本研究旨在探索 miR-130a-3p 對心肌細胞肥大的作用及其可能機制。通過胸主動脈縮窄法（TAC）構建壓力超負荷所致心肌肥厚小鼠模型。使用去甲腎上腺素（NE）刺激 SD 乳鼠原代心肌細胞（NRCMs）及 H9c2 大鼠心肌細胞系，誘導這兩種心肌細胞發生肥大表型轉變。檢測 miR-130a-3p 的表達變化，并進一步探索其對心肌細胞肥大是否有調控作用。結果表明，miR-130a-3p 在肥厚心肌組織、肥大 NRCMs 及 H9c2 細胞中的表達均明顯降低。給予 miR-130a-3p mimics 使其過表達后，H9c2 細胞中肥大標志基因心房利鈉肽（ANP）、腦利鈉肽（BNP）和肌球蛋白重鏈 β（β-MHC）的表達較對照組（mimics N.C.+NE 組）明顯下調，且細胞面積明顯減小。而給予 miR-130a-3p inhibitor 抑制其表達后，肥大心肌細胞中 ANP、BNP、β-MHC 的表達進一步上升，且細胞面積進一步增加。Western blot 檢測發現，過表達 miR-130a-3p 后心肌細胞中磷酸化 Akt 和磷酸化 mTOR 的表達水平下調。以上結果提示，miR-130a-3p mimics 可緩解心肌細胞肥大的程度；其 inhibitor 則可使心肌細胞肥大進一步加劇。過表達 miR-130a-3p 可能通過影響 Akt 通路來緩解 H9c2 心肌細胞肥大的程度。
引用本文： 王曉姣, 曲徑, 李東旭, 李君麗, 吳文超, 劉小菁. 過表達 miR-130a-3p 對心肌細胞肥大的緩解作用研究. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(2): 340-348. doi: 10.7507/1001-5515.201911049 復制
引言
在受到神經體液因子刺激、壓力超負荷損傷及其他肥厚性刺激后，心臟將會發生形態、大小、結構和功能的一系列改變，被稱為心肌重構（myocardial remodeling）[1]。其主要病理改變包括心肌細胞肥大、心肌纖維化等。此時，心肌細胞中的一些胚胎時期基因，如心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）和肌球蛋白重鏈 β（β-myosin heavy chain，β-MHC）等會出現再表達[2-3]，且心肌細胞體積增大，蛋白質合成增多。
研究證實，參與心肌細胞肥大的信號通路包括細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt）、內質網應激、線粒體動力學改變以及活性氧刺激等[3]。壓力超負荷等肥厚性刺激常導致氧化應激增加并誘發內質網應激，而 PI3K/Akt 通路則可直接調控心肌細胞肥大進程[4-5]。但目前，心肌細胞肥大的調控機制仍未完全闡明。
微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類長 19～25 個堿基的非編碼 RNA 分子，其主要作用是通過與靶 mRNA 的 3'端 UTR 區結合后參與 mRNA 沉默以及基因表達的轉錄后調節。研究顯示，miRNA 參與了多種心血管疾病的發生發展過程[6]。其中，miR-130a-3p 可逆轉由 PDE4D 誘導的心肌梗死過程[7]。冠心病患者血漿中 miR-130a-3p 的水平與冠狀動脈粥樣硬化程度呈負相關[8]。然而，miR-130a-3p 在心肌肥厚中的作用如何，目前尚未見報道。因此，本文旨在探索 miR-130a-3p 對心肌細胞肥大的作用及其可能的機制。
1 材料與試劑
1.1 主要試劑
杜氏培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）高糖培養基、Ⅱ型膠原酶購自美國 Gibco 公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自以色列 BI 公司，熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）引物購自中國擎科梓熙生物技術有限公司，Lipofectamine 3000 購自美國 Invitrogen 公司，RNA 提取試劑盒購自中國北京天漠科技開發有限公司，逆轉錄試劑盒（Rever Tra Ace 組合型）購自日本 Toyobo 公司，miRNA 逆轉錄及定量試劑盒、miRNA 引物及內參、miR-130a-3p mimics/inhibitor、N.C. mimics/inhibitor 購自中國廣州復能基因有限公司，RT-qPCR 試劑盒 SYBR Green PCR Master Mix、增強化學發光試劑購自美國 Bio-Rad 公司，兔抗 α-actinin 購自中國杭州華安生物技術有限公司，兔抗 p-Akt、Akt 購自美國 Proteintech 公司，兔抗 p-mTOR、mTOR 購自美國 Abcam 公司，小鼠抗 GAPDH 抗體購自美國 Santa-Cruz 公司，山羊抗小鼠、兔 IgG 購自中國北京中杉金橋生物技術有限公司，PVDF 膜購自瑞士 Roche 公司，去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）購自加拿大 Sigma 公司。
