引用本文： 劉洪, 楊連, 龔建平. 腫瘤壞死因子耐受的特點及其分子機制. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(12): 1644-1647. doi: 10.7507/1007-9424.202205003 復制
腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一種有效的促炎主控細胞因子，調節炎癥過程，是協調免疫反應的基礎[1]。TNF耐受是指預先暴露于TNF會降低對這種細胞因子后續刺激的敏感性 [2-3]。TNF耐受可通過低劑量（40 U/mL）和高劑量（400 U/mL） TNF預處理單核細胞和巨噬細胞來誘導，并可在重新刺激后以絕對耐受或誘導耐受的形式出現[3]。除了單純的TNF耐受外，還存在其他形式的TNF與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的交叉耐受[4-5]。筆者總結了在不同動物模型中TNF耐受的表現情況，并介紹了不同形式耐受的一般特征和已知的分子機制，包括轉錄因子、信號系統和受體的作用；將討論TNF耐受對炎癥和免疫癱瘓消退的影響，以及根據耐受相關分子機制討論了相關疾病的診斷和治療方法。
1 TNF耐受的活體實驗研究
TNF耐受首先在大鼠和小鼠中被描述，是指在一定時間段內重復應用亞致死劑量的TNF細胞因子后，對隨后的TNF刺激的生理反應性降低[2, 4]。 早期實驗證實單核細胞和巨噬細胞是TNF耐受的重要細胞介質[6]，其他類型的細胞（如肝細胞、心肌細胞或上皮細胞）也被證明易于耐受[7-8]。在體內， TNF耐受表現為保護耐受小鼠免受隨后注射致死劑量的TNF的刺激[9]。預先用TNF亞致死劑量治療的小鼠、大鼠和豚鼠可免受炎癥相關癥狀的影響，如發燒[10-11]、胃腸毒性[12]、肝臟損傷[13]、厭食[14]、高血壓、體溫過低等[3, 15]。細胞凋亡是膿毒癥等炎癥相關疾病的一個重要而普遍的特征[16]，在耐受細胞中細胞凋亡受到抑制[14, 17]。此外，與疾病相關的生理功能改變，如攝食量，在對TNF耐受的小鼠中比對照組更快恢復正常[17-18]。有研究[19]顯示，腺病毒感染也可以誘導對TNF的耐受狀態，這一效果可以防止LPS誘導的死亡和受影響小鼠的肝臟損傷。在瘧疾感染的小鼠中推測獲得了TNF耐受性，因為在這些小鼠中，瘧原蟲感染和釋放的TNF不會導致可察覺的疾病癥狀[20]。TNF耐受的相關活體實驗增加了對TNF耐受性的認識，可能為通過啟動或打破TNF耐受性的建立來為治療炎癥相關疾病提供相應的治療方法。
2 TNF耐受的特征及其分子機制
2.1 TNF耐受的特征
用低劑量和高劑量的TNF預處理單核-巨噬細胞或其他符合條件的細胞可以誘導TNF耐受[3, 21]。通常，低劑量是指在動物實驗中使用10 μg/kg的TNF，或在細胞培養實驗中使用40 U/mL的TNF[22]；高劑量是指在動物實驗中使用100 μg/kg的TNF，在細胞培養實驗中使用400 U/mL的TNF[2]。絕對耐受的特征是TNF預處理后免疫相關基因呈低表達，即使在隨后的再刺激情況下，與幼稚細胞的短期刺激相比仍保持在這一低水平。誘導耐受的特征是經長期TNF預處理后免疫相關基因表達增加，這與短期TNF刺激幼稚細胞后免疫相關基因表達水平大致相當，在TNF重新刺激后，這些基因的表達被“凍結”在這個水平上，不能進一步被誘導表達。受絕對或誘導耐受影響的基因組與細胞功能有關，如炎癥、生長/分化、趨化/遷移、信號/轉錄和新陳代謝[23]。TNF、白細胞介素（nterleukin，IL）-1β、-6、-8或組織因子等基因受絕對耐受影響，而IL-18、IL-28A、IL-32或Toll樣受體2（toll like receptor 2，TLR2）易受誘導耐受的影響。通常TNF的預處理時間為48～72 h[3, 21]，但一般認為誘導TNF耐受所需的最短時間為18～24 h[4, 9]，并能維持幾天的耐受狀態。目前關于單核-巨噬細胞中TNF耐受的信號機制研究較少，還需要我們進一步探索。
