引用本文： 陳海宇, 鄭富臻, 翁國星, 鮑家銀, 黃杰, 嚴李程, 柯秋晴. 銀杏內酯B對缺氧/復氧心肌細胞Caspase-3/PTEN/Akt通路及細胞增殖凋亡的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2022, 29(12): 1647-1652. doi: 10.7507/1007-4848.202109047 復制
心肌梗死（myocardial infarction，MI）仍然是全球發病和死亡的主要原因，MI可因長期缺血缺氧而導致心肌損傷或死亡，盡管最近MI的治療取得了進展，MI急性期的死亡率約為10%[1]。恢復血供（即再灌注）仍是目前MI的標準治療方法，但越來越多的證據表明，再灌注后立即產生的自由基或活性氧（reactive oxygen species，ROS）會誘導心肌細胞凋亡，加速心肌缺血-再灌注損傷的發生和發展[2]。因此，尋找有效的抗凋亡藥物對心肌缺血-再灌注損傷的治療是有益的。許多實驗研究表明，多種天然產品對心血管疾病具有潛在的藥理益處。銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）是銀杏葉提取物，已被鑒定為一種多功能生物活性天然產物，可以抑制細胞凋亡、抗血小板聚集等多種作用，被廣泛用于治療心腦血管疾病，但其具體機制卻不明確[3]。最近研究[4]表明，缺血-再灌注誘導心肌細胞凋亡，這是缺血性心臟病惡化的重要特征。因此，抑制心肌細胞凋亡可有效降低心肌缺血-再灌注損傷的程度。10號染色體缺失張力蛋白同源的磷酸酶基因（chromosome 10 deletion phosphatase-tension protein homologue，PTEN）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路在各種生理過程中都起著至關重要的作用，通過調控氧化應激，對心肌缺血-再灌注損傷具有保護作用[5]。Akt的激活導致下游效應分子糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）磷酸化，這被認為是心臟保護的重要參與者[6]。因此，本研究探討GB在心肌H9C2細胞抗缺氧/復氧誘導的細胞凋亡中的作用，并對GB發揮其功能的潛在分子機制進行了研究，為GB臨床治療缺血-再灌注提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
GB和卡維地洛（美國 Sigma 公司，純度≥90%，批號：A606617、72965-09-3）；大鼠胚胎心肌H9C2細胞（中國科學院上海細胞庫，批號：CM-1250）；DMEM高糖培養基、DMEM無糖培養基和胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：160044、160047、190045）；細胞計數試劑盒8 （cell count kit 8，CCK-8）（美國Amresco公司，規格：96T，批號：M8180-4）；AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，批號：CA1020）； 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：E004-1-1、A020-2-2、A001-3-2）；2，7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2，7-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）；RIPA裂解液（上海生工生物工程有限公司，批號：175056）；PTEN、Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和GADPH抗體（美國Santa Cruz公司，批號：SC-5182、SC-3967、SC-1818、SC-5497、SC-1573）；山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：115-58-264）；HBS-1096B型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；BD垂直電泳儀和BD FACSCanto型流式細胞儀（美國BD公司）；凝膠成像儀（美國UVP公司）。
1.2 細胞培養及實驗分組
用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基在37℃、5% CO2條件下培養H9C2細胞，取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為對照組、缺氧復氧組、GB低劑量組、GB高劑量組和卡維地洛組。對照組用無血清DMEM高糖培養基在37℃、5% CO2條件下培養28 h。其余各組用無血清DMEM無糖培養基在37℃、1% O2/5% CO2/94% N2的厭氧室中維持4 h，隨后轉移到無血清DMEM高糖培養基中，在37℃常氧條件下（5% CO2、95%空氣）培養24 h[7]；在缺氧/復氧前1 h，GB低劑量組和GB高劑量組分別用終濃度為50 μmol/L和200 μmol/L的GB預處理，卡維地洛組用終濃度為10 μmol/L的卡維地洛預處理[8-9]。各組均重復6次。