1.2 實驗動物
本實驗所用動物為健康 0～3 d 齡的 Sprague Dawley（SD）乳鼠（SCXK（川）2015-303），購自四川省達碩實驗動物中心，C57BL/6 小鼠（SCXK（京）2016-0006）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。本實驗經四川大學華西醫院動物倫理委員會批準通過（倫理備案號：2018162A）。
2 實驗方法
2.1 壓力超負荷所致小鼠心肌肥厚模型建立
實驗分組：將 7～9 周齡、22～24 g 雄性 C57BL/6 小鼠隨機分為：① 假手術組（Sham 組，n = 10）；② 胸主動脈縮窄手術組（TAC 組，n = 10）。按參考文獻方法[9]，異氟烷誘導麻醉后氣管插管，TAC 組于第 2-3 肋間分離暴露主動脈弓，結扎第二分支處；Sham 組同期開胸但不進行主動脈弓結扎。手術 4 周后 RT-qPCR 檢測心肌肥大標志物 ANP、BNP 及 β-MHC 的表達，行組織學蘇木精?伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察心肌細胞肥大程度。
2.2 新生大鼠原代心肌細胞分離培養及肥大模型建立
按照本實驗室以前報道[9]的方法分離新生大鼠原代心肌細胞（neonatal rat cardiomyocytes，NRCMs）：將 0～3 d 齡的 SD 乳鼠消毒處死后，取左心室剪碎，0.05% 胰蛋白酶+0.05% Ⅱ型膠原酶 37℃ 消化三次，每次約 5 min，含加 10% FBS 的培養基終止消化。200 目篩網過濾后，300 g/min 離心 5 min，棄上清，加入含 10% FBS 的 DMEM 高糖培養基重懸細胞，置于 37℃、5% CO2 孵箱中培養。差速貼壁 1 h 后將上清移入 12/24 孔板中，24 h 換液后加入 50 μmol/L 溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU）繼續培養。用 α-actinin 抗體鑒定 NRCMs 的純度。48 h 后，采用 1 × 10?5 mol/L 的 NE 處理 NRCMs 24 h 誘導其發生肥大表型。實驗分組：① 對照組（n = 6）；② NE 組（1 × 10?5 mol/L，n = 6）。
2.3 H9c2 心肌細胞系培養及肥大模型建立
H9c2 胚胎期大鼠心肌細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，由本實驗室保存。使用含 10% FBS、1% 青霉素-鏈霉素和 4 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM 高糖培養基，常規傳代培養。采用 1 × 10?5 mol/L 的 NE 處理 NRCMs 24 h 誘導其發生肥大表型。實驗分組（n = 6）：① 未加刺激的對照組；② NE 組（1 × 10?5 mol/L）。
2.4 轉染及實驗分組
轉染方法：轉染前一天，將 H9c2 細胞接種至含有 1 mL 完全培養基的 12 孔板中，保證轉染時密度達 50%。按照說明書使用 Lipofectamine 3000 轉染 miR-130a-3p mimics/inhibitor、N.C. mimics/inhibitor 24 h 后，再根據需要加入或不加 1 × 10?5 mol/L NE 刺激 24 h 誘導其發生肥大。根據使用說明書采用 miRNA mimic 工作濃度為 50 nmol/L，miRNA inhibitor 工作濃度為 100 nmol/L（根據說明書，miRNA inhibitor 往往需要較大的用量才能觀察到較好的抑制效果，可能與其競爭性抑制的作用機制及作用效率有關）。
實驗分組（n = 4）：① mimics N.C.；② mimics N.C.+NE；③ miR-130a-3p mimics；④ miR-130a-3p mimics+NE；⑤ inhibitor N.C.；⑥ inhibitor N.C.+NE；⑦ miR-130a-3p inhibitor；⑧ mimics miR-130a-3p+NE。
2.5 RT-qPCR 檢測基因及 miRNA 表達變化
mRNA 定量檢測：使用 RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA，將 1.5 μg 總 RNA 逆轉錄后采用 SYBR Green PCR Master Mix 在 qPCR 儀（CFX96TM，Bio-Rad）上對 ANP、BNP、β-MHC 等 mRNA 變化進行熒光定量檢測。引物序列見表 1 所示，β-actin 作為內參對目的基因的表達進行校正。
表1
定量 RT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequences for quantitative PCR