2.2 TNF耐受的分子機制
目前，人們認識到TNF耐受是建立在多種不同但相互聯系和相互依賴的分子事件基礎上的，這些分子事件涵蓋了細胞內信號轉導的幾個調控譜。下面就已知的決定TNF耐受性的分子機制進行討論。
2.2.1 低劑量誘導耐受
長期低劑量的TNF預處理主要導致絕對耐受，被抑制的大多數基因的表達受轉錄因子核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）或激活蛋白（activator protein，AP-1）[3, 24]的調控，提示調控它們是調節絕對耐受相關敏感基因表達的關鍵步驟。在低劑量耐受的單核細胞中，NF-κB抑制劑α（inhibitor of NF-κB alpha, IκBα）蛋白水解、p65的核轉位和NF-κB DNA結合活性僅受到微弱影響[21]。然而，在低劑量耐受化細胞的再刺激后，在小鼠巨噬細胞和人急性單核白血病THP-1細胞中，IL-8啟動子和κB依賴性轉錄的激活被抑制，p65的絲氨酸536（serine 536, Ser536）激活位點的磷酸化顯著降低[5, 16]。后一種效應可能使低劑量耐受細胞中p65與轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBPβ）的關聯增加[6]。在這種情況下，p65和C/EBPβ的蛋白-蛋白相互作用導致p65-Ser536被阻斷[6, 24]，p65與C/EBPβD的蛋白-蛋白結合物是骨髓單核細胞增殖和分化的重要調節因子[25]。另外，p65在Ser468處的磷酸化增強，這是一個負調節p65活性的磷酸化位點[26]。有趣的是，糖原合成激酶3（glycogen synthesis kinase 3， GSK3）抑制劑 SB6763，可逆轉小劑量TNF誘導的耐受，p65-Ser536磷酸化也得以恢復[3]，在TNF誘導的對LPS的交叉耐受中也有這種效應[5]。據報道，GSK3可作用于C/EBPβ[27]和p65-Ser468[26]，提示該激酶在TNF耐受中起了關鍵作用。此外，低劑量和高劑量 TNF 預處理的 THP-1 細胞的特征都是c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和p38[4, 16]的磷酸化減弱，即靶向針對Jun和Fos蛋白家族的AP-1亞單位[28]。這些激酶的總水平似乎沒有受到顯著影響[4, 16]。因此，耐受和再刺激的單核細胞中磷酸化JNK的濃度明顯低于刺激的幼稚細胞[16]。在小鼠模型中，糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）拮抗劑 RU38486可以在體內阻止小劑量誘導的TNF耐受的發生，這表明糖皮質激素及其受體參與了耐受的形成[3]。 這可能是由于GR依賴的功能，如抑制促炎信號通路，減少AP-1 DNA結合和NF-κB轉位，誘導抗炎（如IL-10）以及下調促炎細胞因子和趨化因子（如IL-6，IL-8）的表達[28] 。綜上，低劑量TNF誘導的絕對耐受主要通過轉錄機制控制，即C/EBPβ依賴性抑制p65磷酸化和潛在的GSK3活性。此外，c-Jun/AP-1激活減少和GR依賴性轉錄抑制可能有助于低劑量誘導耐受的發生。
