目的 探討葡萄糖轉運載體（GLUT）-4是否參與骨髓間充質干細胞（MSCs）的葡萄糖轉運以及Akt基因轉染提高MSCs耐缺氧能力是否與GLUT-4易位和表達有關。方法 將經Akt基因轉染和未轉染的MSCs均行常氧（5% CO2）和缺氧（94% N2、1%O2和5%CO2）37 ℃孵育8 h。放射同位素法檢測氚標-脫氧葡萄糖（3H-G）的攝取量，免疫細胞化學染色、Western blot和RT-PCR分別檢測GLUT-4的蛋白質和mRNA表達。結果 ①缺氧轉染組的3H-G攝取量是缺氧非轉染組的（1.39±0.13）倍（P＜0.05），但仍低于常氧非轉染組（P＜0.05）。②MSCs在常氧或缺氧、Akt基因轉染或無轉染的條件下均可表達GLUT-4蛋白。與常氧非轉染組比較，缺氧非轉染組GLUT-4 mRNA和蛋白的表達水平明顯降低（P＜0.05）。③與缺氧非轉染組比較，缺氧轉染組的GLUT-4 mRNA〔（1.756±0.152）倍〕和蛋白〔細胞總GLUT-4蛋白（1.653±0.312）倍,細胞膜GLUT-4蛋白（2.041±0.258）倍〕的表達水平明顯提高（P＜0.05），且GLUT-4蛋白易位明顯； 但與常氧非轉染組比較，其GLUT-4 mRNA和蛋白的表達水平仍較低（P＜0.05）。④MSCs的3H-G攝取量與細胞膜中GLUT-4蛋白的表達呈正相關（r=0.415,P=0.001）。結論 GLUT-4可能參與MSCs的葡萄糖轉運，Akt基因提高MSCs耐缺氧能力可能與提高GLUT-4的表達和易位有關。
目的 探討缺血后處理對老年大鼠離體心臟缺血-再灌注損傷的影響及其與P-Akt的相關性。 方法21～23個月齡 （老年鼠） 健康SD大鼠30只，雌雄不拘，體重450～500 g，分為空白對照組（N組）、缺血-再灌注組（IR組）和缺血后處理組 （Post組） 3組，每組10只，觀測心臟冠狀動脈流量、心肌梗死范圍、磷酸化的蛋白激酶B （P-Akt）表達、心肌和線粒體的改變。 結果 Post組較IR組冠狀動脈流量明顯增加 〔（6.4±1.2） ml/min vs. （3.1±1.2） ml/min，P＜0. 01〕，心肌梗死范圍明顯減少（35.0%±2.0% vs. 55.7%±3.6%），P-Akt的表達明顯增強，心肌纖維和線粒體的完整程度明顯較好。 結論 缺血后處理對老年大鼠離體心臟具有顯著的保護作用，這在一定程度與P-Akt激活有關。
目的研究caveolin-1對胰腺癌Panc1細胞在體外生長和增殖的影響，并初步探討其機理。方法選用人類胰腺癌Panc1細胞，通過基因轉染技術培育過表達caveolin-1細胞株Panc1/cav-1作為實驗組，空載體細胞株Panc1/vec和親本細胞株Panc1作為對照組。Western blot方法檢測各組細胞內caveolin-1、Akt和pAkt的表達，繪制細胞生長曲線并計算細胞倍增時間，流式細胞儀分析細胞周期，軟瓊脂集落形成實驗檢測細胞增殖克隆的能力。結果①caveolin-1在實驗組細胞中穩定表達，其表達量明顯高于對照組細胞(Plt;0.01)，而對照組的Panc1/vec細胞和Panc1細胞之間差異無統計學意義(Pgt;0.05)。②實驗組細胞的生長速度明顯慢于對照組細胞(Plt;0.05)，其倍增時間明顯長于對照組細胞(Plt;0.01)。③細胞周期顯示，實驗組細胞被抑制于G0/G1期(Plt;0.05)，進入S期的細胞比率明顯減少(Plt;0.01)，實驗組細胞的增殖指數較對照組明顯降低(Plt;0.01)。④實驗組細胞在軟瓊脂中形成的集落數目較對照組明顯減少(Plt;0.01)，體積較小。⑤實驗組細胞中Akt表達量與對照組之間差異無統計學意義(Pgt;0.05)，而實驗組細胞中p-Akt表達量明顯低于對照組(Plt;0.05)。結論caveolin-1通過抑制PI3K/Akt信號激活抑制Panc1細胞生長和增殖。