miRNA 定量檢測：使用 RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA，將 1.5 μg 總 RNA 采用多聚腺苷酸加尾法逆轉錄，使用成熟體 miRNA 定量檢測體系對 miR-130a-3p 進行熒光定量檢測。U6 作為內參對目的 miRNA 表達進行校正。
2.6 Western blot 檢測
RIPA 裂解組織或細胞獲取總蛋白，用 BCA 法測定蛋白濃度后，取 25 μg 總蛋白上樣，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，將蛋白轉至 PVDF 膜，封閉后 4℃ 孵育一抗（1∶1 000）過夜，TBST 洗滌后用相應二抗（1∶3 000）室溫孵育 2 h，電化學發光試劑（electrochemiluminescence，ECL）顯影。GAPDH 作為內參，采用 Image J 軟件對條帶進行灰度分析。
2.7 細胞面積測定
按照本實驗室以前報道[9]的方法，接種細胞爬片于 24 孔板中，轉染/刺激后用 4% 多聚甲醛固定，室溫使用 0.5% triton + 1% BSA（PBS 緩沖液配制）封閉 1 h；一抗（1∶400，PBS 配制）于 4℃ 孵育過夜；預冷 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min；室溫使用二抗（1∶1 000，PBS 配制）避光孵育 1 h，預冷 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min；DAPI 復染細胞核 5 min 后封片。熒光顯微鏡下觀察并采圖，Image J 軟件分析細胞面積改變情況。
2.8 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計分析軟件處理實驗數據，Graphpad prism 6 繪制圖片，實驗結果以均數 ± 標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
3 結果
3.1 TAC 法誘導心肌肥厚小鼠模型的建立及鑒定
通過 HE 染色（見圖 1a），可觀察到 TAC 組小鼠心肌細胞橫截面積較 sham 組顯著增大。RT-qPCR 顯示（見圖 1b），TAC 組小鼠心臟組織中肥厚標志基因 ANP、BNP、β-MHC 的 mRNA 水平較 Sham 組明顯上升，差異具有統計學意義。
圖1
TAC 法誘導小鼠心肌肥厚模型的鑒定
a. 小鼠心肌組織 HE 染色；b. 小鼠心肌組織肥大基因表達水平（**
a. HE staining of mice myocardial tissue; b. hypertrophic gene expression of mice cardiac tissue (**
3.2 NE 誘導 NRCMs 和 H9c2 細胞發生肥大表型
3.2.1 NRCMs 肥大模型建立和鑒定
通過心肌細胞特異性蛋白 α-actinin 免疫熒光染色（見圖 2a、b），可見 NRCMs 受到 NE 刺激后，面積較對照組明顯增大，差異具有統計學意義。RT-qPCR 結果（見圖 2c）顯示，NE 刺激組 ANP、BNP、β-MHC 的 mRNA 水平較對照組明顯上升，差異具有統計學意義。
圖2
NRCMs 和 H9c2 細胞 1 × 10?5 mol/L NE 刺激后發生肥大表型改變
a，b. NRCMs α-actinin 染色；c. NRCMs 肥大基因表達水平；d，e. H9c2 細胞 F-actin 染色；f. H9c2 細胞系肥大基因表達水平（*
a, b. α-actinin staining of primary cultured NRCMs; c. hypertrophic gene expression in NRCMs; d, e. F-actin staining of H9c2 cells; f. hypertrophic gene expression in H9c2 cells (*
3.2.2 H9c2 細胞肥大模型建立及鑒定
通過 F-actin 免疫熒光染色（見圖 2d、e），可觀察到 NE 刺激后，H9c2 細胞面積較對照組明顯增大，差異具有統計學意義。RT-qPCR 結果（見圖 2f）顯示，H9c2 細胞 NE 刺激組 ANP、BNP、β-MHC 的 mRNA 水平較對照組明顯上升，差異具有統計學意義。
3.3 miR-130a-3p 在肥厚心肌組織、肥大 NRCMs 及肥大 H9c2 細胞中的表達變化
以 U6 為內參，RT-qPCR 結果顯示（見圖 3），心肌組織中，TAC 組小鼠 miR-130a-3p 與 Sham 組相比顯著下降；NRCMs 中 NE 刺激組 miR-130a-3p 與對照組相比顯著下降；H9c2 細胞中 NE 刺激組 miR-130a-3p 與對照組相比顯著下降，差異具有統計學意義。
圖3
miR-130a-3p 在肥厚心肌組織、肥大 NRCMs 和肥大 H9c2 細胞中的表達變化（* P < 0.05，**P < 0.01）
Figure3.
