引用本文： 葉寶龍, 丁凱, 嵇武. 膽囊癌類器官的研究進展與挑戰. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(12): 1648-1652. doi: 10.7507/1007-9424.202206023 復制
傳統的腫瘤研究模型有腫瘤細胞系模型、多細胞腫瘤球模型及動物模型。腫瘤細胞系模型作為傳統的二維細胞培養模型，具有易培養、繁殖周期短等優勢，主要用于藥物篩選、功能分析等方面的研究，但是不能模擬腫瘤細胞與微環境的內在聯系，在培養過程中存在突變累積效應，也使它無法完全保持原始腫瘤細胞的特性[1]。多細胞腫瘤球模型開創了三維細胞培養模型的先河，可用于研究腫瘤代謝、轉移等機制及相關信號通路，其缺陷在于它無法反映腫瘤的組織形態特征以及無法模擬腫瘤微環境[2]。動物模型被認為是系統研究腫瘤的發生及發展過程較為合適的模型，但建立時間長、費用高，并且有限的可用性及物種特異性差異，也使它無法完全模擬人體腫瘤的特征[3]。因此，亟需一種既能再現原始腫瘤的特征，又能規避傳統研究模型缺陷的研究模型。類器官的出現給研究者們提供了新的方向。
“類器官”概念于2014年提出[4]，自此類器官的研究便逐漸成為熱點并取得了一定的成果。2017年Nature雜志評選類器官技術為年度最佳生物技術，2019年The New England Journal of Medicine雜志確定類器官可作為最佳的臨床前模型，確立了類器官研究在生物醫學中的地位。腫瘤類器官是由腫瘤組織或正常組織經基因編輯等快速培育而來，與原始腫瘤的分子及細胞的組成高度相似，不僅具有傳統腫瘤研究模型的優點，還可再現原始腫瘤的相關特性以及基因特征，能更好地符合體內生理條件。目前，類器官已被應用于如胃腸道疾病、肝臟疾病、卵巢疾病等[5-6]多種疾病的研究。近年來，筆者所在醫院對腸道類器官的研究取得了一定的成果[7-11]，認為類器官的研究在探索腫瘤的發生及發展過程、個體化治療方案的制定、藥物篩選、發現診斷標志物等方面可能具有巨大潛力。受限于膽囊癌患者數量相對較少等因素，目前關于膽囊癌的發病機制、疾病進展、治療等方面的研究進展緩慢，而類器官的出現，或許能加快對膽囊癌的認識。但膽囊癌類器官的研究處于起步階段，故筆者將近年來膽囊癌類器官相關的研究進展及面臨的挑戰做一綜述，并探討可能的應對策略。
1 膽囊癌類器官的構建
1.1 不同取材的培養基成分
由人來源和動物來源組織構建的膽囊癌類器官，完全培養基所添加的成分不盡相同，其相同點在于，都是以Dulbecco改良eagle培養基（Dulbecco modified eagle medium，DMEM）/F12為基礎培養基，添加R-Sponding 1、B27、N2、煙酰胺、A-8301、青-鏈霉素雙抗、Y-27632、表皮細胞生長因子、肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子等；不同點在于，人類來源的膽囊癌類器官完全培養基還需加入胰島素樣生長因子-2、Wnt/β連環蛋白抑制劑IWP-2、Wnt/β連環蛋白信號通路中重要配體Wnt3a等因子，而動物膽囊癌類器官通常是先構建正常膽囊類器官，再通過基因工程技術誘導膽囊類器官癌變，因此無需加入這些因子[12-15]。
1.2 不同取材的構建方式