目的 克隆構建綠色熒光蛋白( GFP) / Akt 表達載體,觀察其在鼠骨髓間充質干細胞(MSCs) 中的表達和定位,并探討干細胞因子( SCF) 通過PI3-Akt 途徑對轉染p EGFP-C1/ Akt 的MSCs 中c-kit 、Akt 和VEGFmRNA及蛋白表達的影響。方法 采用酶切法將Akt 重組于GFP 表達載體中,經酶切序列鑒定后,將該重組質粒GFP/ Akt 及GFP 空質粒通過脂質體轉染骨髓MSCs ; 熒光顯微鏡觀察其轉染及在細胞中的分布; 分別采用Western blot 和反轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR) 方法檢測p EGFP-C1 和p EGFP-C1/ Akt 轉染MSCs 后對c-kit 、Akt及VEGF mRNA 和蛋白表達的影響, p EGFP-C1/ Akt 轉染MSCs 后不同濃度SCF 對c-kit 、Akt 及VEGFmRNA 和蛋白表達的影響。結果 GFP/ Akt 基因表達載體經酶切鑒定和測序分析后確認構建成功,并在MSCs中表達。熒光顯微鏡下見p EGFP-C1 轉染后,綠色熒光均勻分布于整個細胞中; p EGFP-C1/ Akt 轉染后,綠色熒光分布于細胞質中。與p EGFP-C1 組相比較,p EGFP-C1/ Akt 轉染組Akt 及VEGF 的mRNA 和蛋白表達均明顯增強( Plt; 0. 05) , c-kit mRNA 和蛋白表達則無明顯變化( P gt; 0. 05) 。加入SCF 后其能增強實驗組( SCF + p EGFP-C1/ Akt) 和對照組(SCF + p EGFP-C1) 中c-kit 、Akt 及VEGF 的mRNA 和蛋白表達,并且隨著SCF 的濃度增高該作用則越明顯( Plt; 0. 05) ; 與對照組相比較,實驗組c-kit mRNA 和蛋白的表達無明顯變化( P gt; 0. 05) ,而Akt 和VEGF mRNA 和蛋白表達則明顯增強( Plt; 0. 01) 。結論 成功構建GFP/ Akt 融合基因表達載體在MSCs 中表達,可誘導Akt 及VEGF mRNA 和蛋白的表達; SCF 可能通過PI3/ Akt 途徑刺激c2kit 、Akt 及VEGF mRNA 和蛋白的表達。
目的 探討經肌肉注射轉染pEGFP-C1/Akt的鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）對后肢缺血大鼠血管生成的影響。方法 Wistar大鼠30只，制成雙后肢缺血模型，雙盲法隨機分為基因治療組（肌注經pEGFP-C1/Akt轉染的MSCs）、非基因治療組（肌注MSCs）及對照組（肌注PBS液）。造模前、造膜后即刻及MSCs移植后1~7 d內,每天用紅外線皮溫儀測定大鼠后肢皮溫變化。28 d時經動脈造影觀察后肢血管生成情況； 免疫組化染色檢測后肢毛細血管密度； 逆轉錄-多聚酶鏈反應（RT-PCR）和Western blot法檢測后肢肌肉組織中Akt及血管內皮細胞生長因子（VEGF）的 mRNA和蛋白的表達。結果 移植3 d后基因治療組大鼠后肢皮溫升高明顯。28 d時經動脈造影觀察基因治療組后肢側支血管生成明顯； 熒光顯微鏡觀察有綠色熒光細胞在基因治療組的內收肌和半膜肌分布。毛細血管密度： 基因治療組為（7.1±0.3）個/高倍鏡，非基因治療組為（4.2±0.4）個/高倍鏡，對照組為（1.3±0.2）個/高倍鏡，各組間差異均有統計學意義（P＜0.01）。Akt及VEGF的 mRNA和蛋白的表達分析: 基因治療組Akt mRNA(2.44±0.14)和蛋白（1.12±0.13）及VEGF mRNA（1.11±0.11）和蛋白（0.97±0.13）表達水平均明顯高于非基因治療組Akt mRNA(1.58±0.13)和蛋白（0.78±0.12）及VEGF mRNA（0.78±0.14）和蛋白（0.67±0.11）以及對照組Akt mRNA(0.64±0.11)和蛋白（0.36±0.12）及VEGF mRNA（0.56±0.11）和蛋白（0.33±0.13）的表達水平（P＜0.01），后2組間比較差異亦均有統計學意義（P＜0.01）。結論 pEGFP-C1/Akt體外轉染骨髓MSCs促進后肢缺血大鼠血管生成的效果優于單純MSCs治療，為基因轉染MSCs治療缺血性疾病提供可能。