Expression of miR-130a-3p in mice hypertrophic myocardium，hypertrophic NRCMs and hypertrophic H9c2 cells (* P < 0.05, **P < 0.01)
3.4 過表達 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
3.4.1 特異性 miR-130a-3p mimics 可使 miR-130a-3p 過表達
為了探索 miR-130a-3p 能否調節心肌細胞肥大的程度，在培養的 H9c2 細胞內轉染特異性 miR-130a-3p mimics 以過表達 miR-130a-3p，通過 RT-qPCR 檢測其表達水平。觀察到轉染 48 h 后，miR-130a-3p mimics 組 miR-130a-3p 的表達較 mimics N.C.組顯著上升（見圖 4a）。
圖4
過表達 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
a. 轉染 miR-130a-3p mimics 后 miR-130a-3p 的表達改變；b，c，d. 過表達 miR-130a-3p 后肥大基因表達水平；e，f. 過表達 miR-130a-3p 后 H9c2 細胞面積的變化（*
a. expression of miR-130a-3p after transfection of miR-130a-3p mimics; b, c, d. hypertrophic gene expression in H9c2 cells after over expression of miR-130a-3p; e, f. cell surface area change after overexpression of miR-130a-3p (*
3.4.2 過表達 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
過表達 miR-130a-3p 24h 后，給予 H9c2 細胞 NE 刺激 24 h，觀察到 miR-130a-3p mimics+NE 組 ANP、BNP 和 β-MHC 水平較 mimics N.C.+NE 組顯著下降（見圖 4b、c、d），且 miR-130a-3p mimics + NE 組細胞面積較 mimics N.C.+NE 組也顯著減小（見圖 4e、f）。
以上結果提示過表達 miR-130a-3p 對 NE 誘導的 H9c2 細胞肥大過程有明顯的緩解作用。
3.5 抑制 miR-130a-3p 的表達對 H9c2 細胞肥大表型的影響
3.5.1 特異性 miR-130a-3p inhibitor 可抑制 miR-130a-3p 的表達
在培養的 H9c2 細胞內轉染特異性 miR-130a-3p inhibitor，以抑制 miR-130a-3p 的表達，通過 RT-qPCR 檢測其表達水平。觀察到轉染 48 h 后，miR-130a-3p inhibitor 組 miR-130a-3p 的表達較 inhibitor N.C.組下降約 98%（見圖 5a）。
圖5
抑制 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
a. 轉染 miR-130a-3p inhibitor 可降低 miR-130a-3p 的表達水平；b，c，d. 抑制 miR-130a-3p 表達后肥大基因表達水平改變；e，f. 抑制 miR-130a-3p 表達后相對細胞面積的變化（*
a. expression of miR-130a-3p after transfection of miR-130a-3p inhibitor; b, c, d. hypertrophic gene expression in H9c2 cells after inhibition of miR-130a-3p; e, f. cell surface area change after inhibition of miR-130a-3p (*
3.5.2 抑制 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
miR-130a-3p 表達 24 h 后，給予 H9c2 細胞 NE 刺激，觀察到 miR-130a-3p inhibitor+NE 組 ANP、BNP 和 β-MHC 水平較 inhibitor N.C.+NE 組顯著升高（見圖 5b、c、d）。同時，H9c2 細胞面積在 miR-130a-3p inhibitor+NE 組較 inhibitor N.C.+NE 組也顯著上升（見圖 5e、f）。
以上結果提示敲低 miR-130a-3p 表達可進一步加重 NE 誘導的 H9c2 細胞肥大程度。
3.6 miR-130a-3p 調控 H9C2 心肌細胞肥大的機制探究
研究報道，miR-130a-3p 對 Akt 信號通路的活化有影響[10]，而 Akt 通路在心肌細胞肥大過程中起重要作用[11]。因此，我們觀察了 miR-130a-3p 對 Akt 通路信號分子，包括 p-mTOR、mTOR 和 p-Akt、Akt 蛋白表達的情況。
Western blot 結果發現，相對于 mimics N.C.組，在 mimics N.C.+NE 組中，H9c2 細胞中 Akt 蛋白表達顯著升高，而 miR-130a-3p mimics+NE 組較 mimics N.C.+NE 組的蛋白表達水平有明顯下調（見圖 6）。提示過表達 miR-130a-3p 可影響 Akt 信號通路中關鍵蛋白 Akt 的表達。
圖6
上調 miR-130a-3p 對 Akt 通路蛋白的影響（*P < 0.05）
Figure6.