目前膽囊癌類器官的構建大多數是取材于人類膽囊癌手術切除后的腫瘤組織，構建的基本步驟是：先將腫瘤組織用無菌生理鹽水沖洗2～3次后切碎成小塊；隨后用Ⅳ型膠原蛋白消化30～60 min，消化成單個腫瘤細胞或少許聚集細胞，DMEM（含10%磷酸鹽緩沖溶液）中止消化；消化后的懸液經100 μm的細胞篩過濾，并將過濾液體以1 000 r/min離心5 min；離心后的細胞用DMEM/F12重懸，Matrigel基質膠與完全培養基比例為1∶1混合后，將重懸液包裹混合，以每孔10 000～20 000個的細胞數量按需接種到孔板中，與傳統的二維細胞培養類似，也可以進行后續的傳代、凍存、復蘇等操作[12-14]。而動物膽囊癌類器官的報道相對較少，Kasuga等[15]通過取材于6周的雌鼠膽囊，與人類來源的膽囊癌類器官構建類似，經消化、重懸、基質膠聚合等構建正常膽囊類器官，并將基因工程技術獲得的攜帶K-Ras基因的載體加入到正常膽囊類器官培養基中，誘導正常膽囊類器官癌變，從而得到小鼠膽囊癌類器官模型。
2 膽囊癌類器官的應用
2.1 研究疾病的發病機制
因膽囊癌隱匿性強，缺乏特異性診斷方法，早期診斷較為困難，預后不佳。目前對膽囊癌確切的發病機制仍不清楚，已知的膽囊癌致病因素有環境、微生物感染、遺傳代謝、基因突變等[16]。基因突變是腫瘤發生及發展的基礎，類器官在尋找確切的致病基因方面展示了巨大的潛力，將類器官技術與基因工程技術相結合來尋找可能的基因突變位點，為發現特異性的腫瘤診斷標志物、精準化及個體化治療方案的制定提供理論依據。通過人類手術標本而構建的類器官模型，為探究疾病致病靶點以及發生及發展過程提供了新思路。Erlangga等[17]利用基因編輯技術和慢病毒轉染技術進行研究發現，K-Ras激活、10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源物缺失、p53基因缺失均與膽囊癌發生相關，并通過逆轉錄病毒轉導和基因編輯技術構建了2個具有p53基因缺失的人類表皮生長因子受體-2過表達的突變體，進一步證實了p53基因缺失與膽囊癌的發生密切相關。而在另一項研究[18]中，通過構建小鼠的膽囊類器官模型并感染沙門菌，發現在有沙門菌感染史的類器官模型中，細胞失去內聚力和極性，細胞核逐漸增大且不規則，核仁明顯，而未感染沙門菌的模型可分化正常的膽囊上皮組織，證實了沙門菌感染與膽囊癌發生之間有一定的關系。另有研究[12, 14]發現，通過與正常膽囊類器官模型對比，睫狀神經營養因子及其受體與膽囊癌相關，睫狀神經營養因子受體低表達與腫瘤轉移密切相關，并且發現睫狀神經營養因子受體通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶通路的磷酸化來抑制膽囊癌的侵襲和轉移，此為今后膽囊癌的診治提供了一個方向。充分利用腫瘤類器官能夠良好再現體內腫瘤的表型及基因型的優點，利用膽囊癌手術切除的腫瘤組織構建膽囊癌類器官并結合基因工程等技術，能夠加快、加深對膽囊癌的認識。
2.2 用于藥物篩選與個體化治療
目前膽囊癌仍然面臨著高病死率的困境，預后不佳，嚴重影響人類健康。針對膽囊癌的非手術治療主要包括化學藥物治療、放射治療、免疫治療、靶向治療等。目前膽囊癌的一線化學藥物治療方案仍然是吉西他濱加順鉑，但整體預后仍不理想，亟需新的治療方案以提高膽囊癌患者生存率。腫瘤類器官能在體外還原原始腫瘤的異質性并能模擬體內三維環境，已被廣泛用于腫瘤治療藥物的篩選與個體化用藥。
García等[19]研究發現，在超過60%的慢性膽囊炎及進展期膽囊癌患者中，存在Yes相關蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）高表達，且與患者總生存率相關，YAP1抑制劑維替泊芬可以降低膽囊癌的轉移和侵犯幾率；然后通過在膽囊癌類器官模型中進一步證實了維替泊芬的積極治療效果，并發現維替泊芬能夠抑制吉西他濱耐藥的膽囊癌類器官的活性，提示維替泊芬可以增強腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性和細胞毒性，因此，維替泊芬加吉西他濱或許是未來膽囊癌治療的新方案。Yuan等[12]通過培育膽囊癌類器官與正常膽囊類器官，利用大規模藥物篩查檢測藥物對腫瘤的敏感性發現，組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以顯著抑制膽囊癌類器官的生長，而對正常膽囊類器官毒性較小，說明組蛋白去乙酰化酶抑制劑是膽囊癌潛在的治療藥物。