1.3 CCK-8 法檢測細胞增殖率
按1.2中的方法培養及干預細胞，在實驗結束前4 h向培養板中加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養4 h，用酶標儀測定吸光度值，計算細胞增殖率（細胞增殖率=實驗組OD值/對照組OD值×100%），OD為光吸收值。
1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率
按1.2中的方法培養及干預細胞，用AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。
1.5 LDH、MDA和ROS水平的測定
按1.2中的方法培養及干預細胞，加入2 mL磷酸鹽緩沖液，用細胞超聲破碎儀處理30 s，12 000 g離心10 min，收集上清液，按試劑盒說明書檢測細胞中LDH和MDA水平；采用DCFH-DA探針聯合酶標儀法檢測細胞內ROS水平。
1.6 Western blotting法檢測PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平
按1.2中的方法培養及干預細胞，棄培養基，根據細胞量加入RIPA裂解液，裂解2 h；4℃、10 000 rpm，離心15 min，取上清，加入1/5體積的5×Buffer，沸水變性，電泳（每孔上樣量為30 μg），將膜與PTEN（1∶300）、Akt（1∶200）、p-Akt（1∶500）、Caspase-3（1∶400）和GADPH（1∶1000）抗體進行孵育，4℃過夜，將二抗（1∶5 000）在室溫下孵育30 min。顯色，采集圖像進行分析，以GADPH作為內參。
1.7 統計學分析
正態分布的計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，用單因素方差分析進行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義，統計軟件為SPSS 23.0。
2 結果
2.1 GB對H9C2細胞增殖和凋亡的影響
與對照組比較，其余各組H9C2細胞增殖率降低、細胞凋亡率增加（P<0.05）；與缺氧復氧組比較，各GB劑量組和卡維地洛組H9C2細胞增殖率增加，細胞凋亡率降低，各GB劑量組呈劑量依賴性，但GB的作用強度不如卡維地洛（P<0.05）；見表1和圖1。
表1
GB對H9C2細胞增殖和凋亡的影響（
）
圖1
GB對H9C2細胞增殖和凋亡影響的流式細胞圖
a：對照組；b：缺氧復氧組；C：GB 低劑量組；D：GB 高劑量組；E：卡維地洛組；GB：銀杏內酯 B
2.2 GB對H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平的影響
與對照組比較，其余各組H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平升高（P<0.05）；與缺氧復氧組比較，各GB劑量組和卡維地洛組H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平降低，各GB劑量組呈劑量依賴性，但GB的作用強度不如卡維地洛（P<0.05）；見表2和圖2。
表2
GB對H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平的影響（
）
圖2
GB對H9C2細胞中ROS水平的影響（DCFH-DA 染色，×400）
a：對照組；b：缺氧復氧組；c：GB低劑量組；d：GB高劑量組；e：卡維地洛組；GB：銀杏內酯 B；ROS：活性氧
2.3 GB對H9C2細胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平的影響
與對照組比較，其余各組H9C2細胞中PTEN、Akt和p-Akt水平降低，Caspase-3水平升高（P<0.05）；與缺氧復氧組比較，各GB劑量組和卡維地洛組H9C2細胞中PTEN、Akt和p-Akt水平升高，Caspase-3水平降低，各GB劑量組呈劑量依賴性，但GB的作用強度不如卡維地洛（P<0.05）；見表3和圖3。
表3
GB對H9C2細胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平的影響（
，與GADPH的比值）
圖3
GB對H9C2細胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平影響的蛋白印跡圖