2.2.2 大劑量誘導耐受
長期高濃度的TNF預處理可能會導致絕對耐受和誘導耐受。高濃度TNF重新刺激后，與幼稚和低劑量耐受單核細胞相比，高劑量耐受單核細胞中p65的核水平和NF-κB DNA結合活性顯著降低[3]。在細胞中長期給予高劑量TNF預處理，IκBα含量降低到較低水平[3]；當高濃度TNF重新刺激后，IκBα含量仍然沒有明顯變化，與幼稚細胞相比，在高劑量預處理和再刺激的細胞中，IκB激酶（IκB kinase，IKK）磷酸化被完全抑制[3-4]。在TNF過表達的鼠心肌細胞中，與對照細胞相比，發現p50同源二聚體的額外激活，推測這種效應可能代表一種適應性反應，以減少TNF長期存在的有害炎癥后果[8]。綜上所述，這些數據表明，在一個模型中，高劑量TNF誘導的耐受并不依賴于IκBα對NF-κB 相關信號的抑制，可能與IKK相關。
3 交叉耐受性
TNF耐受狀態還可能包括對其他刺激產生相似的反應。例如，對TNF耐受的細胞或動物對革蘭陰性細菌[15]、LPS[2, 5, 22]或其他細菌衍生劑（如親脂性外膜囊泡）具有交叉耐受性。反之，用LPS [4, 29]或巨噬細胞激活脂肽2 [30]預處理可誘導THP-1細胞或小鼠和大鼠對隨后TNF的刺激產生耐受。有趣的是，耐受性也可能是某些感染的結果，如腺病毒感染小鼠后，對隨后TNF的刺激產生了耐受[19]。由于TNF、革蘭陰性細菌、LPS或其他細菌衍生劑等所創造的同等條件，尤其是在單核細胞和巨噬細胞中，TNF耐受和交叉耐受可能存在基于重疊或至少相似的信號傳導。TNF和LPS誘導的耐受/交叉耐受的特征包括：① 在特定條件下細胞核內NF-κB活性降低[16, 31]； ② 依賴GR的基因調控[15, 32]；③ 絲裂原活化蛋白激酶磷酸化減弱[3-4]；④ GSK3活性的調節[3, 5]。總而言之，這些事件最終導致促炎基因表達被抑制，并表現出廣泛的惰性細胞狀態。然而，由于TNF耐受和LPS/TNF交叉耐受是通過不同的受體如TNF受體1或者toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）[15, 31]建立的，而且TNF誘導TNF耐受的速度不如LPS[19]，因此還存在影響這兩種現象獨特特征的特定機制。相反，人IL-1的加入完全阻止了正常情況下由人TNF誘導的小鼠TNF耐受的發展[3]。以上證據表明，產生TNF耐受的分子與其他信號通路的分子相互作用或交叉反應可能參與調節LPS/TNF交叉耐受的發生。
4 總結
TNF耐受的特征通常是受長期TNF預處理影響的細胞、器官或生物體不能完全對TNF的再刺激作出反應。因此，TNF耐受可能在TNF大量存在的嚴重急性或慢性炎癥性疾病中發揮作用。耐受可能是一個有益的機制，有助于解決膿毒癥相關的高炎癥反應或者治療長期慢性炎癥性疾病。在這種情況下，耐受的喪失可能有利于NF-κB被激活的慢性TNF依賴性炎癥性疾病的形成，如類風濕關節炎[33]、自身免疫病[34]。因此TNF耐受可能成為改善過度或長期免疫失調的治療方法。然而，盡管近年來對其分子調控的研究方法多種多樣，并取得了長足的進展，但決定TNF耐受發生和建立的復雜機制網絡仍未完全闡明。準確而充分描述TNF耐受的機制將提高對臨床相關性疾病的認識，并可能促進診斷方法的發展，以評估不同形式和狀態的耐受。此外，增加對TNF耐受性的了解有可能提供治療炎癥相關疾病的方法。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉洪負責稿件撰寫與修改，楊連參與文獻檢索和稿件修改，龔建平參與論文選題和設計并給予指導及支持性貢獻。
腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一種有效的促炎主控細胞因子，調節炎癥過程，是協調免疫反應的基礎[1]。TNF耐受是指預先暴露于TNF會降低對這種細胞因子后續刺激的敏感性 [2-3]。TNF耐受可通過低劑量（40 U/mL）和高劑量（400 U/mL） TNF預處理單核細胞和巨噬細胞來誘導，并可在重新刺激后以絕對耐受或誘導耐受的形式出現[3]。除了單純的TNF耐受外，還存在其他形式的TNF與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的交叉耐受[4-5]。筆者總結了在不同動物模型中TNF耐受的表現情況，并介紹了不同形式耐受的一般特征和已知的分子機制，包括轉錄因子、信號系統和受體的作用；將討論TNF耐受對炎癥和免疫癱瘓消退的影響，以及根據耐受相關分子機制討論了相關疾病的診斷和治療方法。
1 TNF耐受的活體實驗研究
TNF耐受首先在大鼠和小鼠中被描述，是指在一定時間段內重復應用亞致死劑量的TNF細胞因子后，對隨后的TNF刺激的生理反應性降低[2, 4]。 早期實驗證實單核細胞和巨噬細胞是TNF耐受的重要細胞介質[6]，其他類型的細胞（如肝細胞、心肌細胞或上皮細胞）也被證明易于耐受[7-8]。在體內， TNF耐受表現為保護耐受小鼠免受隨后注射致死劑量的TNF的刺激[9]。預先用TNF亞致死劑量治療的小鼠、大鼠和豚鼠可免受炎癥相關癥狀的影響，如發燒[10-11]、胃腸毒性[12]、肝臟損傷[13]、厭食[14]、高血壓、體溫過低等[3, 15]。細胞凋亡是膿毒癥等炎癥相關疾病的一個重要而普遍的特征[16]，在耐受細胞中細胞凋亡受到抑制[14, 17]。此外，與疾病相關的生理功能改變，如攝食量，在對TNF耐受的小鼠中比對照組更快恢復正常[17-18]。有研究[19]顯示，腺病毒感染也可以誘導對TNF的耐受狀態，這一效果可以防止LPS誘導的死亡和受影響小鼠的肝臟損傷。在瘧疾感染的小鼠中推測獲得了TNF耐受性，因為在這些小鼠中，瘧原蟲感染和釋放的TNF不會導致可察覺的疾病癥狀[20]。TNF耐受的相關活體實驗增加了對TNF耐受性的認識，可能為通過啟動或打破TNF耐受性的建立來為治療炎癥相關疾病提供相應的治療方法。
2 TNF耐受的特征及其分子機制
2.1 TNF耐受的特征
用低劑量和高劑量的TNF預處理單核-巨噬細胞或其他符合條件的細胞可以誘導TNF耐受[3, 21]。通常，低劑量是指在動物實驗中使用10 μg/kg的TNF，或在細胞培養實驗中使用40 U/mL的TNF[22]；高劑量是指在動物實驗中使用100 μg/kg的TNF，在細胞培養實驗中使用400 U/mL的TNF[2]。絕對耐受的特征是TNF預處理后免疫相關基因呈低表達，即使在隨后的再刺激情況下，與幼稚細胞的短期刺激相比仍保持在這一低水平。誘導耐受的特征是經長期TNF預處理后免疫相關基因表達增加，這與短期TNF刺激幼稚細胞后免疫相關基因表達水平大致相當，在TNF重新刺激后，這些基因的表達被“凍結”在這個水平上，不能進一步被誘導表達。受絕對或誘導耐受影響的基因組與細胞功能有關，如炎癥、生長/分化、趨化/遷移、信號/轉錄和新陳代謝[23]。TNF、白細胞介素（nterleukin，IL）-1β、-6、-8或組織因子等基因受絕對耐受影響，而IL-18、IL-28A、IL-32或Toll樣受體2（toll like receptor 2，TLR2）易受誘導耐受的影響。通常TNF的預處理時間為48～72 h[3, 21]，但一般認為誘導TNF耐受所需的最短時間為18～24 h[4, 9]，并能維持幾天的耐受狀態。目前關于單核-巨噬細胞中TNF耐受的信號機制研究較少，還需要我們進一步探索。