Effect of up-regulation of miR-130a-3p on Akt pathway proteins in H9c2 cells (*P < 0.05)
4 討論
近年來研究發現，miRNA 在心肌肥厚的發生發展中起重要作用[12]。文獻報道，miR-1 可通過靶向 Calcineurin[13]和 MCU[14]影響 Calcium 通路，以及靶向 CDK6-Rb[15]和 IGF-1[16]影響轉錄而緩解心肌肥厚；而 miR-217 則可通過靶向 PTEN[17]和 H3K9me2/EHMT1&2[18]分別作用于 PI3K/Akt/mTOR 信號通路和轉錄通路加重心肌肥厚。本課題組[19]的前期研究也發現，miR-297 可通過靶向 Sig-1R 并影響 ATF4/Xbps1 內質網應激通路而加重心肌肥厚。
近期 miR-130a-3p 的研究在代謝相關疾病中引起學者關注。肝外泌體中的 miR-130a-3p 可通過抑制 PHLPP2 和激活 AKT-AS160-GLUT4 信號通路來改善脂肪細胞的糖耐量受損[10]。miR-130a-3p 在一些心血管疾病中也顯示出重要的調控作用，可能參與包括心肌纖維化等心力衰竭的病理生理過程[20]。本研究發現 miR-130a-3p 在壓力超負荷導致的肥厚心肌組織以及肥大的心肌細胞中表達均下降。隨著心肌肥厚的進展，心臟將發生重構，心肌間質的成纖維細胞發生活化[21-22]，過度增殖、合成及分泌增加，miRNA 在此過程中的作用也不可忽視[23]。例如，miR-133a[24]可通過靶向 IGF-1 而調節 Akt/GSK-3β 通路以抑制心肌纖維化；miR-29b[25]在丹參酮的作用下表達升高從而可緩解心肌纖維化的發生。我們在實驗中發現，miR-130a-3p 在 TGF-β1 誘導的活化原代心肌成纖維細胞中表達也下降，但由于心肌纖維化的發生機制與心肌細胞肥大的發生機制不同，故而本文僅關注 miR-130a-3p 在緩解心肌細胞肥大中的作用及機制。
我們的研究發現，過表達 miR-130a-3p 可緩解 NE 誘導的 H9c2 心肌細胞的肥大程度，而該作用可能是通過抑制 mTOR 及 Akt 信號分子的磷酸化水平來實現的。研究表明，mTOR 信號通路相關蛋白在壓力超負荷性心肌肥厚及 H9c2 細胞肥大時表達增加[26]。研究表明 PI3K/Akt 信號通路參與了心肌細胞肥大的病理過程[27]，如 NE 對心臟中 α-腎上腺素能受體的作用導致 PI3K 被激活，從而使 Akt 募集和激活。一些 microRNA 對該通路中的信號分子有直接的靶向作用或間接的調控作用。最近研究顯示，PIK3CA 是 miR-203 的直接靶基因[11]，而過表達 miR-203 可通過抑制 PI3K/Akt 的活化從而在糖尿病心肌病所致的心肌纖維化過程中起保護性作用。另外，miR-200a-3p 可間接激活 PI3k/Akt 通路而參與心肌肥厚過程[28]。因此，本研究為將來心肌肥厚的治療提供了新的思路。
我們目前的研究雖然觀察到過表達 miR-130a-3p 通過影響 Akt 等信號分子的活化，對心肌細胞肥大有緩解作用，但其具體作用的靶點尚不清楚，值得進一步探索。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
在受到神經體液因子刺激、壓力超負荷損傷及其他肥厚性刺激后，心臟將會發生形態、大小、結構和功能的一系列改變，被稱為心肌重構（myocardial remodeling）[1]。其主要病理改變包括心肌細胞肥大、心肌纖維化等。此時，心肌細胞中的一些胚胎時期基因，如心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）和肌球蛋白重鏈 β（β-myosin heavy chain，β-MHC）等會出現再表達[2-3]，且心肌細胞體積增大，蛋白質合成增多。
研究證實，參與心肌細胞肥大的信號通路包括細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt）、內質網應激、線粒體動力學改變以及活性氧刺激等[3]。壓力超負荷等肥厚性刺激常導致氧化應激增加并誘發內質網應激，而 PI3K/Akt 通路則可直接調控心肌細胞肥大進程[4-5]。但目前，心肌細胞肥大的調控機制仍未完全闡明。