a：對照組；b：缺氧復氧組；c：GB低劑量組；d：GB高劑量組；e：卡維地洛組；GB：銀杏內酯 B；PTEN：10號染色體缺失張力蛋白同源的磷酸酶基因；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化 Akt；Caspase-3：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3
3 討論
缺血性心臟病是一種死亡率較高的疾病，嚴重危害人類的健康，給患者以及家庭、社會帶來沉重的經濟負擔，通常采用溶栓等手段，迅速恢復患者冠狀動脈血液的循環流動是臨床治療缺血性心臟病的關鍵[10]。研究[11]發現，血流重新灌注缺血心肌組織后會使心臟產生新的損傷—缺血-再灌注損傷。心肌缺血-再灌注損傷與細胞增殖、凋亡以及氧化損傷、心肌線粒體能量代謝等有關[12]。因此，尋找抗缺氧/復氧心肌細胞凋亡及氧化損傷的藥物對改善患者預后至關重要。
近年來，GB對器官缺血-再灌注損傷的治療作用引起了研究者的關注。GB通過抗炎、抗氧化應激和抗凋亡途徑發揮治療作用。有研究[13]已證明，GB可減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷，但其作用機制尚不清楚。心肌缺血-再灌注損傷的病理生理機制與許多因素有關，例如大量的自由基產生、細胞內鈣超載、氧化應激增加和細胞凋亡等。目前，更多研究[14]顯示，缺血-再灌注誘導的細胞損傷的關鍵事件是細胞凋亡。因此，尋找可以抑制心肌細胞凋亡的藥物對于預防缺血-再灌注誘導的細胞損傷很重要。卡維地洛是第三代β受體阻滯劑，能顯著改善MI、心力衰竭患者的預后，但其減輕心肌細胞缺血-再灌注損傷的分子機制尚不清楚[15]。本研究結果顯示，GB改善了心肌缺氧/復氧損傷后的細胞活力，并抑制了心肌缺血-再灌注損傷后H9C2細胞凋亡。雖然其作用強度不如卡維他洛，但作為一種新藥開發有積極的意義。
心肌缺氧涉及氧化應激，抗氧化劑有助于限制缺血-再灌注期間的心臟損傷。MDA和LDH是過氧化的多不飽和脂肪酸的分解產物，主要被視為脂質過氧化的指標。MDA和LDH水平已用于評估缺血-再灌注心肌的氧損傷[16]。此外，ROS被稱為細胞內信號分子，在引起凋亡性細胞死亡中起著重要作用。研究[17]表明，缺血-再灌注可以誘導ROS的產生和氧化應激。然后，ROS與細胞膜脂質相互作用并產生MDA，從而損害心臟功能并誘發心肌細胞損傷。因此，抑制ROS形成的藥物對再灌注損傷具有心臟保護作用。本研究結果顯示，GB預處理可顯著降低心肌缺氧/復氧損傷后H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平。這些數據表明，GB的心肌保護作用部分歸因于其抗氧化作用。
凋亡是心肌細胞缺血-再灌注損傷的標志。氧化應激的特征在于過量的ROS產生。如果持續存在氧化損傷，則可能會對細胞造成不可逆轉的損害，最終導致細胞凋亡[18]。B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族參與了缺氧/復氧誘導的細胞凋亡。Bcl-2是一種有效的凋亡抑制劑，可抑制線粒體的降解以及隨后的細胞色素C（Cytochrome C，CytC）釋放，促進Caspase-3活化，最終導致凋亡性細胞死亡[19]。本研究結果顯示，GB預處理可顯著降低缺氧/復氧誘導的H9C2細胞中Caspase-3表達。因此，GB的抗凋亡特性可能有助于對抗心肌缺血-再灌注損傷。
PTEN/Akt通路的激活在減輕心肌缺血-再灌注損傷中起關鍵作用。研究[20]發現，PTEN在心肌重塑、心肌纖維化、心肌肥大和心肌缺血-再灌注損傷中起重要作用。PTEN通過磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）來調控Akt活性，從而通過PI3K/Akt途徑調控生存信號[21]。PTEN過表達抑制細胞G1期停滯，促進細胞增殖[22]。此外，PTEN誘導凋亡的另一潛在機制是PTEN介導的凋亡伴隨Caspase-3活化[23]。Akt的激活導致下游效應分子GSK-3β在Ser 9上的磷酸化，這被認為是心臟保護的重要參與者。Akt的激活可能通過激活下游底物（Bcl-2）來產生抗凋亡功能[24]。研究[25]發現，紫草素對肝臟缺血-再灌注損傷的有益作用是通過激活PTEN/Akt通路傳導來實現的。本研究結果顯示，GB預處理可激活缺氧/復氧誘導H9C2細胞的Caspase-3/PTEN/Akt通路。
綜上所述，GB通過激活Caspase-3/PTEN/Akt通路，降低氧化應激和細胞凋亡，促進細胞增殖來減輕心肌缺血-再灌注損傷，為GB治療心肌缺血-再灌注損傷提供理論依據。但由于缺血-再灌注損傷的調控機制是一個網絡系統，Caspase-3/PTEN/Akt通路可能只是其中一條，可能還存在其它信號通路進行調控，本結論還需進一步研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：陳海宇、鄭富臻負責研究設計，獲取、分析或解釋研究數據；翁國星、鮑家銀負責研究設計；黃杰、嚴李程獲取、分析或解釋研究數據；柯秋晴負責研究設計，獲取、分析或解釋研究數據，全面負責本文，在投稿、同行評議及出版過程中主要負責與期刊聯系；陳海宇、鄭富臻、翁國星、鮑家銀、黃杰、嚴李程、柯秋晴負責起草研究論文及對重要的知識內容進行關鍵性修改；所有作者對文章進行最終定稿，同意對研究工作全面負責，確保與論文任何部分的準確性或誠信有關的質疑得到恰當的調查和解決。