對膽囊癌類器官模型進行全外顯子測序或許能發現新的治療靶點，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑已被廣泛用于腫瘤的非手術治療，認為它抗腫瘤效應與K-Ras相關，如西妥昔單抗只對野生型結直腸癌有效[20]；而Saito等[21]通過對膽囊癌類器官模型進行全外顯子測序發現，無論是野生型還是突變型K-Ras，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑均能表現出抗腫瘤效應，提示它在膽囊癌中抗腫瘤效應與K-Ras基因類型并無關系。
此外，新興的免疫治療所取得的成果也引起了研究者們的關注。如L?ffler等[22]報道了1例使用多肽疫苗治療膽管癌伴肺轉移的病例，該疫苗通過誘導T細胞應答并使T細胞浸潤增加，在接種后44個月時患者仍處于無瘤生存期，提示治療有效；Neal等[23]的實驗證實，取材于患者腫瘤標本而創建的類器官模型可更好地保留原始腫瘤細胞的分子生物學特性，并且還發現程序性死亡受體1及其配體的免疫抑制劑可以通過激活腫瘤抗原特異性淋巴細胞而引起腫瘤細胞的死亡；另有研究[24]報道，程序性死亡受體1抑制劑對膽囊癌患者有一定的治療效果，但證據效力普遍較低，為獲得高級別證據，類器官模型或許能提供幫助。
總之，目前利用膽囊癌類器官來篩選治療藥物已取得一定的成果，膽囊癌類器官具有培養周期短的特點，通過類器官對新興藥物進行藥物敏感測試，不僅能節約成本、提高效率，也能加速有效治療方案進入臨床。但是目前膽囊癌治療前景較大的新興免疫治療方案還未應用于膽囊癌類器官中研究，希望通過了解這些研究進展為后續膽囊癌類器官應用于藥物篩選和個體化治療提供參考。
2.3 器官移植
類器官技術與再生醫學緊密相連，類器官技術誕生后，其應用于器官移植的實驗便不斷出現。2021年，Sampaziotis等[25]在Science雜志發表了其團隊最新研究成果，將膽囊類器官移植到離體狀態下的人肝臟中，觀察到膽管的再生和膽汁狀態的改變，首次證明了類器官移植在人體器官移植的可行性和巨大前景，為今后的臨床應用奠定了基礎。
3 膽囊癌類器官的挑戰與策略
近年來，類器官研究在腫瘤領域中進展迅速，在研究腫瘤的發病機制、藥物篩選、個體化治療等方面，類器官已顯示出了它明顯的優勢[26-30]。但是膽囊癌類器官研究仍然面臨著構建成功率低、構建的模型相對簡單、樣本來源少等困境，借助于其他類器官研究所取得的經驗，或許能加速膽囊癌類器官研究的步伐。
3.1 膽囊癌類器官構建成功的影響因素與策略
雖然目前類器官已成為近些年的研究熱點，但是模型構建成功率較低仍然是限制它快速發展的主要原因。膽囊癌類器官的構建成功率約為20%[12-13, 21]，與肝癌[5]、卵巢癌[6]、胰腺癌[31]等相比，仍有較大的提升空間，目前仍需深入研究影響類器官模型構建成功的因素。
首先，通常由于膽囊癌標本體積較小，標本內腫瘤細胞的絕對數量明顯少于肝癌、卵巢癌等其他實體腫瘤，提示腫瘤細胞的數量可能是影響類器官模型成敗的因素之一，而此前也有關于胃腸道類器官模型的研究提示類器官的成功構建與標本內腫瘤細胞的數量相關[12, 32]。其次，目前膽囊癌類器官的構建絕大多數取材于手術后的腫瘤組織，導致取材內不可避免地含有正常細胞。已有多項研究分別構建了膽管腫瘤類器官與正常膽管類器官，通過對比后發現，雖然正常細胞的增殖周期有限，但是在類器官模型培養的早期，正常細胞的增殖能力明顯強于腫瘤細胞，甚至出現了取材于腫瘤組織構建的類器官經過培育后形成的是正常膽管類器官的現象，隨后分析發現，原因在于取材的腫瘤組織中正常細胞占比過大，進一步分析后發現，膽囊長期慢性炎癥導致的炎-癌轉變，使得腫瘤組織內含大量纖維結締組織，導致在制備膽囊癌類器官的過程中腫瘤組織難以消化，而且消化后獲得的少量上皮細胞活力較低，從而影響了模型構建成功率[12, 21]，在結直腸癌類器官模型中也發現了此現象[33]。因此，目前膽囊癌標本內腫瘤細胞的絕對數量難以明顯提高，若取材于手術切除后的腫瘤組織時，必須細致分析細胞類型，盡可能完全消化，避免取材標本內正常細胞的占比過大，提高取材后細胞活力，爭取標本內的腫瘤細胞相對數量更高。
