引用本文： 鄧雯, 龍婷, 杜英. 環指蛋白11調控Akt信號通路促進BMSCs成骨分化的機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(1): 102-110. doi: 10.7507/1002-1892.202107108 復制
骨缺損是骨科常見疾病之一，其治療手段主要有自體骨、同種異體骨或人工骨移植修復，但自體骨移植取材較復雜且增加了患者痛苦，同種異體骨移植存在免疫排斥、疾病傳播等問題，人工骨移植優點較多，但也存在諸多局限[1-2]。組織工程骨技術是骨缺損治療的主要發展方向。MSCs是一種在體內分布廣泛、來源豐富的多能祖細胞，免疫原性低，具有成脂、成軟骨和成骨多向分化潛能[1-3]。在附著于生物材料的情況下，MSCs可快速分化為成骨細胞，形成膜內骨[4-5]，不僅極大程度解決了免疫排斥問題，還可以結合3D打印技術實現精準、可控的骨缺損修復[6-7]。Maruyama等[8-9]研究還發現，MSCs與免疫細胞共同參與骨愈合的炎癥階段，相互拮抗以調節骨愈合過程。然而，調控MSCs成骨分化的分子機制尚未完全闡明，阻礙了臨床上基于MSCs的骨缺損細胞療法進一步發展[1]。因此，有必要進一步闡明MSCs成骨分化的分子調控機制。
Akt是PI3K的下游效應分子，PI3K/Akt信號通路在細胞增殖、分化、凋亡過程中起著重要作用，尤其是軟骨細胞、成骨細胞、成肌細胞和脂肪細胞[10]。PI3K/Akt信號通路的活化有助于抑制骨質疏松[11]。Peng等[12]發現當敲除Akt1和Akt2基因時，小鼠會表現出嚴重的生長發育障礙，包括骨骼發育遲緩、皮膚發育不全、骨骼肌萎縮和成脂障礙。環指蛋白11（ring finger protein 11，RNF11）是環指蛋白家族中的重要成員之一，由154個氨基酸構成，在生物進化過程中有高度保守性[13-15]。RNF11在生物體內發揮重要作用，包括細胞中的物質運輸、信號傳導以及腫瘤發生等[16]，其通過E3泛素連接酶屬性參與多種生理及病理過程[14，17-19]。既往研究已發現RNF11在骨骼中表達豐度很高[20]，但其在骨骼發育中的作用卻鮮有研究。本研究通過敲低RNF11在BMSCs中的表達后，檢測Akt信號通路蛋白的表達，探討RNF11如何參與調控BMSCs成骨分化過程。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
健康人體新鮮骨髓樣品由志愿者捐贈。293T細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。DMEM培養基（HyClone公司，美國）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，德國）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；重組慢病毒載體（上海吉凱基因醫學科技股份有限公司）；PrimeScript Ⅱ cDNA合成試劑盒（D6210A）（Takara公司，日本）；茜素紅（上海中喬新舟生物科技有限公司）；阿利新藍、ALP、油紅O染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。Merinton MA1000顯微分光光度計（北京美林恒通儀器有限公司）；LightCycler480 PCR system（Roche公司，瑞士）；Immobilon Western Chemiluminescent辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）底物曝光（Millipore公司，德國）；Coulter流式細胞儀系統（Beckman Coulter公司，美國）；石蠟切片機、石蠟包埋機（Leica公司，德國）。
1.2 BMSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 BMSCs分離培養
取健康人體新鮮骨髓樣品，分離、純化后接種至12孔板，使用含10%FBS的DMEM培養基進行重懸和培養（培養條件為37℃、5%CO2），每3天更換1次培養液。當細胞融合度達90%左右時進行傳代，取第4代細胞進行以下實驗。
1.2.2 BMSCs鑒定
① 流式細胞術：取獲得的第4代細胞與抗CD14、CD45、HLA-DR、CD29、CD44、CD105抗體于4℃下孵育30 min，然后離心洗滌細胞，通過流式細胞儀系統進行分析。② BMSCs分化潛能檢測：取獲得的第4代細胞，行成骨、成軟骨及成脂誘導分化14 d后，分別行茜素紅染色、阿利新藍染色和油紅O染色觀察。
1.3 RNF11在BMSCs成骨分化過程中的表達
1.3.1 BMSCs成骨分化規律
于BMSCs成骨誘導分化0、3、7、10、14 d，分別行茜素紅染色［以562 nm處吸光度（A）值作為陽性染色鈣結節數量］和ALP染色（檢測ALP活性）定量檢測，觀察BMSCs的成骨分化規律。
1.3.2 Western blot檢測RNF11在BMSCs成骨分化過程中的表達
于BMSCs成骨誘導分化第0、3、7、10、14天，使用RIPA裂解BMSCs，提取細胞裂解液，于4℃以離心半徑20 cm、12 000 r/min離心30 min，然后加入Loading buffer混勻煮沸。用等量蛋白質上樣至10%SDS-PAGE中，電泳分離，再轉印至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉1 h；加入GAPDH、RNF11一抗（1∶1 000）孵育過夜，TBST洗滌3次；用HRP偶聯的二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌3次；最后用Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物曝光檢測RNF11蛋白相對表達量。
1.4 下調RNF11對BMSCs體外成骨分化能力的影響
1.4.1 實驗分組