目的探討Roux-en-Y胃旁路術（RYGB）改善2型糖尿病大鼠（Goto-Kakizaki大鼠，GK大鼠）骨骼肌胰島素抵抗的可能機制。 方法30只GK大鼠隨機分為GK-RYGB組、GK-假手術組、GK-對照組，另取10只Wistar大鼠作為正常對照組。術后28 d時處死實驗動物。ELISA法檢測血漿ghrelin濃度，免疫印跡法檢測骨骼肌組織的磷酸化（p）-/總（t）-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及細胞膜（m）-/t-GLUT4蛋白的相對表達量，實時熒光定量PCR法檢測骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達。 結果①血漿ghrelin濃度在正常對照組明顯高于GK-對照組（P＜0.01）和GK-假手術組（P＜0.01）；GK-RYGB組也明顯高于GK-對照組（P＜0.01）及GK-假手術組（P＜0.01），但與正常對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。②p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白相對表達量在正常對照組均較GK-對照組（分別P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01）和GK-假手術組（分別P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01）明顯上升；GK-RYGB組亦較GK-對照組（分別P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01）和GK-假手術組（分別P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01）均分別明顯上升。③骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達在正常對照組均較GK-對照組（分別P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05）和GK-假手術組（分別P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05）明顯上升；GK-RYGB組較GK-對照組（分別P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05）和GK-假手術組（分別P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05）也均分別明顯上升。 結論①RYGB術后GK大鼠血漿ghrelin水平顯著升高。②RYGB術能夠上調GK大鼠骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB mRNA和磷酸化蛋白的表達，并上調GLUT4的轉錄和翻譯，促使更多的GLUT4在細胞膜表達，增加骨骼肌組織對葡萄糖的攝取，從而改善骨骼肌組織的胰島素抵抗。
目的探討磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路對重癥急性胰腺炎（SAP）致肝臟損傷的影響。 方法健康雄性SD大鼠40只，按隨機數字表法隨機均分為4組（n=10）：假手術組、SAP組、PI3K抑制劑LY294002組（簡稱LY294002組）、mTOR激酶抑制劑rapamycin組（簡稱rapamycin組）。采用逆行胰膽管注射5%牛磺膽酸鈉1 mL/kg方法制備SAP模型。各組大鼠于造模后6 h下腔靜脈取血檢測血淀粉酶（AMY）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平，觀察肝臟組織病理學變化，TUNEL法檢測肝臟細胞凋亡以計算凋亡指數（AI），Western blot法檢測肝臟組織中Akt、磷酸化(p)-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達情況。 結果①血清AMY、ALT、AST水平及AI：與假手術組相比，其余3組AMY、ALT、AST水平及AI均明顯升高（P＜0.05）；與SAP組相比，LY294002組和rapamycin組這4個指標值均明顯降低（P＜0.05）。