3.2 腫瘤微環境與新技術
血管、腫瘤相關纖維原細胞、免疫細胞（T淋巴細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞）等與疾病的致病及進展相關。腫瘤細胞為了生存和生長，采用諸多策略躲避機體的免疫監控，使得機體無法有效識別和殺傷腫瘤細胞，從而產生免疫耐受，通過控制免疫細胞形成免疫抑制的腫瘤微環境，以逃避宿主免疫監控，甚至促進腫瘤的發生及發展[34]。而類器官模型可以模擬腫瘤細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的相互作用關系，但如何做到復原體內真實腫瘤微環境也是面臨的挑戰之一。
目前，共培養、氣液界面、微流體、類器官芯片等新興技術[23, 35]已被應用于類器官的研究中，以期更好地研究腫瘤的真實情況。Gonzalez-Exposito團隊[36]通過構建耐多藥并轉移的結直腸癌類器官并成功與異基因CD8+ T淋巴細胞共同培養，發現西比沙他單抗能有效抑制該模型中腫瘤細胞的生長速度，并且還發現其敏感性與癌胚抗原的表達相關，阻斷Wnt/β連環蛋白通路可增強癌胚抗原的表達，通過此結直腸癌類器官中的研究結果提示了西比沙他單抗在結直腸癌中具備治療潛力；而在另一項結直腸類器官研究[37]中，當把脂肪細胞與腫瘤細胞共培養時，發現脂肪細胞可為腫瘤細胞的生長提供能量，并可調控腫瘤細胞的新陳代謝，促進腫瘤細胞的生長和生存，由此也解釋了肥胖是包括膽囊癌在內的一些腫瘤的高危因素。氣液界面技術是通過將實驗模型的底面植入培養基中，而頂面直接與空氣接觸。Usui等[38]應用氣液界面技術成功構建了結直腸癌類器官，正常結直腸類器官具有囊性結構包括上皮細胞、杯狀細胞以及成纖維細胞，而結直腸癌類器官包括上皮細胞、肌成纖維細胞和腫瘤干細胞。微流體技術及由微流體技術發展而來的類器官芯片，通過集成多種類器官來實現對腫瘤發展的宏觀研究，為腫瘤研究提供操作性更強的平臺[39]，但暫沒有相關技術應用于膽囊癌的研究中。因此，在未來的膽囊癌類器官研究中，通過加入脂肪細胞、免疫細胞等以及共培養等新興技術為研究膽囊癌更加真實的腫瘤微環境提供了新的思路。
4 總結與展望
雖然膽囊癌目前仍然面臨著高病死率、低生存率、治療方式單一等問題，但隨著對膽囊癌發病機制、臨床診斷方法、治療策略等更加深入的研究，這些問題會逐步得到解決。因膽囊癌類器官的構建主要取材于患者手術切除標本，加之新興技術如共培養和氣液界面技術的出現，在體外精確再現腫瘤的特性與微環境已成為可能。隨著單細胞測序技術的出現，通過比較不同細胞之間的異質性來發現膽囊癌的發病機制也成為當前的研究熱點，目前取得的成果也預示了診斷和治療的前景喜人。由于一些治療方式尚未批準用于臨床試驗，因此獲得治療后的標本比較困難。然而類器官的出現，將一些尚未批準用于臨床試驗的治療方案應用于類器官模型中，通過類器官模型對治療前、治療后的療效進行比較，可獲得更高級別的證據，加速新興治療方案進入臨床。現在，膽囊癌類器官的研究仍處于萌芽階段，其他腫瘤類器官模型所取得的經驗可以借鑒；同時人體是作為一個復雜的有機結合體，現有的類器官模型相對簡單，因此，如何構建結構更為復雜包含血管、神經、免疫等相互聯系的類器官模型，如何更加宏觀地研究腫瘤發展，是未來關注的新方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：葉寶龍負責文獻查閱、論文撰寫；丁凱負責修改論文；嵇武負責寫作思路、修改論文及定稿。