取第4代BMSCs，分為空白對照組（A組）、空載慢病毒（Lv-NC）組（B組）和敲低RNF11（Lv-ShRNF11）組（C組）。A組不作任何處理，B、C組細胞分別轉染慢病毒Lv-NC和Lv-ShRNF11。慢病毒轉染方法：選一段最佳敲除序列構建慢病毒載體，然后通過轉染將質粒包裝至293T細胞中；轉染72 h后以離心半徑20 cm、12 000 r/min離心30 min，將含有慢病毒的上清液轉移至另一管中并濃縮；將濃縮液與聚丙烯添加至BMSCs中孵育24 h，然后將培養基更換為成骨誘導分化培養基。
1.4.2 觀測指標
① 各組成骨誘導分化3、7、10、14 d，同上法采用Western blot檢測RNF11蛋白表達，茜素紅染色定量檢測陽性鈣結節數量，ALP染色檢測ALP活性。② 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測：各組成骨誘導分化14 d去除培養基，加入1 mL Trizol裂解細胞，室溫孵育5 min，Trizol提取細胞RNA，用Merinton MA1000顯微分光光度計在260 nm和280 nm處測量A值，用PrimeScript Ⅱ cDNA合成試劑盒（D6210A）生成cDNA模板，然后用LightCycler480 PCR system進行qRT-PCR檢測，以GAPDH為內參，采用2?ΔΔCt法計算BMSCs成骨標志物Runx2、骨鈣素（osteocalcin，OCN）及骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的mRNA相對表達量。引物序列見表1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR genes
1.5 RNF11對Akt信號通路的影響
1.5.1 RNF11與Akt信號通路蛋白相對表達量在BMSCs成骨分化過程中的表達
取第4代BMSCs行成骨誘導分化培養，培養0、7、14 d時，同上法采用Western blot檢測RNF11及Akt信號通路蛋白相對表達量，后者以磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）/Akt比值表示。
1.5.2 下調RNF11對Akt信號通路的影響
同1.4.1方法分組，于各組成骨誘導分化培養14 d，采用Western blot檢測β-catenin、Akt及Smad1/5/8信號通路蛋白相對表達量，分別以p-β-catenin/β-catenin、p-Akt/Akt、p-Smad1/Smad1比值表示。
1.6 RNF11對Akt信號通路的影響機制
1.6.1 實驗分組
取第4代BMSCs，分為Lv-NC轉染組（A1組）、Lv-ShRNF11轉染組（B1組）和添加Akt信號通路激活劑SC79（3 μg/mL）的Lv-ShRNF11轉染組（C1組）。慢病毒轉染方法同1.4.1。轉染后各組行成骨誘導分化。
1.6.2 觀測指標
各組成骨誘導分化14 d，同上法采用Western blot檢測RNF11和Akt信號通路蛋白相對表達量，茜素紅染色定量檢測陽性鈣結節數量，ALP染色檢測ALP活性，qRT-PCR檢測Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量。
1.7 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs鑒定
流式細胞術檢測示，所培養細胞表面標志物CD14、CD45、HLA-DR表達呈陰性，而CD29、CD44及CD105表達呈陽性，與MSCs表面標志物表達模式一致。見圖1。成骨誘導分化14 d后茜素紅染色可見紅色鈣結節，成軟骨誘導分化14 d阿利新藍染色可見深藍色結節，成脂誘導分化14 d油紅O染色可見紅色脂滴。見圖2。提示分離獲得的細胞為BMSCs。
圖1
BMSCs流式細胞術鑒定
a. CD14；b. CD45；c. HLA-DR；d. CD29；e. CD44；f. CD105
Figure1. Identification of BMSCs by flow cytometrya. CD14; b. CD45; c. HLA-DR; d. CD29; e. CD44; f. CD105
圖2
BMSCs各向分化潛能鑒定
a. 茜素紅染色（×40）；b. 阿爾新藍染色（×100）；c. 油紅O染色（×40）
Figure2. Identification of multipotential differentiation of BMSCsa. Alizarin red staining (×40); b. Alcian blue staining (×100); c. Oil red O staining (×40)
2.2 RNF11在BMSCs成骨分化過程中的表達
隨BMSCs成骨誘導分化時間延長，茜素紅染色陽性鈣結節數量和ALP活性均逐漸增加，成熟程度逐漸上升，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05），符合MSCs成骨的一般規律。見圖3、4。Western blot檢測示，隨BMSCs成骨誘導分化時間延長，RNF11蛋白相對表達量亦呈逐漸增加趨勢，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05），提示RNF11可能參與了BMSCs成骨分化過程。見圖5。
圖3
BMSCs成骨分化規律觀察（×40）
從左至右分別為培養0、3、7、10、14 d a. 茜素紅染色；b. ALP染色
Figure3. Observation on the osteogenic differentiation regularity of BMSCs (×40)From left to right for cultured 0, 3, 7, 10, and 14 days a. Alizarin red staining; b. ALP staining
圖4
BMSCs成骨分化定量檢測
a. 茜素紅染色；b. ALP活性
Figure4. Quantitative detection of BMSCs osteogenesisa. Alizarin red staining; b. ALP activity
圖5
Western blot檢測RNF11在BMSCs成骨分化過程中的表達
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：0 d 2：3 d 3：7 d 4：10 d 5：14 d；b. RNF11蛋白相對表達量
