引用本文： 王勇, 白潔, 匡立潤, 劉金鋼. Roux-en-Y胃旁路術對GK大鼠骨骼肌組織胰島素抵抗影響的機制研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(2): 162-167. doi: 10.7507/1007-9424.20140037 復制
肥胖和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發病率逐年遞增，已成為現代公共衛生最大的威脅之一[1]。T2DM的主要病理、生理特征是胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗，后者是病態性肥胖患者T2DM以及其他很多并發病發生、發展過程中最為重要的促進因素[2]。胰島素抵抗的靶器官主要為肝臟、骨骼肌和脂肪。脂肪是近年來的研究熱點，但體質量指數（body mass index，BMI）較低的人也可存在胰島素抵抗，所以脂肪學說并不能完全解釋其機制。骨骼肌承擔機體大部分葡萄糖的代謝，其細胞表面存在大量的胰島素受體，而關于骨骼肌胰島素抵抗的研究甚少。大型回顧性研究[3]顯示，減重手術可降低98%的糖尿病患者的死亡率，其中胃旁路術是其最傳統最常用的減重術式。目前臨床及動物研究均證明，Roux-en-Y胃旁路術（Roux-en-Ygastric bypass，RYGB）后早期體質量未發生明顯改變時，研究對象的T2DM及胰島素抵抗即得到顯著改善[4-5]，多數觀點認為這可能與術后胃腸激素改變相關[6-7]，其中ghrelin作為一種可以調節攝食的腦腸肽，其術后改變及作用頗具爭議[8-9]。本研究擬通過檢測RYGB術后Goto-Kakizaki大鼠（GK大鼠，一種自發性T2DM在生長早期即發育為T2DM）血漿ghrelin及骨骼肌組織胰島素受體后信號通路關鍵因子的改變來探尋RYGB治療T2DM的可能機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
8周齡雄性GK大鼠30只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；同周齡雄性Wistar大鼠10只，購自中國醫科大學盛京醫院實驗動物中心。所有實驗動物適應性喂養7 d后開始實驗。飼養環境：單籠飼養，標準大鼠飼料喂養，自然晝夜循環，室溫（18±2）℃，濕度（50±2）%。GK大鼠30只空腹血糖均高于7.5 mmol/L，完全隨機平均分為3組：GK-RYGB組、GK-假手術組和GK-對照組；10只Wistar大鼠作為正常對照組。
1.2 手術干預
①GK-RYGB組：GK大鼠10只，行RYGB。10%水合氯醛（300 mg/kg）腹膜內注射麻醉，四肢固定于操作臺。腹部碘伏消毒，取上腹部正中切口約4 cm入腹，保留胃底約20%處將胃橫斷，遠端胃斷端連續內翻縫合。距Treize韌帶約10 cm處切斷空腸，遠端空腸袢經結腸前上提與殘胃吻合，近端空腸袢在距胃空腸吻合口約10 cm處和遠端空腸行端側吻合。吻合均用6-0無損傷線。②GK-假手術組：GK大鼠10只，麻醉方法及切口同GK-RYGB組。手術方式為胃前壁切開再縫合、空腸相應位置切斷后原位吻合，縫合方法同GK-RYGB組，手術未改變胃腸道正常解剖位置，控制手術時間與GK-RYGB組大致相等。③GK-對照組：GK大鼠10只，無特殊處理。④正常對照組：Wistar大鼠10只，無特殊處理。
1.3 圍手術期處理
術前12 h禁食，2 h禁水。關腹前青霉素（8×104 U/100 g體質量）腹腔內注射，術后48 h內進流食（10%葡萄糖），48 h后隨意進水及標準飼料。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 血漿ghrelin濃度測定
術后28 d時處死所有實驗動物，立即下腔靜脈采血，加入到已肝素化的離心管抗凝后于4℃3 000 r/min（r=15 cm）離心10 min，取血漿于-80℃冰箱凍存，采用ELISA法（R & D公司，美國）測定血漿ghrelin濃度。
1.4.2 Western blot法檢測骨骼肌組織中磷酸化（p）-PI3Kp85α、總（t）-PI3Kp85α、p-Akt/PKB、t-Akt/PKB、膜（m）-GLUT4及t-GLUT4蛋白表達