心肌梗死（myocardial infarction，MI）仍然是全球發病和死亡的主要原因，MI可因長期缺血缺氧而導致心肌損傷或死亡，盡管最近MI的治療取得了進展，MI急性期的死亡率約為10%[1]。恢復血供（即再灌注）仍是目前MI的標準治療方法，但越來越多的證據表明，再灌注后立即產生的自由基或活性氧（reactive oxygen species，ROS）會誘導心肌細胞凋亡，加速心肌缺血-再灌注損傷的發生和發展[2]。因此，尋找有效的抗凋亡藥物對心肌缺血-再灌注損傷的治療是有益的。許多實驗研究表明，多種天然產品對心血管疾病具有潛在的藥理益處。銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）是銀杏葉提取物，已被鑒定為一種多功能生物活性天然產物，可以抑制細胞凋亡、抗血小板聚集等多種作用，被廣泛用于治療心腦血管疾病，但其具體機制卻不明確[3]。最近研究[4]表明，缺血-再灌注誘導心肌細胞凋亡，這是缺血性心臟病惡化的重要特征。因此，抑制心肌細胞凋亡可有效降低心肌缺血-再灌注損傷的程度。10號染色體缺失張力蛋白同源的磷酸酶基因（chromosome 10 deletion phosphatase-tension protein homologue，PTEN）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路在各種生理過程中都起著至關重要的作用，通過調控氧化應激，對心肌缺血-再灌注損傷具有保護作用[5]。Akt的激活導致下游效應分子糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）磷酸化，這被認為是心臟保護的重要參與者[6]。因此，本研究探討GB在心肌H9C2細胞抗缺氧/復氧誘導的細胞凋亡中的作用，并對GB發揮其功能的潛在分子機制進行了研究，為GB臨床治療缺血-再灌注提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
GB和卡維地洛（美國 Sigma 公司，純度≥90%，批號：A606617、72965-09-3）；大鼠胚胎心肌H9C2細胞（中國科學院上海細胞庫，批號：CM-1250）；DMEM高糖培養基、DMEM無糖培養基和胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：160044、160047、190045）；細胞計數試劑盒8 （cell count kit 8，CCK-8）（美國Amresco公司，規格：96T，批號：M8180-4）；AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，批號：CA1020）； 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：E004-1-1、A020-2-2、A001-3-2）；2，7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2，7-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）；RIPA裂解液（上海生工生物工程有限公司，批號：175056）；PTEN、Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和GADPH抗體（美國Santa Cruz公司，批號：SC-5182、SC-3967、SC-1818、SC-5497、SC-1573）；山羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：115-58-264）；HBS-1096B型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；BD垂直電泳儀和BD FACSCanto型流式細胞儀（美國BD公司）；凝膠成像儀（美國UVP公司）。
1.2 細胞培養及實驗分組
用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基在37℃、5% CO2條件下培養H9C2細胞，取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為對照組、缺氧復氧組、GB低劑量組、GB高劑量組和卡維地洛組。對照組用無血清DMEM高糖培養基在37℃、5% CO2條件下培養28 h。其余各組用無血清DMEM無糖培養基在37℃、1% O2/5% CO2/94% N2的厭氧室中維持4 h，隨后轉移到無血清DMEM高糖培養基中，在37℃常氧條件下（5% CO2、95%空氣）培養24 h[7]；在缺氧/復氧前1 h，GB低劑量組和GB高劑量組分別用終濃度為50 μmol/L和200 μmol/L的GB預處理，卡維地洛組用終濃度為10 μmol/L的卡維地洛預處理[8-9]。各組均重復6次。