Figure5. Expression of RNF11 during BMSCs osteogenesis detected by Western blota. Electrophoresis Mr: Relative molecular weight 1: 0 day 2: 3 days 3: 7 days 4: 10 days 5: 14 days; b. RNF11 protein relative expression
2.3 下調RNF11對BMSCs體外成骨分化能力的影響
各組成骨誘導分化14 d檢測示，C組RNF11蛋白相對表達量、陽性鈣結節數量、ALP活性及Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量均顯著低于A、B組，差異均有統計學意義（P<0.05）。提示下調BMSCs中RNF11表達將抑制其成骨分化能力。見圖6、7。
圖6
下調RNF11對BMSCs體外成骨分化能力的影響
a. Western blot檢測電泳圖 Mr：相對分子質量 1：A組 2：B組 3：C組；b. 茜素紅染色（×40） 從左至右依次為A、B、C組；c. ALP染色（×40） 從左至右依次為A、B、C組
Figure6. The influence of knockdown RNF11 on osteogenic differentiation of BMSCs in vitroa. Electrophoresis of Western blot Mr: Relative molecular weight 1: Group A 2: Group B 3: Group C; b. Alizarin red staining (×40) From left to right for groups A, B, and C, respectively; c. ALP staining (×40) From left to right for groups A, B, and C, respectively
圖7
下調RNF11對BMSCs體外成骨分化能力影響定量分析
*P<0.05 a. RNF11蛋白相對表達量；b. 茜素紅染色；c. ALP活性；d～f. qRT-PCR檢測Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量
Figure7. Quantitative analysis of the influence of knockdown RNF11 on osteogenic differentiation of BMSCs in vitro*P<0.05 a. RNF11 protein relative expression; b. Alizarin red staining; c. ALP activity; d-f. Relative expressions of Runx2, OCN, and OPN mRNA detected by qRT-PCR
2.4 RNF11對Akt信號通路的影響
隨BMSCs成骨誘導分化時間延長，RNF11與Akt信號通路蛋白相對表達量均逐漸增加，各時間點間差異有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
Western blot檢測成骨分化前后RNF11與Akt信號通路蛋白表達
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：0 d 2：7 d 3：14 d；b. RNF11蛋白相對表達量；c. Akt信號通路蛋白相對表達量
Figure8. Western blot detection of RNF11 and Akt signaling pathway protein expressions before and after osteogenic differentiationa. Electrophoresis Mr: Relative molecular weight 1: 0 day 2: 7 days 3: 14 days; b. RNF11 protein relative expression; c. Relative protein expression of Akt signaling pathway
下調RNF11實驗中，各組β-catenin及Smad1/5/8信號通路蛋白相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）；C組Akt信號通路蛋白相對表達量顯著低于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖9。提示RNF11可能是通過影響Akt信號通路激活來參與BMSCs的體外成骨分化過程。
圖9
下調RNF11對Akt信號通路的影響
a. Western blot檢測電泳圖 Mr：相對分子質量 1：A組 2：B組 3：C組；b～d. 分別為β-catenin、Akt、Smad1/5/8信號通路蛋白相對表達量 *P<0.05
Figure9. The influence of knockdown RNF11 on Akt signaling pathwaya. Electrophoresis of Western blot Mr: Relative molecular weight 1: Group A 2: Group B 3: Group C; b-d. Protein relative expressions of β-catenin, Akt, and Smad1/5/8 signaling pathway, respectively*P<0.05
2.5 RNF11對Akt信號通路的影響機制
B1、C1組RNF11蛋白相對表達量顯著低于A1組，差異有統計學意義（P<0.05）；B1、C1組間差異無統計學意義（P>0.05）。與A1、C1組比較，B1組Akt信號通路蛋白相對表達量、陽性鈣結節數量、ALP活性及成骨標志物Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量均顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05）；添加了SC79的C1組可逆轉上述效果，與A1組比較上述指標差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖10、11。提示RNF11可能通過激活Akt信號通路促進BMSCs成骨分化。