微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類長 19～25 個堿基的非編碼 RNA 分子，其主要作用是通過與靶 mRNA 的 3'端 UTR 區結合后參與 mRNA 沉默以及基因表達的轉錄后調節。研究顯示，miRNA 參與了多種心血管疾病的發生發展過程[6]。其中，miR-130a-3p 可逆轉由 PDE4D 誘導的心肌梗死過程[7]。冠心病患者血漿中 miR-130a-3p 的水平與冠狀動脈粥樣硬化程度呈負相關[8]。然而，miR-130a-3p 在心肌肥厚中的作用如何，目前尚未見報道。因此，本文旨在探索 miR-130a-3p 對心肌細胞肥大的作用及其可能的機制。
1 材料與試劑
1.1 主要試劑
杜氏培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）高糖培養基、Ⅱ型膠原酶購自美國 Gibco 公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自以色列 BI 公司，熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）引物購自中國擎科梓熙生物技術有限公司，Lipofectamine 3000 購自美國 Invitrogen 公司，RNA 提取試劑盒購自中國北京天漠科技開發有限公司，逆轉錄試劑盒（Rever Tra Ace 組合型）購自日本 Toyobo 公司，miRNA 逆轉錄及定量試劑盒、miRNA 引物及內參、miR-130a-3p mimics/inhibitor、N.C. mimics/inhibitor 購自中國廣州復能基因有限公司，RT-qPCR 試劑盒 SYBR Green PCR Master Mix、增強化學發光試劑購自美國 Bio-Rad 公司，兔抗 α-actinin 購自中國杭州華安生物技術有限公司，兔抗 p-Akt、Akt 購自美國 Proteintech 公司，兔抗 p-mTOR、mTOR 購自美國 Abcam 公司，小鼠抗 GAPDH 抗體購自美國 Santa-Cruz 公司，山羊抗小鼠、兔 IgG 購自中國北京中杉金橋生物技術有限公司，PVDF 膜購自瑞士 Roche 公司，去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）購自加拿大 Sigma 公司。
1.2 實驗動物
本實驗所用動物為健康 0～3 d 齡的 Sprague Dawley（SD）乳鼠（SCXK（川）2015-303），購自四川省達碩實驗動物中心，C57BL/6 小鼠（SCXK（京）2016-0006）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。本實驗經四川大學華西醫院動物倫理委員會批準通過（倫理備案號：2018162A）。
2 實驗方法
2.1 壓力超負荷所致小鼠心肌肥厚模型建立
實驗分組：將 7～9 周齡、22～24 g 雄性 C57BL/6 小鼠隨機分為：① 假手術組（Sham 組，n = 10）；② 胸主動脈縮窄手術組（TAC 組，n = 10）。按參考文獻方法[9]，異氟烷誘導麻醉后氣管插管，TAC 組于第 2-3 肋間分離暴露主動脈弓，結扎第二分支處；Sham 組同期開胸但不進行主動脈弓結扎。手術 4 周后 RT-qPCR 檢測心肌肥大標志物 ANP、BNP 及 β-MHC 的表達，行組織學蘇木精?伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察心肌細胞肥大程度。
2.2 新生大鼠原代心肌細胞分離培養及肥大模型建立
按照本實驗室以前報道[9]的方法分離新生大鼠原代心肌細胞（neonatal rat cardiomyocytes，NRCMs）：將 0～3 d 齡的 SD 乳鼠消毒處死后，取左心室剪碎，0.05% 胰蛋白酶+0.05% Ⅱ型膠原酶 37℃ 消化三次，每次約 5 min，含加 10% FBS 的培養基終止消化。200 目篩網過濾后，300 g/min 離心 5 min，棄上清，加入含 10% FBS 的 DMEM 高糖培養基重懸細胞，置于 37℃、5% CO2 孵箱中培養。差速貼壁 1 h 后將上清移入 12/24 孔板中，24 h 換液后加入 50 μmol/L 溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU）繼續培養。用 α-actinin 抗體鑒定 NRCMs 的純度。48 h 后，采用 1 × 10?5 mol/L 的 NE 處理 NRCMs 24 h 誘導其發生肥大表型。實驗分組：① 對照組（n = 6）；② NE 組（1 × 10?5 mol/L，n = 6）。
2.3 H9c2 心肌細胞系培養及肥大模型建立