1.3 CCK-8 法檢測細胞增殖率
按1.2中的方法培養及干預細胞，在實驗結束前4 h向培養板中加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養4 h，用酶標儀測定吸光度值，計算細胞增殖率（細胞增殖率=實驗組OD值/對照組OD值×100%），OD為光吸收值。
1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率
按1.2中的方法培養及干預細胞，用AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。
1.5 LDH、MDA和ROS水平的測定
按1.2中的方法培養及干預細胞，加入2 mL磷酸鹽緩沖液，用細胞超聲破碎儀處理30 s，12 000 g離心10 min，收集上清液，按試劑盒說明書檢測細胞中LDH和MDA水平；采用DCFH-DA探針聯合酶標儀法檢測細胞內ROS水平。
1.6 Western blotting法檢測PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平
按1.2中的方法培養及干預細胞，棄培養基，根據細胞量加入RIPA裂解液，裂解2 h；4℃、10 000 rpm，離心15 min，取上清，加入1/5體積的5×Buffer，沸水變性，電泳（每孔上樣量為30 μg），將膜與PTEN（1∶300）、Akt（1∶200）、p-Akt（1∶500）、Caspase-3（1∶400）和GADPH（1∶1000）抗體進行孵育，4℃過夜，將二抗（1∶5 000）在室溫下孵育30 min。顯色，采集圖像進行分析，以GADPH作為內參。
1.7 統計學分析
正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，用單因素方差分析進行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義，統計軟件為SPSS 23.0。
2 結果
2.1 GB對H9C2細胞增殖和凋亡的影響
與對照組比較，其余各組H9C2細胞增殖率降低、細胞凋亡率增加（P<0.05）；與缺氧復氧組比較，各GB劑量組和卡維地洛組H9C2細胞增殖率增加，細胞凋亡率降低，各GB劑量組呈劑量依賴性，但GB的作用強度不如卡維地洛（P<0.05）；見表1和圖1。
表1
GB對H9C2細胞增殖和凋亡的影響（）
圖1
GB對H9C2細胞增殖和凋亡影響的流式細胞圖
a：對照組；b：缺氧復氧組；C：GB 低劑量組；D：GB 高劑量組；E：卡維地洛組；GB：銀杏內酯 B
2.2 GB對H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平的影響
與對照組比較，其余各組H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平升高（P<0.05）；與缺氧復氧組比較，各GB劑量組和卡維地洛組H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平降低，各GB劑量組呈劑量依賴性，但GB的作用強度不如卡維地洛（P<0.05）；見表2和圖2。
表2
GB對H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平的影響（）
圖2
GB對H9C2細胞中ROS水平的影響（DCFH-DA 染色，×400）
a：對照組；b：缺氧復氧組；c：GB低劑量組；d：GB高劑量組；e：卡維地洛組；GB：銀杏內酯 B；ROS：活性氧
2.3 GB對H9C2細胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平的影響
與對照組比較，其余各組H9C2細胞中PTEN、Akt和p-Akt水平降低，Caspase-3水平升高（P<0.05）；與缺氧復氧組比較，各GB劑量組和卡維地洛組H9C2細胞中PTEN、Akt和p-Akt水平升高，Caspase-3水平降低，各GB劑量組呈劑量依賴性，但GB的作用強度不如卡維地洛（P<0.05）；見表3和圖3。
表3
GB對H9C2細胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平的影響（，與GADPH的比值）
圖3
GB對H9C2細胞中PTEN、Akt、p-Akt和Caspase-3水平影響的蛋白印跡圖
a：對照組；b：缺氧復氧組；c：GB低劑量組；d：GB高劑量組；e：卡維地洛組；GB：銀杏內酯 B；PTEN：10號染色體缺失張力蛋白同源的磷酸酶基因；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化 Akt；Caspase-3：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3