圖10
激活Akt信號通路對下調RNF11后BMSCs成骨分化的影響
a. Western blot檢測電泳圖 Mr：相對分子質量 1：A1組 2：B1組 3：C1組；b. 茜素紅染色（×40） 從左至右依次為A1、B1、C1組；c. ALP染色（×40） 從左至右依次為A1、B1、C1組
Figure10. The influence of activating Akt signaling pathway on osteogena. Electrophoresis of Western blot Mr: Relative molecular weight 1: Group A1 2: Group B1 3: Group C1; b. Alizarin red staining (×40) From left to right for groups A1, B1, and C1, respectively; c. ALP staining (×40) From left to right for groups A1, B1, and C1, respectively
圖11
激活Akt信號通路對下調RNF11后BMSCs成骨分化影響的定量分析
*P<0.05 a. RNF11蛋白相對表達量；b. Akt信號通路蛋白相對表達量；c. 茜素紅染色；d. ALP活性；e～g. qRT-PCR檢測Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量
Figure11. Quantitative analysis of the influence of activating Akt signaling pathway on osteogenic differentiation of BMSCs after knockdown RNF11*P<0.05 a. Relative protein expression of RNF11; b. Relative protein expression of Akt signaling pathway; c. Alizarin red staining; d. ALP activity; e-g. Relative expressions of Runx2, OCN, and OPN mRNA detected by qRT-PCR
3 討論
組織工程骨技術修復骨缺損雖然目前仍在研究階段，但有極大臨床應用前景。BMSCs作為組織工程骨的三大要素之一，研究其成骨分化過程的調控因子和機制一直是此領域的熱點。
RNF11是環指蛋白家族中的重要成員之一，通過PY基序結合HECT型E3泛素連接酶Smurf2和AIP4，介導多種細胞蛋白的降解[21]。盡管已有研究表明RNF11減少或功能受損可能與神經退行性疾病有關[22-23]，但與BMSCs成骨分化相關研究較少。Gao等[20]在研究成骨機制過程中發現，在小鼠成骨發育的體外模型中，胚胎成骨過程中最早階段表達的轉錄因子Est1能夠結合RNF11的啟動子，且RNF11水平與成骨分化程度成正相關，但并未深入研究。本研究中，我們發現RNF11在BMSCs成骨分化過程中表達明顯上調，且與之成正相關；以慢病毒構建敲低RNF11的BMSCs模型，茜素紅、ALP染色示C組成骨分化程度低于A、B組，提示RNF11參與BMSCs成骨分化過程，與Gao等的研究結果一致。
為進一步探究RNF11如何影響BMSCs成骨分化，分別檢測A、B、C組與BMSCs成骨分化密切相關的Akt、Smad1/5/8、β-catenin信號通路的激活水平[24]。Western blot結果顯示，相較于A、B組，C組的Akt信號通路顯著受抑制，而對Smad1/5/8和β-catenin信號通路激活水平無明顯影響，且RNF11蛋白表達和Akt信號通路激活水平均與BMSCs成骨分化程度成正相關。提示在此過程中兩者可能共同發揮作用。為探究兩者的關系，我們在實驗中添加Akt信號通路激活劑SC79[25]，茜素紅、ALP染色以及對成骨標志物Runx2、OCN及OPN mRNA的定量分析結果顯示，C1組成骨分化水平略低于A1組，但明顯高于B1組。分析原因可能是RNF11在BMSCs分化過程中通過激活Akt信號通路表達來促進成骨分化，成骨細胞合成大量Runx2、OCN及OPN，因此下調RNF11時，Akt信號通路激活受抑制，成骨分化水平降低；添加SC79使Akt信號通路激活水平升高后，成骨分化水平重新升高，但激活不完全，因而略低于A1組。
RNF11在機體還具有抑制炎癥反應的作用。據報道，由A20-TAX1BP1-Itch-RNF11共同構成的A20泛素編輯酶復合物能夠下調NF-κB信號通路，確保炎癥反應的短暫性，其中RNF11的PPXY基序負責招募Itch到TAX1BP1形成A20泛素編輯酶復合物[26]。由此推斷，若將RNF11運用到BMSCs對骨缺損的臨床治療中，可能有一定抗炎作用，能減輕機體損傷，減少其他抗炎藥物的使用，但有待進一步實驗研究明確。
近年有很多關于Akt信號通路調控成骨分化的分子機制研究。Zhao等[27]研究顯示巨噬細胞MSR1通過激活Akt信號通路促進BMSCs成骨分化，Yang等[28]研究表明miRNA-21通過激活Akt信號通路促進BMSCs成骨分化來促進犬頜面骨再生。提示Akt信號通路調控成骨分化受到多種因素的共同作用，分子間相互協同，共同完成骨修復過程。
綜上述，本研究結果表明RNF11通過正向調控Akt信號通路激活水平促進BMSCs向成骨細胞分化。但本研究也存在不足之處：首先，實驗采用離體培養的BMSCs，未在動物體內驗證，可能會造成實驗結果偏倚，也無法驗證將其運用于機體時是否會對其他系統產生影響。第二，未探究在病理條件下RNF11對BMSCs的成骨分化作用是否會受影響。第三，未探究RNF11在BMSCs成骨分化其他重要過程中的作用，如破骨細胞形成、炎癥等。以上不足有待進一步研究完善。