術后28 d時處死實驗動物后取雙側腓腸肌組織于-80℃冰箱凍存。取100 mg骨骼肌組織置于培養皿中，剪切成約1 mm×1 mm的碎片，采用RIPA裂解液（碧云天生物技術有限公司，中國）予以提取全蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。后經跨膜蛋白抽提試劑（Merck公司，美國）提取膜蛋白，10% SDS凝膠分離蛋白并轉膜至PVDF膜（碧云天生物技術有限公司，中國），10%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入1：200一抗稀釋液（Santa Cruz公司，美國）：羊抗兔p-PI3Kp85α抗體、羊抗兔PI3Kp85α抗體、兔抗羊p-Akt/PKB抗體、兔抗羊Akt/PKB抗體、兔抗羊m-GLUT4抗體、兔抗羊GLUT4抗體孵育過夜。再加入1：5 000二抗稀釋液（Santa Cruz公司，美國）：辣根酶標記的羊抗兔IgG抗體、兔抗羊IgG抗體孵育2 h，ECL顯色，用Quantity One軟件（FUJI film公司，美國）對條帶進行灰度分析，將磷酸化蛋白或膜蛋白條帶與同一指標的總蛋白條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。
1.4.3 實時定量PCR法測骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達
采用iQ5 Real-Time PCR分析系統（Bio-Rad公司，美國）檢測骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達。取總RNA反轉錄模板1μg用以逆轉錄合成cDNA，反應條件：37℃15 min，85℃5 s。PI3Kp85α上游引物為5′-AGATGCTTTCAAACGCTA-T-3′，下游引物為5′-TGGCTGTCGCTCACTC-3′，片段長度為361 bp；Akt/PKB上游引物為5′-TTTATT-GGCTACAAGGAACG-3′，下游引物為5′-GTCTGA-ATGGCGGTGGT-3′，片段長度為212 bp；GLUT4上游引物為5′-ACCCTCACTACCCTTTGG-3′，下游引物為5′-GAGGAACCGTCCGAGAA-3′，片段長度為207 bp；β-actin上游引物為5′-ACCAACTGGGAC-G-3′，下游引物為5' -AGGCATACAGGGAC-3′，片段長度為205 bp。擴增反應條件：預變性50℃2 min，95℃2 min，然后95℃15 s，55℃30 s，60℃30 s，40個循環。以β-actin基因mRNA表達為內參照，按公式△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。以實驗組目的基因表達相對于正常對照組及GK-對照組的變化倍數為結果。
1.5 統計學方法
使用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組血漿ghrelin濃度檢測結果
血漿ghrelin濃度在GK-對照組為（7.65±0.68）μg/L，GK-假手術組為（6.57±0.88）μg/L，GK-RYGB組為（17.61±1.45）μg/L，正常對照組為（16.55±0.68）μg/L。血漿ghrelin濃度在正常對照組明顯高于GK-對照組（P < 0.01）和GK-假手術組（P < 0.01）；GK-RYGB組也明顯高于GK-對照組（P < 0.01）及GK-假手術組（P < 0.01），但與正常對照組相比差異無統計學意義（P > 0.05）。
2.2 各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4的蛋白相對表達量
各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白表達的定性結果見圖 1A。
圖1
各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白表達結果。1A：定性結果；1B：p-/t-PI3Kp85α的定量結果；1C：p-/t-Akt/PKB的定量結果；1D：m-/t-GLUT4的定量結果。1：正常對照組；2：GK-對照組；3：GK-假手術組；4：GK-RYGB組。與GK-對照組、GK-假手術組比較，* P < 0.05，** P < 0.01
Figure1.