傳統的腫瘤研究模型有腫瘤細胞系模型、多細胞腫瘤球模型及動物模型。腫瘤細胞系模型作為傳統的二維細胞培養模型，具有易培養、繁殖周期短等優勢，主要用于藥物篩選、功能分析等方面的研究，但是不能模擬腫瘤細胞與微環境的內在聯系，在培養過程中存在突變累積效應，也使它無法完全保持原始腫瘤細胞的特性[1]。多細胞腫瘤球模型開創了三維細胞培養模型的先河，可用于研究腫瘤代謝、轉移等機制及相關信號通路，其缺陷在于它無法反映腫瘤的組織形態特征以及無法模擬腫瘤微環境[2]。動物模型被認為是系統研究腫瘤的發生及發展過程較為合適的模型，但建立時間長、費用高，并且有限的可用性及物種特異性差異，也使它無法完全模擬人體腫瘤的特征[3]。因此，亟需一種既能再現原始腫瘤的特征，又能規避傳統研究模型缺陷的研究模型。類器官的出現給研究者們提供了新的方向。
“類器官”概念于2014年提出[4]，自此類器官的研究便逐漸成為熱點并取得了一定的成果。2017年Nature雜志評選類器官技術為年度最佳生物技術，2019年The New England Journal of Medicine雜志確定類器官可作為最佳的臨床前模型，確立了類器官研究在生物醫學中的地位。腫瘤類器官是由腫瘤組織或正常組織經基因編輯等快速培育而來，與原始腫瘤的分子及細胞的組成高度相似，不僅具有傳統腫瘤研究模型的優點，還可再現原始腫瘤的相關特性以及基因特征，能更好地符合體內生理條件。目前，類器官已被應用于如胃腸道疾病、肝臟疾病、卵巢疾病等[5-6]多種疾病的研究。近年來，筆者所在醫院對腸道類器官的研究取得了一定的成果[7-11]，認為類器官的研究在探索腫瘤的發生及發展過程、個體化治療方案的制定、藥物篩選、發現診斷標志物等方面可能具有巨大潛力。受限于膽囊癌患者數量相對較少等因素，目前關于膽囊癌的發病機制、疾病進展、治療等方面的研究進展緩慢，而類器官的出現，或許能加快對膽囊癌的認識。但膽囊癌類器官的研究處于起步階段，故筆者將近年來膽囊癌類器官相關的研究進展及面臨的挑戰做一綜述，并探討可能的應對策略。
1 膽囊癌類器官的構建
1.1 不同取材的培養基成分
由人來源和動物來源組織構建的膽囊癌類器官，完全培養基所添加的成分不盡相同，其相同點在于，都是以Dulbecco改良eagle培養基（Dulbecco modified eagle medium，DMEM）/F12為基礎培養基，添加R-Sponding 1、B27、N2、煙酰胺、A-8301、青-鏈霉素雙抗、Y-27632、表皮細胞生長因子、肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子等；不同點在于，人類來源的膽囊癌類器官完全培養基還需加入胰島素樣生長因子-2、Wnt/β連環蛋白抑制劑IWP-2、Wnt/β連環蛋白信號通路中重要配體Wnt3a等因子，而動物膽囊癌類器官通常是先構建正常膽囊類器官，再通過基因工程技術誘導膽囊類器官癌變，因此無需加入這些因子[12-15]。
1.2 不同取材的構建方式
目前膽囊癌類器官的構建大多數是取材于人類膽囊癌手術切除后的腫瘤組織，構建的基本步驟是：先將腫瘤組織用無菌生理鹽水沖洗2～3次后切碎成小塊；隨后用Ⅳ型膠原蛋白消化30～60 min，消化成單個腫瘤細胞或少許聚集細胞，DMEM（含10%磷酸鹽緩沖溶液）中止消化；消化后的懸液經100 μm的細胞篩過濾，并將過濾液體以1 000 r/min離心5 min；離心后的細胞用DMEM/F12重懸，Matrigel基質膠與完全培養基比例為1∶1混合后，將重懸液包裹混合，以每孔10 000～20 000個的細胞數量按需接種到孔板中，與傳統的二維細胞培養類似，也可以進行后續的傳代、凍存、復蘇等操作[12-14]。而動物膽囊癌類器官的報道相對較少，Kasuga等[15]通過取材于6周的雌鼠膽囊，與人類來源的膽囊癌類器官構建類似，經消化、重懸、基質膠聚合等構建正常膽囊類器官，并將基因工程技術獲得的攜帶K-Ras基因的載體加入到正常膽囊類器官培養基中，誘導正常膽囊類器官癌變，從而得到小鼠膽囊癌類器官模型。