作者貢獻：鄧雯負責研究設計、數據收集整理、統計分析；龍婷負責論文撰寫；杜英負責對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究方案經鄭州大學生命科學倫理審查委員會批準。
骨缺損是骨科常見疾病之一，其治療手段主要有自體骨、同種異體骨或人工骨移植修復，但自體骨移植取材較復雜且增加了患者痛苦，同種異體骨移植存在免疫排斥、疾病傳播等問題，人工骨移植優點較多，但也存在諸多局限[1-2]。組織工程骨技術是骨缺損治療的主要發展方向。MSCs是一種在體內分布廣泛、來源豐富的多能祖細胞，免疫原性低，具有成脂、成軟骨和成骨多向分化潛能[1-3]。在附著于生物材料的情況下，MSCs可快速分化為成骨細胞，形成膜內骨[4-5]，不僅極大程度解決了免疫排斥問題，還可以結合3D打印技術實現精準、可控的骨缺損修復[6-7]。Maruyama等[8-9]研究還發現，MSCs與免疫細胞共同參與骨愈合的炎癥階段，相互拮抗以調節骨愈合過程。然而，調控MSCs成骨分化的分子機制尚未完全闡明，阻礙了臨床上基于MSCs的骨缺損細胞療法進一步發展[1]。因此，有必要進一步闡明MSCs成骨分化的分子調控機制。
Akt是PI3K的下游效應分子，PI3K/Akt信號通路在細胞增殖、分化、凋亡過程中起著重要作用，尤其是軟骨細胞、成骨細胞、成肌細胞和脂肪細胞[10]。PI3K/Akt信號通路的活化有助于抑制骨質疏松[11]。Peng等[12]發現當敲除Akt1和Akt2基因時，小鼠會表現出嚴重的生長發育障礙，包括骨骼發育遲緩、皮膚發育不全、骨骼肌萎縮和成脂障礙。環指蛋白11（ring finger protein 11，RNF11）是環指蛋白家族中的重要成員之一，由154個氨基酸構成，在生物進化過程中有高度保守性[13-15]。RNF11在生物體內發揮重要作用，包括細胞中的物質運輸、信號傳導以及腫瘤發生等[16]，其通過E3泛素連接酶屬性參與多種生理及病理過程[14，17-19]。既往研究已發現RNF11在骨骼中表達豐度很高[20]，但其在骨骼發育中的作用卻鮮有研究。本研究通過敲低RNF11在BMSCs中的表達后，檢測Akt信號通路蛋白的表達，探討RNF11如何參與調控BMSCs成骨分化過程。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
健康人體新鮮骨髓樣品由志愿者捐贈。293T細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。DMEM培養基（HyClone公司，美國）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，德國）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；重組慢病毒載體（上海吉凱基因醫學科技股份有限公司）；PrimeScript Ⅱ cDNA合成試劑盒（D6210A）（Takara公司，日本）；茜素紅（上海中喬新舟生物科技有限公司）；阿利新藍、ALP、油紅O染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。Merinton MA1000顯微分光光度計（北京美林恒通儀器有限公司）；LightCycler480 PCR system（Roche公司，瑞士）；Immobilon Western Chemiluminescent辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）底物曝光（Millipore公司，德國）；Coulter流式細胞儀系統（Beckman Coulter公司，美國）；石蠟切片機、石蠟包埋機（Leica公司，德國）。
1.2 BMSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 BMSCs分離培養
取健康人體新鮮骨髓樣品，分離、純化后接種至12孔板，使用含10%FBS的DMEM培養基進行重懸和培養（培養條件為37℃、5%CO2），每3天更換1次培養液。當細胞融合度達90%左右時進行傳代，取第4代細胞進行以下實驗。
1.2.2 BMSCs鑒定
① 流式細胞術：取獲得的第4代細胞與抗CD14、CD45、HLA-DR、CD29、CD44、CD105抗體于4℃下孵育30 min，然后離心洗滌細胞，通過流式細胞儀系統進行分析。② BMSCs分化潛能檢測：取獲得的第4代細胞，行成骨、成軟骨及成脂誘導分化14 d后，分別行茜素紅染色、阿利新藍染色和油紅O染色觀察。
1.3 RNF11在BMSCs成骨分化過程中的表達
1.3.1 BMSCs成骨分化規律
于BMSCs成骨誘導分化0、3、7、10、14 d，分別行茜素紅染色［以562 nm處吸光度（A）值作為陽性染色鈣結節數量］和ALP染色（檢測ALP活性）定量檢測，觀察BMSCs的成骨分化規律。
1.3.2 Western blot檢測RNF11在BMSCs成骨分化過程中的表達
于BMSCs成骨誘導分化第0、3、7、10、14天，使用RIPA裂解BMSCs，提取細胞裂解液，于4℃以離心半徑20 cm、12 000 r/min離心30 min，然后加入Loading buffer混勻煮沸。用等量蛋白質上樣至10%SDS-PAGE中，電泳分離，再轉印至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉1 h；加入GAPDH、RNF11一抗（1∶1 000）孵育過夜，TBST洗滌3次；用HRP偶聯的二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌3次；最后用Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物曝光檢測RNF11蛋白相對表達量。
1.4 下調RNF11對BMSCs體外成骨分化能力的影響
1.4.1 實驗分組
取第4代BMSCs，分為空白對照組（A組）、空載慢病毒（Lv-NC）組（B組）和敲低RNF11（Lv-ShRNF11）組（C組）。A組不作任何處理，B、C組細胞分別轉染慢病毒Lv-NC和Lv-ShRNF11。慢病毒轉染方法：選一段最佳敲除序列構建慢病毒載體，然后通過轉染將質粒包裝至293T細胞中；轉染72 h后以離心半徑20 cm、12 000 r/min離心30 min，將含有慢病毒的上清液轉移至另一管中并濃縮；將濃縮液與聚丙烯添加至BMSCs中孵育24 h，然后將培養基更換為成骨誘導分化培養基。
