 IL-4，能誘導巨噬細胞向 M2 型分化，為組織修復提供有力的細胞微環境，為后續體內實驗奠定了基礎。有研究證實巨噬細胞可以通過分泌多種因子，如 BMP-2、TNF-α、抑瘤素等，調控骨形成[23-25]。因此，下一步需要對 IL-4 誘導巨噬細胞 M2 型分化和 BMSCs 的共培養體系進行實驗研究，探索其增強 BMSCs 成骨分化形成的機制。
目前，M0、M1、M2 型巨噬細胞對 BMSCs 成骨分化的影響仍存在爭議[26]。研究發現盡管 M1 型巨噬細胞在成骨早期和中期顯著促進共培養的 MSCs 成骨分化，但未觀察到其對 MSCs 礦化作用的增強[23]。與此相反，M2 型巨噬細胞增強了共培養的 MSCs 礦化，并且這種作用和巨噬細胞與 MSCs 的比例成正相關。此外，BMP-2 和抑瘤素參與不同亞型巨噬細胞和 MSCs 之間的相互作用，從而刺激后者的成骨分化。另有研究發現，M0 型巨噬細胞增強細胞的成骨能力，但與 M1 型和 M2 型巨噬細胞相比，細胞形成片層的能力受損[27]。相比之下，M2 型巨噬細胞不僅能促進培養細胞的成骨分化潛能，還表現出形成穩健細胞片層的能力。
通過對 BMSCs 成骨誘導研究，我們發現 IL-4+BMP-2 組 ALP 染色最深、片狀沉積最大，半定量檢測結果提示其早期成骨蛋白含量最高；而茜素紅染色同樣表明負載兩種因子的凝膠誘導 BMSCs 成骨分化作用明顯強于單一因子或不含因子凝膠，提示 IL-4 的參與提高了 BMSCs 的成骨分化能力，而具體機制目前尚不清楚，已成為研究熱點[1，28-30]。
綜上述，本研究通過 GO 負載 IL-4 和 BMP-2，與 CMC 構建復合凝膠支架，體外實驗表明該支架不僅可以誘導巨噬細胞 M2 型分化，并且釋放的兩種因子均能增強 BMSCs 成骨分化能力，為體內實驗奠定了良好基礎，同時為骨缺損修復及骨免疫調節提供了新的策略。但目前對于巨噬細胞調控 BMSCs 成骨分化的機制仍不明確，兩者相互關系仍需進一步探索，對于骨誘導生物材料精確的免疫調控也需進一步研究。
作者貢獻：鄒敏負責實驗設計及實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；孫嘉辰負責實驗設計及實施、統計分析、文章撰寫；項舟審核實驗內容，對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準（2020072A）。