2 膽囊癌類器官的應用
2.1 研究疾病的發病機制
因膽囊癌隱匿性強，缺乏特異性診斷方法，早期診斷較為困難，預后不佳。目前對膽囊癌確切的發病機制仍不清楚，已知的膽囊癌致病因素有環境、微生物感染、遺傳代謝、基因突變等[16]。基因突變是腫瘤發生及發展的基礎，類器官在尋找確切的致病基因方面展示了巨大的潛力，將類器官技術與基因工程技術相結合來尋找可能的基因突變位點，為發現特異性的腫瘤診斷標志物、精準化及個體化治療方案的制定提供理論依據。通過人類手術標本而構建的類器官模型，為探究疾病致病靶點以及發生及發展過程提供了新思路。Erlangga等[17]利用基因編輯技術和慢病毒轉染技術進行研究發現，K-Ras激活、10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源物缺失、p53基因缺失均與膽囊癌發生相關，并通過逆轉錄病毒轉導和基因編輯技術構建了2個具有p53基因缺失的人類表皮生長因子受體-2過表達的突變體，進一步證實了p53基因缺失與膽囊癌的發生密切相關。而在另一項研究[18]中，通過構建小鼠的膽囊類器官模型并感染沙門菌，發現在有沙門菌感染史的類器官模型中，細胞失去內聚力和極性，細胞核逐漸增大且不規則，核仁明顯，而未感染沙門菌的模型可分化正常的膽囊上皮組織，證實了沙門菌感染與膽囊癌發生之間有一定的關系。另有研究[12, 14]發現，通過與正常膽囊類器官模型對比，睫狀神經營養因子及其受體與膽囊癌相關，睫狀神經營養因子受體低表達與腫瘤轉移密切相關，并且發現睫狀神經營養因子受體通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶通路的磷酸化來抑制膽囊癌的侵襲和轉移，此為今后膽囊癌的診治提供了一個方向。充分利用腫瘤類器官能夠良好再現體內腫瘤的表型及基因型的優點，利用膽囊癌手術切除的腫瘤組織構建膽囊癌類器官并結合基因工程等技術，能夠加快、加深對膽囊癌的認識。
2.2 用于藥物篩選與個體化治療
目前膽囊癌仍然面臨著高病死率的困境，預后不佳，嚴重影響人類健康。針對膽囊癌的非手術治療主要包括化學藥物治療、放射治療、免疫治療、靶向治療等。目前膽囊癌的一線化學藥物治療方案仍然是吉西他濱加順鉑，但整體預后仍不理想，亟需新的治療方案以提高膽囊癌患者生存率。腫瘤類器官能在體外還原原始腫瘤的異質性并能模擬體內三維環境，已被廣泛用于腫瘤治療藥物的篩選與個體化用藥。
García等[19]研究發現，在超過60%的慢性膽囊炎及進展期膽囊癌患者中，存在Yes相關蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）高表達，且與患者總生存率相關，YAP1抑制劑維替泊芬可以降低膽囊癌的轉移和侵犯幾率；然后通過在膽囊癌類器官模型中進一步證實了維替泊芬的積極治療效果，并發現維替泊芬能夠抑制吉西他濱耐藥的膽囊癌類器官的活性，提示維替泊芬可以增強腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性和細胞毒性，因此，維替泊芬加吉西他濱或許是未來膽囊癌治療的新方案。Yuan等[12]通過培育膽囊癌類器官與正常膽囊類器官，利用大規模藥物篩查檢測藥物對腫瘤的敏感性發現，組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以顯著抑制膽囊癌類器官的生長，而對正常膽囊類器官毒性較小，說明組蛋白去乙酰化酶抑制劑是膽囊癌潛在的治療藥物。