1.4.2 觀測指標
① 各組成骨誘導分化3、7、10、14 d，同上法采用Western blot檢測RNF11蛋白表達，茜素紅染色定量檢測陽性鈣結節數量，ALP染色檢測ALP活性。② 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測：各組成骨誘導分化14 d去除培養基，加入1 mL Trizol裂解細胞，室溫孵育5 min，Trizol提取細胞RNA，用Merinton MA1000顯微分光光度計在260 nm和280 nm處測量A值，用PrimeScript Ⅱ cDNA合成試劑盒（D6210A）生成cDNA模板，然后用LightCycler480 PCR system進行qRT-PCR檢測，以GAPDH為內參，采用2?ΔΔCt法計算BMSCs成骨標志物Runx2、骨鈣素（osteocalcin，OCN）及骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的mRNA相對表達量。引物序列見表1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR genes
1.5 RNF11對Akt信號通路的影響
1.5.1 RNF11與Akt信號通路蛋白相對表達量在BMSCs成骨分化過程中的表達
取第4代BMSCs行成骨誘導分化培養，培養0、7、14 d時，同上法采用Western blot檢測RNF11及Akt信號通路蛋白相對表達量，后者以磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）/Akt比值表示。
1.5.2 下調RNF11對Akt信號通路的影響
同1.4.1方法分組，于各組成骨誘導分化培養14 d，采用Western blot檢測β-catenin、Akt及Smad1/5/8信號通路蛋白相對表達量，分別以p-β-catenin/β-catenin、p-Akt/Akt、p-Smad1/Smad1比值表示。
1.6 RNF11對Akt信號通路的影響機制
1.6.1 實驗分組
取第4代BMSCs，分為Lv-NC轉染組（A1組）、Lv-ShRNF11轉染組（B1組）和添加Akt信號通路激活劑SC79（3 μg/mL）的Lv-ShRNF11轉染組（C1組）。慢病毒轉染方法同1.4.1。轉染后各組行成骨誘導分化。
1.6.2 觀測指標
各組成骨誘導分化14 d，同上法采用Western blot檢測RNF11和Akt信號通路蛋白相對表達量，茜素紅染色定量檢測陽性鈣結節數量，ALP染色檢測ALP活性，qRT-PCR檢測Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量。
1.7 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs鑒定
流式細胞術檢測示，所培養細胞表面標志物CD14、CD45、HLA-DR表達呈陰性，而CD29、CD44及CD105表達呈陽性，與MSCs表面標志物表達模式一致。見圖1。成骨誘導分化14 d后茜素紅染色可見紅色鈣結節，成軟骨誘導分化14 d阿利新藍染色可見深藍色結節，成脂誘導分化14 d油紅O染色可見紅色脂滴。見圖2。提示分離獲得的細胞為BMSCs。
圖1
BMSCs流式細胞術鑒定
a. CD14；b. CD45；c. HLA-DR；d. CD29；e. CD44；f. CD105
Figure1. Identification of BMSCs by flow cytometrya. CD14; b. CD45; c. HLA-DR; d. CD29; e. CD44; f. CD105
圖2
BMSCs各向分化潛能鑒定
a. 茜素紅染色（×40）；b. 阿爾新藍染色（×100）；c. 油紅O染色（×40）
Figure2. Identification of multipotential differentiation of BMSCsa. Alizarin red staining (×40); b. Alcian blue staining (×100); c. Oil red O staining (×40)
2.2 RNF11在BMSCs成骨分化過程中的表達
隨BMSCs成骨誘導分化時間延長，茜素紅染色陽性鈣結節數量和ALP活性均逐漸增加，成熟程度逐漸上升，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05），符合MSCs成骨的一般規律。見圖3、4。Western blot檢測示，隨BMSCs成骨誘導分化時間延長，RNF11蛋白相對表達量亦呈逐漸增加趨勢，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05），提示RNF11可能參與了BMSCs成骨分化過程。見圖5。
圖3
BMSCs成骨分化規律觀察（×40）
從左至右分別為培養0、3、7、10、14 d a. 茜素紅染色；b. ALP染色
Figure3. Observation on the osteogenic differentiation regularity of BMSCs (×40)From left to right for cultured 0, 3, 7, 10, and 14 days a. Alizarin red staining; b. ALP staining
圖4
BMSCs成骨分化定量檢測
a. 茜素紅染色；b. ALP活性
Figure4. Quantitative detection of BMSCs osteogenesisa. Alizarin red staining; b. ALP activity
圖5
Western blot檢測RNF11在BMSCs成骨分化過程中的表達
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：0 d 2：3 d 3：7 d 4：10 d 5：14 d；b. RNF11蛋白相對表達量