②肝臟組織病理學表現：與假手術組相比，其余3組肝臟組織損傷嚴重；與SAP組相比，LY294002組和rapamycin組肝臟組織損傷程度有所改善。③Akt、mTOR、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平：與假手術組比較，其余3組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與SAP組相比，LY294002組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白水平明顯降低（P＜0.05），rapamycin組p-mTOR/mTOR蛋白水平明顯下降（P＜0.05），但p-Akt/Akt蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05）。 結論PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活可能是SAP致肝臟損傷發生的原因之一，抑制該信號通路有可能成為控制SAP發展并減輕肝臟損傷的新途徑。
目的探討重組慢病毒（lentivirus，LVs）介導Akt1基因轉染大鼠BMSCs能否提高細胞缺氧耐受能力，為提高干細胞移植治療心肌梗死效果提供理論依據。 方法以LVs作為轉染載體，增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）為標記，構建攜帶Akt1基因的pLVX-EGFP-3FLAG病毒載體。取第3代3～5周齡SD大鼠BMSCs分別轉染pLVX-EGFP空白病毒液（B組）和pLVX-EGFP-3FLAG病毒液（C組），以未轉染病毒的BMSCs為空白對照組（A組）。轉染后2～3 d熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光表達情況，并于48 h時采用Western blot法檢測B、C組Akt1蛋白表達情況。將B、C組培養的BMSCs分別置于94% N2、1% O2和5% CO2缺氧箱進行缺氧干預（分別為B1、C1組），取B1、C1組缺氧干預0、3、6、9、12 h的細胞以膜聯蛋白V-FITC/碘化丙啶雙染法行流式細胞儀分析細胞凋亡率和死亡率、MTT法分析細胞增殖情況、Western blot法檢測凋亡相關基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）表達情況。 結果轉染后A組熒光顯微鏡下未見綠色熒光表達，B、C組可見明顯綠色熒光，轉染效率約60%；Western blot可檢測到B、C組Akt1表達，且C組Akt1表達明顯高于B組（t=17.525，P=0.013）。B1組缺氧干預后各時間點細胞凋亡率和死亡率均逐漸增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；C1組細胞凋亡率和死亡率在缺氧干預后3 h短暫下降，之后逐漸增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。除0 h外，缺氧干預各時間點C1組細胞凋亡率和死亡率均顯著低于B1組，差異有統計學意義（P＜0.05）。MTT法檢測示，常氧條件下B、C組各時間點吸光度（A）值均顯著高于缺氧條件下B1、C1組（P＜0.05），C組各時間點A值均顯著高于B組（P＜0.05），缺氧干預后6、9、12 h B1組A值顯著低于C1組（P＜0.05）。Western blot法檢測示，與B1組比較，C1組缺氧干預各時間點Caspase-3表達均顯著下調（P＜0.05）。 結論通過重組LVs介導Akt1基因轉染可通過抑制凋亡顯著提高BMSCs的缺氧耐受能力，從而為改善干細胞移植治療心肌梗死效果提供新思路。