2.2 TNF耐受的分子機制
目前，人們認識到TNF耐受是建立在多種不同但相互聯系和相互依賴的分子事件基礎上的，這些分子事件涵蓋了細胞內信號轉導的幾個調控譜。下面就已知的決定TNF耐受性的分子機制進行討論。
2.2.1 低劑量誘導耐受
長期低劑量的TNF預處理主要導致絕對耐受，被抑制的大多數基因的表達受轉錄因子核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）或激活蛋白（activator protein，AP-1）[3, 24]的調控，提示調控它們是調節絕對耐受相關敏感基因表達的關鍵步驟。在低劑量耐受的單核細胞中，NF-κB抑制劑α（inhibitor of NF-κB alpha, IκBα）蛋白水解、p65的核轉位和NF-κB DNA結合活性僅受到微弱影響[21]。然而，在低劑量耐受化細胞的再刺激后，在小鼠巨噬細胞和人急性單核白血病THP-1細胞中，IL-8啟動子和κB依賴性轉錄的激活被抑制，p65的絲氨酸536（serine 536, Ser536）激活位點的磷酸化顯著降低[5, 16]。后一種效應可能使低劑量耐受細胞中p65與轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白β（CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBPβ）的關聯增加[6]。在這種情況下，p65和C/EBPβ的蛋白-蛋白相互作用導致p65-Ser536被阻斷[6, 24]，p65與C/EBPβD的蛋白-蛋白結合物是骨髓單核細胞增殖和分化的重要調節因子[25]。另外，p65在Ser468處的磷酸化增強，這是一個負調節p65活性的磷酸化位點[26]。有趣的是，糖原合成激酶3（glycogen synthesis kinase 3， GSK3）抑制劑 SB6763，可逆轉小劑量TNF誘導的耐受，p65-Ser536磷酸化也得以恢復[3]，在TNF誘導的對LPS的交叉耐受中也有這種效應[5]。據報道，GSK3可作用于C/EBPβ[27]和p65-Ser468[26]，提示該激酶在TNF耐受中起了關鍵作用。此外，低劑量和高劑量 TNF 預處理的 THP-1 細胞的特征都是c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和p38[4, 16]的磷酸化減弱，即靶向針對Jun和Fos蛋白家族的AP-1亞單位[28]。這些激酶的總水平似乎沒有受到顯著影響[4, 16]。因此，耐受和再刺激的單核細胞中磷酸化JNK的濃度明顯低于刺激的幼稚細胞[16]。在小鼠模型中，糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）拮抗劑 RU38486可以在體內阻止小劑量誘導的TNF耐受的發生，這表明糖皮質激素及其受體參與了耐受的形成[3]。 這可能是由于GR依賴的功能，如抑制促炎信號通路，減少AP-1 DNA結合和NF-κB轉位，誘導抗炎（如IL-10）以及下調促炎細胞因子和趨化因子（如IL-6，IL-8）的表達[28] 。綜上，低劑量TNF誘導的絕對耐受主要通過轉錄機制控制，即C/EBPβ依賴性抑制p65磷酸化和潛在的GSK3活性。此外，c-Jun/AP-1激活減少和GR依賴性轉錄抑制可能有助于低劑量誘導耐受的發生。