Figure5. Expression of RNF11 during BMSCs osteogenesis detected by Western blota. Electrophoresis Mr: Relative molecular weight 1: 0 day 2: 3 days 3: 7 days 4: 10 days 5: 14 days; b. RNF11 protein relative expression
2.3 下調RNF11對BMSCs體外成骨分化能力的影響
各組成骨誘導分化14 d檢測示，C組RNF11蛋白相對表達量、陽性鈣結節數量、ALP活性及Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量均顯著低于A、B組，差異均有統計學意義（P<0.05）。提示下調BMSCs中RNF11表達將抑制其成骨分化能力。見圖6、7。
圖6
下調RNF11對BMSCs體外成骨分化能力的影響
a. Western blot檢測電泳圖 Mr：相對分子質量 1：A組 2：B組 3：C組；b. 茜素紅染色（×40） 從左至右依次為A、B、C組；c. ALP染色（×40） 從左至右依次為A、B、C組
Figure6. The influence of knockdown RNF11 on osteogenic differentiation of BMSCs in vitroa. Electrophoresis of Western blot Mr: Relative molecular weight 1: Group A 2: Group B 3: Group C; b. Alizarin red staining (×40) From left to right for groups A, B, and C, respectively; c. ALP staining (×40) From left to right for groups A, B, and C, respectively
圖7
下調RNF11對BMSCs體外成骨分化能力影響定量分析
*P<0.05 a. RNF11蛋白相對表達量；b. 茜素紅染色；c. ALP活性；d～f. qRT-PCR檢測Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量
Figure7. Quantitative analysis of the influence of knockdown RNF11 on osteogenic differentiation of BMSCs in vitro*P<0.05 a. RNF11 protein relative expression; b. Alizarin red staining; c. ALP activity; d-f. Relative expressions of Runx2, OCN, and OPN mRNA detected by qRT-PCR
2.4 RNF11對Akt信號通路的影響
隨BMSCs成骨誘導分化時間延長，RNF11與Akt信號通路蛋白相對表達量均逐漸增加，各時間點間差異有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
Western blot檢測成骨分化前后RNF11與Akt信號通路蛋白表達
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：0 d 2：7 d 3：14 d；b. RNF11蛋白相對表達量；c. Akt信號通路蛋白相對表達量
Figure8. Western blot detection of RNF11 and Akt signaling pathway protein expressions before and after osteogenic differentiationa. Electrophoresis Mr: Relative molecular weight 1: 0 day 2: 7 days 3: 14 days; b. RNF11 protein relative expression; c. Relative protein expression of Akt signaling pathway
下調RNF11實驗中，各組β-catenin及Smad1/5/8信號通路蛋白相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）；C組Akt信號通路蛋白相對表達量顯著低于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖9。提示RNF11可能是通過影響Akt信號通路激活來參與BMSCs的體外成骨分化過程。
圖9
下調RNF11對Akt信號通路的影響
a. Western blot檢測電泳圖 Mr：相對分子質量 1：A組 2：B組 3：C組；b～d. 分別為β-catenin、Akt、Smad1/5/8信號通路蛋白相對表達量 *P<0.05
Figure9. The influence of knockdown RNF11 on Akt signaling pathwaya. Electrophoresis of Western blot Mr: Relative molecular weight 1: Group A 2: Group B 3: Group C; b-d. Protein relative expressions of β-catenin, Akt, and Smad1/5/8 signaling pathway, respectively*P<0.05
2.5 RNF11對Akt信號通路的影響機制
B1、C1組RNF11蛋白相對表達量顯著低于A1組，差異有統計學意義（P<0.05）；B1、C1組間差異無統計學意義（P>0.05）。與A1、C1組比較，B1組Akt信號通路蛋白相對表達量、陽性鈣結節數量、ALP活性及成骨標志物Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量均顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05）；添加了SC79的C1組可逆轉上述效果，與A1組比較上述指標差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖10、11。提示RNF11可能通過激活Akt信號通路促進BMSCs成骨分化。