Expessions of p-/t-PI3Kp85α, p-/t-Akt/PKB, and m-/t-GLUT4 in skeletal muscle tissue of each group rats. 1A:Qualitative result; 1B:Quantitative result of p-/t-PI3Kp85α; 1C:Quantitative result of p-/t-Akt/PKB; 1D:Quantitative result of m-/t-GLUT4. 1:Normal control group; 2:GK-control group; 3:GK-SO group; 4:GK-RYGB group. Compared with GK-control group and GK-SO group, * P < 0.05, ** P < 0.01
2.2.1 各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-PI3Kp85α蛋白
相對表達量 正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的2.699倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.584倍（P < 0.01）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別是GK-對照組的2.500倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.393倍（P < 0.01）。見圖 1B。
2.2.2 各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-Akt/AKB蛋白相對表達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的1.683倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.606倍（P < 0.05）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別是GK-對照組的1.617倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.543倍（P < 0.05）。見圖 1C。
2.2.3 各組大鼠骨骼肌組織中m-/t-GLUT4蛋白相對表達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的2.983倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.739倍（P < 0.01）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別是GK-對照組的2.860倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.626倍（P < 0.01）。見圖 1D。
2.3 各組大鼠骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB、GLU-T4 mRNA的表達結果
2.3.1 各組大鼠骨骼肌組織中PI3Kp85αmRNA達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的2.618倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.494倍（P < 0.01）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別為GK-對照組的2.445倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.329倍（P < 0.01）。見圖 2A。
圖2
各組大鼠骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達結果。2A：PI3Kp85αmRNA；2B：Akt/PKB mRNA；2C：GLUT4 mRNA。1：正常對照組；2：GK-對照組；3：GK-假手術組；4：GK-RYGB組。與GK-對照組、GK-假手術組比較，* P < 0.05，** P < 0.01
Figure2.
mRNA expessions of PI3Kp85α, Akt/PKB, and GLUT4 in skeletal muscle tissues of each group rats. 2A:PI3Kp85αmRNA; 2B:Akt/PKB mRNA; 2C:GLUT4 mRNA. 1:Normal control group; 2:GK-control group; 3:GK-SO group; 4:GK-RYGB group. Compared with GK-control group and GK-SO group, * P < 0.05, ** P < 0.01
2.3.2 各組大鼠骨骼肌組織中Akt/PKB mRNA表達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的1.727倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.689倍（P < 0.05）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組亦明顯上升，分別為GK-對照組的1.601倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.566倍（P < 0.05）。見圖 2B。