對膽囊癌類器官模型進行全外顯子測序或許能發現新的治療靶點，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑已被廣泛用于腫瘤的非手術治療，認為它抗腫瘤效應與K-Ras相關，如西妥昔單抗只對野生型結直腸癌有效[20]；而Saito等[21]通過對膽囊癌類器官模型進行全外顯子測序發現，無論是野生型還是突變型K-Ras，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑均能表現出抗腫瘤效應，提示它在膽囊癌中抗腫瘤效應與K-Ras基因類型并無關系。
此外，新興的免疫治療所取得的成果也引起了研究者們的關注。如L?ffler等[22]報道了1例使用多肽疫苗治療膽管癌伴肺轉移的病例，該疫苗通過誘導T細胞應答并使T細胞浸潤增加，在接種后44個月時患者仍處于無瘤生存期，提示治療有效；Neal等[23]的實驗證實，取材于患者腫瘤標本而創建的類器官模型可更好地保留原始腫瘤細胞的分子生物學特性，并且還發現程序性死亡受體1及其配體的免疫抑制劑可以通過激活腫瘤抗原特異性淋巴細胞而引起腫瘤細胞的死亡；另有研究[24]報道，程序性死亡受體1抑制劑對膽囊癌患者有一定的治療效果，但證據效力普遍較低，為獲得高級別證據，類器官模型或許能提供幫助。
總之，目前利用膽囊癌類器官來篩選治療藥物已取得一定的成果，膽囊癌類器官具有培養周期短的特點，通過類器官對新興藥物進行藥物敏感測試，不僅能節約成本、提高效率，也能加速有效治療方案進入臨床。但是目前膽囊癌治療前景較大的新興免疫治療方案還未應用于膽囊癌類器官中研究，希望通過了解這些研究進展為后續膽囊癌類器官應用于藥物篩選和個體化治療提供參考。
2.3 器官移植
類器官技術與再生醫學緊密相連，類器官技術誕生后，其應用于器官移植的實驗便不斷出現。2021年，Sampaziotis等[25]在Science雜志發表了其團隊最新研究成果，將膽囊類器官移植到離體狀態下的人肝臟中，觀察到膽管的再生和膽汁狀態的改變，首次證明了類器官移植在人體器官移植的可行性和巨大前景，為今后的臨床應用奠定了基礎。
3 膽囊癌類器官的挑戰與策略
近年來，類器官研究在腫瘤領域中進展迅速，在研究腫瘤的發病機制、藥物篩選、個體化治療等方面，類器官已顯示出了它明顯的優勢[26-30]。但是膽囊癌類器官研究仍然面臨著構建成功率低、構建的模型相對簡單、樣本來源少等困境，借助于其他類器官研究所取得的經驗，或許能加速膽囊癌類器官研究的步伐。
3.1 膽囊癌類器官構建成功的影響因素與策略
雖然目前類器官已成為近些年的研究熱點，但是模型構建成功率較低仍然是限制它快速發展的主要原因。膽囊癌類器官的構建成功率約為20%[12-13, 21]，與肝癌[5]、卵巢癌[6]、胰腺癌[31]等相比，仍有較大的提升空間，目前仍需深入研究影響類器官模型構建成功的因素。
首先，通常由于膽囊癌標本體積較小，標本內腫瘤細胞的絕對數量明顯少于肝癌、卵巢癌等其他實體腫瘤，提示腫瘤細胞的數量可能是影響類器官模型成敗的因素之一，而此前也有關于胃腸道類器官模型的研究提示類器官的成功構建與標本內腫瘤細胞的數量相關[12, 32]。其次，目前膽囊癌類器官的構建絕大多數取材于手術后的腫瘤組織，導致取材內不可避免地含有正常細胞。已有多項研究分別構建了膽管腫瘤類器官與正常膽管類器官，通過對比后發現，雖然正常細胞的增殖周期有限，但是在類器官模型培養的早期，正常細胞的增殖能力明顯強于腫瘤細胞，甚至出現了取材于腫瘤組織構建的類器官經過培育后形成的是正常膽管類器官的現象，隨后分析發現，原因在于取材的腫瘤組織中正常細胞占比過大，進一步分析后發現，膽囊長期慢性炎癥導致的炎-癌轉變，使得腫瘤組織內含大量纖維結締組織，導致在制備膽囊癌類器官的過程中腫瘤組織難以消化，而且消化后獲得的少量上皮細胞活力較低，從而影響了模型構建成功率[12, 21]，在結直腸癌類器官模型中也發現了此現象[33]。因此，目前膽囊癌標本內腫瘤細胞的絕對數量難以明顯提高，若取材于手術切除后的腫瘤組織時，必須細致分析細胞類型，盡可能完全消化，避免取材標本內正常細胞的占比過大，提高取材后細胞活力，爭取標本內的腫瘤細胞相對數量更高。