本研究旨在探索 miR-130a-3p 對心肌細胞肥大的作用及其可能機制。通過胸主動脈縮窄法（TAC）構建壓力超負荷所致心肌肥厚小鼠模型。使用去甲腎上腺素（NE）刺激 SD 乳鼠原代心肌細胞（NRCMs）及 H9c2 大鼠心肌細胞系，誘導這兩種心肌細胞發生肥大表型轉變。檢測 miR-130a-3p 的表達變化，并進一步探索其對心肌細胞肥大是否有調控作用。結果表明，miR-130a-3p 在肥厚心肌組織、肥大 NRCMs 及 H9c2 細胞中的表達均明顯降低。給予 miR-130a-3p mimics 使其過表達后，H9c2 細胞中肥大標志基因心房利鈉肽（ANP）、腦利鈉肽（BNP）和肌球蛋白重鏈 β（β-MHC）的表達較對照組（mimics N.C.+NE 組）明顯下調，且細胞面積明顯減小。而給予 miR-130a-3p inhibitor 抑制其表達后，肥大心肌細胞中 ANP、BNP、β-MHC 的表達進一步上升，且細胞面積進一步增加。Western blot 檢測發現，過表達 miR-130a-3p 后心肌細胞中磷酸化 Akt 和磷酸化 mTOR 的表達水平下調。以上結果提示，miR-130a-3p mimics 可緩解心肌細胞肥大的程度；其 inhibitor 則可使心肌細胞肥大進一步加劇。過表達 miR-130a-3p 可能通過影響 Akt 通路來緩解 H9c2 心肌細胞肥大的程度。
目的研究BMSCs成骨分化過程中環指蛋白11（ring finger protein 11，RNF11）對Akt信號通路的調節作用，為進一步闡明BMSCs成骨分化機制和用于臨床治療提供思路。 方法從健康人體新鮮骨髓中分離培養BMSCs并傳代，取第4代細胞經流式細胞術，成骨、成軟骨和成脂誘導培養鑒定后用于實驗。BMSCs成骨誘導分化培養0～14 d，通過茜素紅染色和ALP染色檢測其成骨分化程度，并用Western blot法檢測RNF11蛋白表達。取第4代BMSCs，分為空白對照組（A組）、空載慢病毒（Lv-NC）組（B組）和敲低RNF11（Lv-ShRNF11）組（C組），成骨誘導分化培養0～14 d，采用Western blot檢測RNF11蛋白表達，茜素紅染色和ALP染色檢測其成骨分化程度，14 d實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測BMSCs成骨標志物Runx2、骨鈣素（osteocalcin，OCN）及骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的mRNA相對表達量；采用Western blot檢測Akt、Smad1/5/8及β-catenin信號通路蛋白相對表達量，以磷酸化前后比值表示。為研究RNF11對Akt信號通路的影響機制，取第4代BMSCs分為Lv-NC轉染組（A1組）、Lv-ShRNF11轉染組（B1組）和添加Akt信號通路激活劑SC79的Lv-ShRNF11轉染組（C1組），14 d時采用Western blot檢測RNF11和Akt信號通路蛋白相對表達量，茜素紅染色、ALP染色及qRT-PCR檢測成骨相關指標。結果流式細胞術及成骨、成軟骨和成脂誘導培養鑒定顯示分離培養細胞為BMSCs。RNF11蛋白相對表達量隨成骨分化時間延長而逐漸增加（P<0.05）；下調RNF11后，茜素紅和ALP染色示C組相較于A、B組BMSCs成骨分化程度降低，qRT-PCR檢測示Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量減少（P<0.05）。隨成骨分化時間延長，RNF11與Akt信號通路蛋白相對表達量均上升（P<0.05）。下調RNF11后，C組相較于A、B組，其Akt信號通路蛋白相對表達量顯著降低（P<0.05），而對Smad1/5/8以及β-catenin信號通路蛋白相對表達量無明顯影響（P>0.05）。B1、C1組相較于A1組，其RNF11蛋白相對表達量減少（P<0.05），B1組相較于A1、C1組，其Akt信號通路蛋白相對表達量降低（P<0.05）；茜素紅與ALP染色示C1組BMSCs成骨分化程度稍低于A1組（P>0.05），而明顯高于B1組（P<0.05）；qRT-PCR檢測示C1組Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量稍低于A1組（P>0.05），而明顯高于B1組（P<0.05）。結論RNF11通過正向調控Akt信號通路激活水平促進BMSCs向成骨細胞分化。RNF11可作為提高BMSCs修復骨缺損療效以及治療骨代謝病的潛在靶點。