2.3.3 各組大鼠骨骼肌組織中GLUT4 mRNA表達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的1.567倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.545倍（P < 0.05）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別是GK-對照組的1.436倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.416倍（P < 0.05）。見圖 2C。
3 討論
臨床研究[10]證明，RYGB術后3 d血糖和胰島素水平顯著下降，同時胰島素抵抗得到改善，多數患者無需再服用抗糖尿病藥物血糖即可維持于正常水平，而此時體重并未發生明顯下降[4, 11]，說明在此階段體重下降并不是胰島素抵抗改善的主要原因。
飲食攝入的葡萄糖主要由骨骼肌代謝，所以骨骼肌胰島素抵抗對于整個機體胰島素抵抗的發生、發展必然具有十分重要的作用。目前普遍認為，RYGB術后早期胰島素抵抗得到改善與胃腸道激素的改變關系密切[12-13]，其中之一ghrelin主要由胃分泌，在小腸、下丘腦、胰島細胞等多種組織中均有表達。最初對ghrelin的研究[14]認為，它能夠增加食物攝入并導致肥胖，但是在轉基因[15]和敲除模型[16]中ghrelin關于攝食和體質量的數據卻相反，這使得內源性ghrelin的作用還難以界定。最近的研究[17-18]證明，ghrelin有廣泛的生理作用，對腫瘤、炎癥等病理過程的發生、發展產生積極影響。在炎癥早期，ghrelin濃度呈反應性升高[19]，并且ghrelin能夠抑制炎癥反應[20]及致炎因子的釋放[21]。研究[22]證明，機體ghrelin濃度在胰島素抵抗狀態下顯著降低。本研究中同樣發現患T2DM大鼠的血漿ghrelin濃度較低，在RYGB術后血漿ghrelin濃度顯著升高甚至基本達到正常水平，這和我們前期實驗所觀察到的術后血糖等T2DM相關指標、胰島素抵抗的改善呈同一趨勢。因此，我們認為ghrelin的抗炎癥作用可能對術后胰島素抵抗的改善起至關重要的作用。
PI3K-Akt/PKB通路是胰島素抵抗時主要受影響的信號通路[23]。PI3K由調節亞基p85和催化亞基p110組成，一般檢測磷酸化的p85α來反映其活性程度，Akt/PKB在PI3K的刺激下發生磷酸化，隨后具有活性的p-Akt/PKB釋放入細胞漿，在細胞內引起一系列級聯反應最終將信號傳導給葡萄糖轉運的靶分子GLUT4 [24]，PI3K和Akt/PKB缺失均可導致不同程度的胰島素抵抗，所以胰島素抵抗也可以視為胰島素信號通路傳導障礙。GLUT4是骨骼肌主要的葡萄糖轉運蛋白，無刺激時主要位于細胞內的儲存囊泡內，當GLUT4接收到上述通路傳導的信號刺激后轉位至細胞膜，與葡萄糖結合，將葡萄糖轉運至細胞內，胰島素抵抗時GLUT4在骨骼肌細胞的轉位減少、活性降低[25]。本研究結果發現，GK-假手術組及GK-對照組T2DM大鼠骨骼肌組織的p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白相對表達量及以上3個指標的mRNA的表達均顯著低于正常大鼠及接受胃轉流手術后大鼠，驗證了T2DM所引起的胰島素抵抗確實降低PI3K-Akt/PKB通路信號和GLUT4的活性以及減少GLUT4向細胞膜的轉位，從而減少骨骼肌對葡萄糖的代謝；RYGB術后p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白及PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達較GK-對照組及GK-假手術組均顯著上升，說明RYGB通過增加以上分子的轉錄和表達改善了胰島素信號通路及GLUT4的轉位和活性，這可能是RYGB改善骨骼肌胰島素抵抗的主要機制之一。
綜上所述，本研究結果初步認為，RYGB對T2DM是一種有效的治療方式，能夠改善機體的胰島素抵抗狀態，其具體機制可能是手術通過提升血漿ghrelin濃度抑制了機體的炎癥反應，從而上調了主要靶器官骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB和GLUT4的轉錄和表達，并增加GLUT4向細胞膜轉位及其總活性，最終引起骨骼肌組織攝取葡萄糖增加，機體血糖恢復正常，但該機制仍需要后續的細胞學實驗來進一步驗證。
肥胖和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發病率逐年遞增，已成為現代公共衛生最大的威脅之一[1]。T2DM的主要病理、生理特征是胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗，后者是病態性肥胖患者T2DM以及其他很多并發病發生、發展過程中最為重要的促進因素[2]。胰島素抵抗的靶器官主要為肝臟、骨骼肌和脂肪。脂肪是近年來的研究熱點，但體質量指數（body mass index，BMI）較低的人也可存在胰島素抵抗，所以脂肪學說并不能完全解釋其機制。骨骼肌承擔機體大部分葡萄糖的代謝，其細胞表面存在大量的胰島素受體，而關于骨骼肌胰島素抵抗的研究甚少。大型回顧性研究[3]顯示，減重手術可降低98%的糖尿病患者的死亡率，其中胃旁路術是其最傳統最常用的減重術式。目前臨床及動物研究均證明，Roux-en-Y胃旁路術（Roux-en-Ygastric bypass，RYGB）后早期體質量未發生明顯改變時，研究對象的T2DM及胰島素抵抗即得到顯著改善[4-5]，多數觀點認為這可能與術后胃腸激素改變相關[6-7]，其中ghrelin作為一種可以調節攝食的腦腸肽，其術后改變及作用頗具爭議[8-9]。本研究擬通過檢測RYGB術后Goto-Kakizaki大鼠（GK大鼠，一種自發性T2DM在生長早期即發育為T2DM）血漿ghrelin及骨骼肌組織胰島素受體后信號通路關鍵因子的改變來探尋RYGB治療T2DM的可能機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
8周齡雄性GK大鼠30只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；同周齡雄性Wistar大鼠10只，購自中國醫科大學盛京醫院實驗動物中心。所有實驗動物適應性喂養7 d后開始實驗。飼養環境：單籠飼養，標準大鼠飼料喂養，自然晝夜循環，室溫（18±2）℃，濕度（50±2）%。GK大鼠30只空腹血糖均高于7.5 mmol/L，完全隨機平均分為3組：GK-RYGB組、GK-假手術組和GK-對照組；10只Wistar大鼠作為正常對照組。