3.2 腫瘤微環境與新技術
血管、腫瘤相關纖維原細胞、免疫細胞（T淋巴細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞）等與疾病的致病及進展相關。腫瘤細胞為了生存和生長，采用諸多策略躲避機體的免疫監控，使得機體無法有效識別和殺傷腫瘤細胞，從而產生免疫耐受，通過控制免疫細胞形成免疫抑制的腫瘤微環境，以逃避宿主免疫監控，甚至促進腫瘤的發生及發展[34]。而類器官模型可以模擬腫瘤細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的相互作用關系，但如何做到復原體內真實腫瘤微環境也是面臨的挑戰之一。
目前，共培養、氣液界面、微流體、類器官芯片等新興技術[23, 35]已被應用于類器官的研究中，以期更好地研究腫瘤的真實情況。Gonzalez-Exposito團隊[36]通過構建耐多藥并轉移的結直腸癌類器官并成功與異基因CD8+ T淋巴細胞共同培養，發現西比沙他單抗能有效抑制該模型中腫瘤細胞的生長速度，并且還發現其敏感性與癌胚抗原的表達相關，阻斷Wnt/β連環蛋白通路可增強癌胚抗原的表達，通過此結直腸癌類器官中的研究結果提示了西比沙他單抗在結直腸癌中具備治療潛力；而在另一項結直腸類器官研究[37]中，當把脂肪細胞與腫瘤細胞共培養時，發現脂肪細胞可為腫瘤細胞的生長提供能量，并可調控腫瘤細胞的新陳代謝，促進腫瘤細胞的生長和生存，由此也解釋了肥胖是包括膽囊癌在內的一些腫瘤的高危因素。氣液界面技術是通過將實驗模型的底面植入培養基中，而頂面直接與空氣接觸。Usui等[38]應用氣液界面技術成功構建了結直腸癌類器官，正常結直腸類器官具有囊性結構包括上皮細胞、杯狀細胞以及成纖維細胞，而結直腸癌類器官包括上皮細胞、肌成纖維細胞和腫瘤干細胞。微流體技術及由微流體技術發展而來的類器官芯片，通過集成多種類器官來實現對腫瘤發展的宏觀研究，為腫瘤研究提供操作性更強的平臺[39]，但暫沒有相關技術應用于膽囊癌的研究中。因此，在未來的膽囊癌類器官研究中，通過加入脂肪細胞、免疫細胞等以及共培養等新興技術為研究膽囊癌更加真實的腫瘤微環境提供了新的思路。
4 總結與展望
雖然膽囊癌目前仍然面臨著高病死率、低生存率、治療方式單一等問題，但隨著對膽囊癌發病機制、臨床診斷方法、治療策略等更加深入的研究，這些問題會逐步得到解決。因膽囊癌類器官的構建主要取材于患者手術切除標本，加之新興技術如共培養和氣液界面技術的出現，在體外精確再現腫瘤的特性與微環境已成為可能。隨著單細胞測序技術的出現，通過比較不同細胞之間的異質性來發現膽囊癌的發病機制也成為當前的研究熱點，目前取得的成果也預示了診斷和治療的前景喜人。由于一些治療方式尚未批準用于臨床試驗，因此獲得治療后的標本比較困難。然而類器官的出現，將一些尚未批準用于臨床試驗的治療方案應用于類器官模型中，通過類器官模型對治療前、治療后的療效進行比較，可獲得更高級別的證據，加速新興治療方案進入臨床。現在，膽囊癌類器官的研究仍處于萌芽階段，其他腫瘤類器官模型所取得的經驗可以借鑒；同時人體是作為一個復雜的有機結合體，現有的類器官模型相對簡單，因此，如何構建結構更為復雜包含血管、神經、免疫等相互聯系的類器官模型，如何更加宏觀地研究腫瘤發展，是未來關注的新方向。
重要聲明
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作者貢獻聲明：葉寶龍負責文獻查閱、論文撰寫；丁凱負責修改論文；嵇武負責寫作思路、修改論文及定稿。