2.2.2 大劑量誘導耐受
長期高濃度的TNF預處理可能會導致絕對耐受和誘導耐受。高濃度TNF重新刺激后，與幼稚和低劑量耐受單核細胞相比，高劑量耐受單核細胞中p65的核水平和NF-κB DNA結合活性顯著降低[3]。在細胞中長期給予高劑量TNF預處理，IκBα含量降低到較低水平[3]；當高濃度TNF重新刺激后，IκBα含量仍然沒有明顯變化，與幼稚細胞相比，在高劑量預處理和再刺激的細胞中，IκB激酶（IκB kinase，IKK）磷酸化被完全抑制[3-4]。在TNF過表達的鼠心肌細胞中，與對照細胞相比，發現p50同源二聚體的額外激活，推測這種效應可能代表一種適應性反應，以減少TNF長期存在的有害炎癥后果[8]。綜上所述，這些數據表明，在一個模型中，高劑量TNF誘導的耐受并不依賴于IκBα對NF-κB 相關信號的抑制，可能與IKK相關。
3 交叉耐受性
TNF耐受狀態還可能包括對其他刺激產生相似的反應。例如，對TNF耐受的細胞或動物對革蘭陰性細菌[15]、LPS[2, 5, 22]或其他細菌衍生劑（如親脂性外膜囊泡）具有交叉耐受性。反之，用LPS [4, 29]或巨噬細胞激活脂肽2 [30]預處理可誘導THP-1細胞或小鼠和大鼠對隨后TNF的刺激產生耐受。有趣的是，耐受性也可能是某些感染的結果，如腺病毒感染小鼠后，對隨后TNF的刺激產生了耐受[19]。由于TNF、革蘭陰性細菌、LPS或其他細菌衍生劑等所創造的同等條件，尤其是在單核細胞和巨噬細胞中，TNF耐受和交叉耐受可能存在基于重疊或至少相似的信號傳導。TNF和LPS誘導的耐受/交叉耐受的特征包括：① 在特定條件下細胞核內NF-κB活性降低[16, 31]； ② 依賴GR的基因調控[15, 32]；③ 絲裂原活化蛋白激酶磷酸化減弱[3-4]；④ GSK3活性的調節[3, 5]。總而言之，這些事件最終導致促炎基因表達被抑制，并表現出廣泛的惰性細胞狀態。然而，由于TNF耐受和LPS/TNF交叉耐受是通過不同的受體如TNF受體1或者toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）[15, 31]建立的，而且TNF誘導TNF耐受的速度不如LPS[19]，因此還存在影響這兩種現象獨特特征的特定機制。相反，人IL-1的加入完全阻止了正常情況下由人TNF誘導的小鼠TNF耐受的發展[3]。以上證據表明，產生TNF耐受的分子與其他信號通路的分子相互作用或交叉反應可能參與調節LPS/TNF交叉耐受的發生。
4 總結
TNF耐受的特征通常是受長期TNF預處理影響的細胞、器官或生物體不能完全對TNF的再刺激作出反應。因此，TNF耐受可能在TNF大量存在的嚴重急性或慢性炎癥性疾病中發揮作用。耐受可能是一個有益的機制，有助于解決膿毒癥相關的高炎癥反應或者治療長期慢性炎癥性疾病。在這種情況下，耐受的喪失可能有利于NF-κB被激活的慢性TNF依賴性炎癥性疾病的形成，如類風濕關節炎[33]、自身免疫病[34]。因此TNF耐受可能成為改善過度或長期免疫失調的治療方法。然而，盡管近年來對其分子調控的研究方法多種多樣，并取得了長足的進展，但決定TNF耐受發生和建立的復雜機制網絡仍未完全闡明。準確而充分描述TNF耐受的機制將提高對臨床相關性疾病的認識，并可能促進診斷方法的發展，以評估不同形式和狀態的耐受。此外，增加對TNF耐受性的了解有可能提供治療炎癥相關疾病的方法。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉洪負責稿件撰寫與修改，楊連參與文獻檢索和稿件修改，龔建平參與論文選題和設計并給予指導及支持性貢獻。