1.2 手術干預
①GK-RYGB組：GK大鼠10只，行RYGB。10%水合氯醛（300 mg/kg）腹膜內注射麻醉，四肢固定于操作臺。腹部碘伏消毒，取上腹部正中切口約4 cm入腹，保留胃底約20%處將胃橫斷，遠端胃斷端連續內翻縫合。距Treize韌帶約10 cm處切斷空腸，遠端空腸袢經結腸前上提與殘胃吻合，近端空腸袢在距胃空腸吻合口約10 cm處和遠端空腸行端側吻合。吻合均用6-0無損傷線。②GK-假手術組：GK大鼠10只，麻醉方法及切口同GK-RYGB組。手術方式為胃前壁切開再縫合、空腸相應位置切斷后原位吻合，縫合方法同GK-RYGB組，手術未改變胃腸道正常解剖位置，控制手術時間與GK-RYGB組大致相等。③GK-對照組：GK大鼠10只，無特殊處理。④正常對照組：Wistar大鼠10只，無特殊處理。
1.3 圍手術期處理
術前12 h禁食，2 h禁水。關腹前青霉素（8×104 U/100 g體質量）腹腔內注射，術后48 h內進流食（10%葡萄糖），48 h后隨意進水及標準飼料。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 血漿ghrelin濃度測定
術后28 d時處死所有實驗動物，立即下腔靜脈采血，加入到已肝素化的離心管抗凝后于4℃3 000 r/min（r=15 cm）離心10 min，取血漿于-80℃冰箱凍存，采用ELISA法（R & D公司，美國）測定血漿ghrelin濃度。
1.4.2 Western blot法檢測骨骼肌組織中磷酸化（p）-PI3Kp85α、總（t）-PI3Kp85α、p-Akt/PKB、t-Akt/PKB、膜（m）-GLUT4及t-GLUT4蛋白表達
術后28 d時處死實驗動物后取雙側腓腸肌組織于-80℃冰箱凍存。取100 mg骨骼肌組織置于培養皿中，剪切成約1 mm×1 mm的碎片，采用RIPA裂解液（碧云天生物技術有限公司，中國）予以提取全蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。后經跨膜蛋白抽提試劑（Merck公司，美國）提取膜蛋白，10% SDS凝膠分離蛋白并轉膜至PVDF膜（碧云天生物技術有限公司，中國），10%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入1：200一抗稀釋液（Santa Cruz公司，美國）：羊抗兔p-PI3Kp85α抗體、羊抗兔PI3Kp85α抗體、兔抗羊p-Akt/PKB抗體、兔抗羊Akt/PKB抗體、兔抗羊m-GLUT4抗體、兔抗羊GLUT4抗體孵育過夜。再加入1：5 000二抗稀釋液（Santa Cruz公司，美國）：辣根酶標記的羊抗兔IgG抗體、兔抗羊IgG抗體孵育2 h，ECL顯色，用Quantity One軟件（FUJI film公司，美國）對條帶進行灰度分析，將磷酸化蛋白或膜蛋白條帶與同一指標的總蛋白條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。
1.4.3 實時定量PCR法測骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達
采用iQ5 Real-Time PCR分析系統（Bio-Rad公司，美國）檢測骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達。取總RNA反轉錄模板1μg用以逆轉錄合成cDNA，反應條件：37℃15 min，85℃5 s。PI3Kp85α上游引物為5′-AGATGCTTTCAAACGCTA-T-3′，下游引物為5′-TGGCTGTCGCTCACTC-3′，片段長度為361 bp；Akt/PKB上游引物為5′-TTTATT-GGCTACAAGGAACG-3′，下游引物為5′-GTCTGA-ATGGCGGTGGT-3′，片段長度為212 bp；GLUT4上游引物為5′-ACCCTCACTACCCTTTGG-3′，下游引物為5′-GAGGAACCGTCCGAGAA-3′，片段長度為207 bp；β-actin上游引物為5′-ACCAACTGGGAC-G-3′，下游引物為5' -AGGCATACAGGGAC-3′，片段長度為205 bp。擴增反應條件：預變性50℃2 min，95℃2 min，然后95℃15 s，55℃30 s，60℃30 s，40個循環。以β-actin基因mRNA表達為內參照，按公式△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。以實驗組目的基因表達相對于正常對照組及GK-對照組的變化倍數為結果。
1.5 統計學方法
使用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組血漿ghrelin濃度檢測結果
血漿ghrelin濃度在GK-對照組為（7.65±0.68）μg/L，GK-假手術組為（6.57±0.88）μg/L，GK-RYGB組為（17.61±1.45）μg/L，正常對照組為（16.55±0.68）μg/L。血漿ghrelin濃度在正常對照組明顯高于GK-對照組（P < 0.01）和GK-假手術組（P < 0.01）；GK-RYGB組也明顯高于GK-對照組（P < 0.01）及GK-假手術組（P < 0.01），但與正常對照組相比差異無統計學意義（P > 0.05）。
2.2 各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4的蛋白相對表達量
各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白表達的定性結果見圖 1A。
圖1
各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白表達結果。1A：定性結果；1B：p-/t-PI3Kp85α的定量結果；1C：p-/t-Akt/PKB的定量結果；1D：m-/t-GLUT4的定量結果。1：正常對照組；2：GK-對照組；3：GK-假手術組；4：GK-RYGB組。與GK-對照組、GK-假手術組比較，* P < 0.05，** P < 0.01
Figure1.