圖10
激活Akt信號通路對下調RNF11后BMSCs成骨分化的影響
a. Western blot檢測電泳圖 Mr：相對分子質量 1：A1組 2：B1組 3：C1組；b. 茜素紅染色（×40） 從左至右依次為A1、B1、C1組；c. ALP染色（×40） 從左至右依次為A1、B1、C1組
Figure10. The influence of activating Akt signaling pathway on osteogena. Electrophoresis of Western blot Mr: Relative molecular weight 1: Group A1 2: Group B1 3: Group C1; b. Alizarin red staining (×40) From left to right for groups A1, B1, and C1, respectively; c. ALP staining (×40) From left to right for groups A1, B1, and C1, respectively
圖11
激活Akt信號通路對下調RNF11后BMSCs成骨分化影響的定量分析
*P<0.05 a. RNF11蛋白相對表達量；b. Akt信號通路蛋白相對表達量；c. 茜素紅染色；d. ALP活性；e～g. qRT-PCR檢測Runx2、OCN、OPN mRNA相對表達量
Figure11. Quantitative analysis of the influence of activating Akt signaling pathway on osteogenic differentiation of BMSCs after knockdown RNF11*P<0.05 a. Relative protein expression of RNF11; b. Relative protein expression of Akt signaling pathway; c. Alizarin red staining; d. ALP activity; e-g. Relative expressions of Runx2, OCN, and OPN mRNA detected by qRT-PCR
3 討論
組織工程骨技術修復骨缺損雖然目前仍在研究階段，但有極大臨床應用前景。BMSCs作為組織工程骨的三大要素之一，研究其成骨分化過程的調控因子和機制一直是此領域的熱點。
RNF11是環指蛋白家族中的重要成員之一，通過PY基序結合HECT型E3泛素連接酶Smurf2和AIP4，介導多種細胞蛋白的降解[21]。盡管已有研究表明RNF11減少或功能受損可能與神經退行性疾病有關[22-23]，但與BMSCs成骨分化相關研究較少。Gao等[20]在研究成骨機制過程中發現，在小鼠成骨發育的體外模型中，胚胎成骨過程中最早階段表達的轉錄因子Est1能夠結合RNF11的啟動子，且RNF11水平與成骨分化程度成正相關，但并未深入研究。本研究中，我們發現RNF11在BMSCs成骨分化過程中表達明顯上調，且與之成正相關；以慢病毒構建敲低RNF11的BMSCs模型，茜素紅、ALP染色示C組成骨分化程度低于A、B組，提示RNF11參與BMSCs成骨分化過程，與Gao等的研究結果一致。
為進一步探究RNF11如何影響BMSCs成骨分化，分別檢測A、B、C組與BMSCs成骨分化密切相關的Akt、Smad1/5/8、β-catenin信號通路的激活水平[24]。Western blot結果顯示，相較于A、B組，C組的Akt信號通路顯著受抑制，而對Smad1/5/8和β-catenin信號通路激活水平無明顯影響，且RNF11蛋白表達和Akt信號通路激活水平均與BMSCs成骨分化程度成正相關。提示在此過程中兩者可能共同發揮作用。為探究兩者的關系，我們在實驗中添加Akt信號通路激活劑SC79[25]，茜素紅、ALP染色以及對成骨標志物Runx2、OCN及OPN mRNA的定量分析結果顯示，C1組成骨分化水平略低于A1組，但明顯高于B1組。分析原因可能是RNF11在BMSCs分化過程中通過激活Akt信號通路表達來促進成骨分化，成骨細胞合成大量Runx2、OCN及OPN，因此下調RNF11時，Akt信號通路激活受抑制，成骨分化水平降低；添加SC79使Akt信號通路激活水平升高后，成骨分化水平重新升高，但激活不完全，因而略低于A1組。
RNF11在機體還具有抑制炎癥反應的作用。據報道，由A20-TAX1BP1-Itch-RNF11共同構成的A20泛素編輯酶復合物能夠下調NF-κB信號通路，確保炎癥反應的短暫性，其中RNF11的PPXY基序負責招募Itch到TAX1BP1形成A20泛素編輯酶復合物[26]。由此推斷，若將RNF11運用到BMSCs對骨缺損的臨床治療中，可能有一定抗炎作用，能減輕機體損傷，減少其他抗炎藥物的使用，但有待進一步實驗研究明確。
近年有很多關于Akt信號通路調控成骨分化的分子機制研究。Zhao等[27]研究顯示巨噬細胞MSR1通過激活Akt信號通路促進BMSCs成骨分化，Yang等[28]研究表明miRNA-21通過激活Akt信號通路促進BMSCs成骨分化來促進犬頜面骨再生。提示Akt信號通路調控成骨分化受到多種因素的共同作用，分子間相互協同，共同完成骨修復過程。
綜上述，本研究結果表明RNF11通過正向調控Akt信號通路激活水平促進BMSCs向成骨細胞分化。但本研究也存在不足之處：首先，實驗采用離體培養的BMSCs，未在動物體內驗證，可能會造成實驗結果偏倚，也無法驗證將其運用于機體時是否會對其他系統產生影響。第二，未探究在病理條件下RNF11對BMSCs的成骨分化作用是否會受影響。第三，未探究RNF11在BMSCs成骨分化其他重要過程中的作用，如破骨細胞形成、炎癥等。以上不足有待進一步研究完善。
作者貢獻：鄧雯負責研究設計、數據收集整理、統計分析；龍婷負責論文撰寫；杜英負責對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究方案經鄭州大學生命科學倫理審查委員會批準。