3 討論
缺血性心臟病是一種死亡率較高的疾病，嚴重危害人類的健康，給患者以及家庭、社會帶來沉重的經濟負擔，通常采用溶栓等手段，迅速恢復患者冠狀動脈血液的循環流動是臨床治療缺血性心臟病的關鍵[10]。研究[11]發現，血流重新灌注缺血心肌組織后會使心臟產生新的損傷—缺血-再灌注損傷。心肌缺血-再灌注損傷與細胞增殖、凋亡以及氧化損傷、心肌線粒體能量代謝等有關[12]。因此，尋找抗缺氧/復氧心肌細胞凋亡及氧化損傷的藥物對改善患者預后至關重要。
近年來，GB對器官缺血-再灌注損傷的治療作用引起了研究者的關注。GB通過抗炎、抗氧化應激和抗凋亡途徑發揮治療作用。有研究[13]已證明，GB可減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷，但其作用機制尚不清楚。心肌缺血-再灌注損傷的病理生理機制與許多因素有關，例如大量的自由基產生、細胞內鈣超載、氧化應激增加和細胞凋亡等。目前，更多研究[14]顯示，缺血-再灌注誘導的細胞損傷的關鍵事件是細胞凋亡。因此，尋找可以抑制心肌細胞凋亡的藥物對于預防缺血-再灌注誘導的細胞損傷很重要。卡維地洛是第三代β受體阻滯劑，能顯著改善MI、心力衰竭患者的預后，但其減輕心肌細胞缺血-再灌注損傷的分子機制尚不清楚[15]。本研究結果顯示，GB改善了心肌缺氧/復氧損傷后的細胞活力，并抑制了心肌缺血-再灌注損傷后H9C2細胞凋亡。雖然其作用強度不如卡維他洛，但作為一種新藥開發有積極的意義。
心肌缺氧涉及氧化應激，抗氧化劑有助于限制缺血-再灌注期間的心臟損傷。MDA和LDH是過氧化的多不飽和脂肪酸的分解產物，主要被視為脂質過氧化的指標。MDA和LDH水平已用于評估缺血-再灌注心肌的氧損傷[16]。此外，ROS被稱為細胞內信號分子，在引起凋亡性細胞死亡中起著重要作用。研究[17]表明，缺血-再灌注可以誘導ROS的產生和氧化應激。然后，ROS與細胞膜脂質相互作用并產生MDA，從而損害心臟功能并誘發心肌細胞損傷。因此，抑制ROS形成的藥物對再灌注損傷具有心臟保護作用。本研究結果顯示，GB預處理可顯著降低心肌缺氧/復氧損傷后H9C2細胞中LDH、MDA和ROS水平。這些數據表明，GB的心肌保護作用部分歸因于其抗氧化作用。
凋亡是心肌細胞缺血-再灌注損傷的標志。氧化應激的特征在于過量的ROS產生。如果持續存在氧化損傷，則可能會對細胞造成不可逆轉的損害，最終導致細胞凋亡[18]。B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族參與了缺氧/復氧誘導的細胞凋亡。Bcl-2是一種有效的凋亡抑制劑，可抑制線粒體的降解以及隨后的細胞色素C（Cytochrome C，CytC）釋放，促進Caspase-3活化，最終導致凋亡性細胞死亡[19]。本研究結果顯示，GB預處理可顯著降低缺氧/復氧誘導的H9C2細胞中Caspase-3表達。因此，GB的抗凋亡特性可能有助于對抗心肌缺血-再灌注損傷。
PTEN/Akt通路的激活在減輕心肌缺血-再灌注損傷中起關鍵作用。研究[20]發現，PTEN在心肌重塑、心肌纖維化、心肌肥大和心肌缺血-再灌注損傷中起重要作用。PTEN通過磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）來調控Akt活性，從而通過PI3K/Akt途徑調控生存信號[21]。PTEN過表達抑制細胞G1期停滯，促進細胞增殖[22]。此外，PTEN誘導凋亡的另一潛在機制是PTEN介導的凋亡伴隨Caspase-3活化[23]。Akt的激活導致下游效應分子GSK-3β在Ser 9上的磷酸化，這被認為是心臟保護的重要參與者。Akt的激活可能通過激活下游底物（Bcl-2）來產生抗凋亡功能[24]。研究[25]發現，紫草素對肝臟缺血-再灌注損傷的有益作用是通過激活PTEN/Akt通路傳導來實現的。本研究結果顯示，GB預處理可激活缺氧/復氧誘導H9C2細胞的Caspase-3/PTEN/Akt通路。
綜上所述，GB通過激活Caspase-3/PTEN/Akt通路，降低氧化應激和細胞凋亡，促進細胞增殖來減輕心肌缺血-再灌注損傷，為GB治療心肌缺血-再灌注損傷提供理論依據。但由于缺血-再灌注損傷的調控機制是一個網絡系統，Caspase-3/PTEN/Akt通路可能只是其中一條，可能還存在其它信號通路進行調控，本結論還需進一步研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：陳海宇、鄭富臻負責研究設計，獲取、分析或解釋研究數據；翁國星、鮑家銀負責研究設計；黃杰、嚴李程獲取、分析或解釋研究數據；柯秋晴負責研究設計，獲取、分析或解釋研究數據，全面負責本文，在投稿、同行評議及出版過程中主要負責與期刊聯系；陳海宇、鄭富臻、翁國星、鮑家銀、黃杰、嚴李程、柯秋晴負責起草研究論文及對重要的知識內容進行關鍵性修改；所有作者對文章進行最終定稿，同意對研究工作全面負責，確保與論文任何部分的準確性或誠信有關的質疑得到恰當的調查和解決。