Expessions of p-/t-PI3Kp85α, p-/t-Akt/PKB, and m-/t-GLUT4 in skeletal muscle tissue of each group rats. 1A:Qualitative result; 1B:Quantitative result of p-/t-PI3Kp85α; 1C:Quantitative result of p-/t-Akt/PKB; 1D:Quantitative result of m-/t-GLUT4. 1:Normal control group; 2:GK-control group; 3:GK-SO group; 4:GK-RYGB group. Compared with GK-control group and GK-SO group, * P < 0.05, ** P < 0.01
2.2.1 各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-PI3Kp85α蛋白
相對表達量 正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的2.699倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.584倍（P < 0.01）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別是GK-對照組的2.500倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.393倍（P < 0.01）。見圖 1B。
2.2.2 各組大鼠骨骼肌組織中p-/t-Akt/AKB蛋白相對表達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的1.683倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.606倍（P < 0.05）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別是GK-對照組的1.617倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.543倍（P < 0.05）。見圖 1C。
2.2.3 各組大鼠骨骼肌組織中m-/t-GLUT4蛋白相對表達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的2.983倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.739倍（P < 0.01）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別是GK-對照組的2.860倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.626倍（P < 0.01）。見圖 1D。
2.3 各組大鼠骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB、GLU-T4 mRNA的表達結果
2.3.1 各組大鼠骨骼肌組織中PI3Kp85αmRNA達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的2.618倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.494倍（P < 0.01）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別為GK-對照組的2.445倍（P < 0.01）、GK-假手術組的2.329倍（P < 0.01）。見圖 2A。
圖2
各組大鼠骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達結果。2A：PI3Kp85αmRNA；2B：Akt/PKB mRNA；2C：GLUT4 mRNA。1：正常對照組；2：GK-對照組；3：GK-假手術組；4：GK-RYGB組。與GK-對照組、GK-假手術組比較，* P < 0.05，** P < 0.01
Figure2.
mRNA expessions of PI3Kp85α, Akt/PKB, and GLUT4 in skeletal muscle tissues of each group rats. 2A:PI3Kp85αmRNA; 2B:Akt/PKB mRNA; 2C:GLUT4 mRNA. 1:Normal control group; 2:GK-control group; 3:GK-SO group; 4:GK-RYGB group. Compared with GK-control group and GK-SO group, * P < 0.05, ** P < 0.01
2.3.2 各組大鼠骨骼肌組織中Akt/PKB mRNA表達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的1.727倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.689倍（P < 0.05）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組亦明顯上升，分別為GK-對照組的1.601倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.566倍（P < 0.05）。見圖 2B。
2.3.3 各組大鼠骨骼肌組織中GLUT4 mRNA表達量
正常對照組較GK-對照組和GK-假手術組明顯上升，分別是GK-對照組的1.567倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.545倍（P < 0.05）；GK-RYGB組較GK-對照組和GK-假手術組也明顯上升，分別是GK-對照組的1.436倍（P < 0.05）、GK-假手術組的1.416倍（P < 0.05）。見圖 2C。
3 討論
臨床研究[10]證明，RYGB術后3 d血糖和胰島素水平顯著下降，同時胰島素抵抗得到改善，多數患者無需再服用抗糖尿病藥物血糖即可維持于正常水平，而此時體重并未發生明顯下降[4, 11]，說明在此階段體重下降并不是胰島素抵抗改善的主要原因。
飲食攝入的葡萄糖主要由骨骼肌代謝，所以骨骼肌胰島素抵抗對于整個機體胰島素抵抗的發生、發展必然具有十分重要的作用。目前普遍認為，RYGB術后早期胰島素抵抗得到改善與胃腸道激素的改變關系密切[12-13]，其中之一ghrelin主要由胃分泌，在小腸、下丘腦、胰島細胞等多種組織中均有表達。最初對ghrelin的研究[14]認為，它能夠增加食物攝入并導致肥胖，但是在轉基因[15]和敲除模型[16]中ghrelin關于攝食和體質量的數據卻相反，這使得內源性ghrelin的作用還難以界定。最近的研究[17-18]證明，ghrelin有廣泛的生理作用，對腫瘤、炎癥等病理過程的發生、發展產生積極影響。在炎癥早期，ghrelin濃度呈反應性升高[19]，并且ghrelin能夠抑制炎癥反應[20]及致炎因子的釋放[21]。研究[22]證明，機體ghrelin濃度在胰島素抵抗狀態下顯著降低。本研究中同樣發現患T2DM大鼠的血漿ghrelin濃度較低，在RYGB術后血漿ghrelin濃度顯著升高甚至基本達到正常水平，這和我們前期實驗所觀察到的術后血糖等T2DM相關指標、胰島素抵抗的改善呈同一趨勢。因此，我們認為ghrelin的抗炎癥作用可能對術后胰島素抵抗的改善起至關重要的作用。
PI3K-Akt/PKB通路是胰島素抵抗時主要受影響的信號通路[23]。PI3K由調節亞基p85和催化亞基p110組成，一般檢測磷酸化的p85α來反映其活性程度，Akt/PKB在PI3K的刺激下發生磷酸化，隨后具有活性的p-Akt/PKB釋放入細胞漿，在細胞內引起一系列級聯反應最終將信號傳導給葡萄糖轉運的靶分子GLUT4 [24]，PI3K和Akt/PKB缺失均可導致不同程度的胰島素抵抗，所以胰島素抵抗也可以視為胰島素信號通路傳導障礙。GLUT4是骨骼肌主要的葡萄糖轉運蛋白，無刺激時主要位于細胞內的儲存囊泡內，當GLUT4接收到上述通路傳導的信號刺激后轉位至細胞膜，與葡萄糖結合，將葡萄糖轉運至細胞內，胰島素抵抗時GLUT4在骨骼肌細胞的轉位減少、活性降低[25]。本研究結果發現，GK-假手術組及GK-對照組T2DM大鼠骨骼肌組織的p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白相對表達量及以上3個指標的mRNA的表達均顯著低于正常大鼠及接受胃轉流手術后大鼠，驗證了T2DM所引起的胰島素抵抗確實降低PI3K-Akt/PKB通路信號和GLUT4的活性以及減少GLUT4向細胞膜的轉位，從而減少骨骼肌對葡萄糖的代謝；RYGB術后p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白及PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表達較GK-對照組及GK-假手術組均顯著上升，說明RYGB通過增加以上分子的轉錄和表達改善了胰島素信號通路及GLUT4的轉位和活性，這可能是RYGB改善骨骼肌胰島素抵抗的主要機制之一。
綜上所述，本研究結果初步認為，RYGB對T2DM是一種有效的治療方式，能夠改善機體的胰島素抵抗狀態，其具體機制可能是手術通過提升血漿ghrelin濃度抑制了機體的炎癥反應，從而上調了主要靶器官骨骼肌組織中PI3Kp85α、Akt/PKB和GLUT4的轉錄和表達，并增加GLUT4向細胞膜轉位及其總活性，最終引起骨骼肌組織攝取葡萄糖增加，機體血糖恢復正常，但該機制仍需要后續的細胞學實驗來進一步驗證。