H9c2 胚胎期大鼠心肌細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，由本實驗室保存。使用含 10% FBS、1% 青霉素-鏈霉素和 4 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM 高糖培養基，常規傳代培養。采用 1 × 10?5 mol/L 的 NE 處理 NRCMs 24 h 誘導其發生肥大表型。實驗分組（n = 6）：① 未加刺激的對照組；② NE 組（1 × 10?5 mol/L）。
2.4 轉染及實驗分組
轉染方法：轉染前一天，將 H9c2 細胞接種至含有 1 mL 完全培養基的 12 孔板中，保證轉染時密度達 50%。按照說明書使用 Lipofectamine 3000 轉染 miR-130a-3p mimics/inhibitor、N.C. mimics/inhibitor 24 h 后，再根據需要加入或不加 1 × 10?5 mol/L NE 刺激 24 h 誘導其發生肥大。根據使用說明書采用 miRNA mimic 工作濃度為 50 nmol/L，miRNA inhibitor 工作濃度為 100 nmol/L（根據說明書，miRNA inhibitor 往往需要較大的用量才能觀察到較好的抑制效果，可能與其競爭性抑制的作用機制及作用效率有關）。
實驗分組（n = 4）：① mimics N.C.；② mimics N.C.+NE；③ miR-130a-3p mimics；④ miR-130a-3p mimics+NE；⑤ inhibitor N.C.；⑥ inhibitor N.C.+NE；⑦ miR-130a-3p inhibitor；⑧ mimics miR-130a-3p+NE。
2.5 RT-qPCR 檢測基因及 miRNA 表達變化
mRNA 定量檢測：使用 RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA，將 1.5 μg 總 RNA 逆轉錄后采用 SYBR Green PCR Master Mix 在 qPCR 儀（CFX96TM，Bio-Rad）上對 ANP、BNP、β-MHC 等 mRNA 變化進行熒光定量檢測。引物序列見表 1 所示，β-actin 作為內參對目的基因的表達進行校正。
表1
定量 RT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequences for quantitative PCR
miRNA 定量檢測：使用 RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA，將 1.5 μg 總 RNA 采用多聚腺苷酸加尾法逆轉錄，使用成熟體 miRNA 定量檢測體系對 miR-130a-3p 進行熒光定量檢測。U6 作為內參對目的 miRNA 表達進行校正。
2.6 Western blot 檢測
RIPA 裂解組織或細胞獲取總蛋白，用 BCA 法測定蛋白濃度后，取 25 μg 總蛋白上樣，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，將蛋白轉至 PVDF 膜，封閉后 4℃ 孵育一抗（1∶1 000）過夜，TBST 洗滌后用相應二抗（1∶3 000）室溫孵育 2 h，電化學發光試劑（electrochemiluminescence，ECL）顯影。GAPDH 作為內參，采用 Image J 軟件對條帶進行灰度分析。
2.7 細胞面積測定
按照本實驗室以前報道[9]的方法，接種細胞爬片于 24 孔板中，轉染/刺激后用 4% 多聚甲醛固定，室溫使用 0.5% triton + 1% BSA（PBS 緩沖液配制）封閉 1 h；一抗（1∶400，PBS 配制）于 4℃ 孵育過夜；預冷 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min；室溫使用二抗（1∶1 000，PBS 配制）避光孵育 1 h，預冷 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min；DAPI 復染細胞核 5 min 后封片。熒光顯微鏡下觀察并采圖，Image J 軟件分析細胞面積改變情況。
2.8 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計分析軟件處理實驗數據，Graphpad prism 6 繪制圖片，實驗結果以均數 ± 標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
3 結果
3.1 TAC 法誘導心肌肥厚小鼠模型的建立及鑒定
通過 HE 染色（見圖 1a），可觀察到 TAC 組小鼠心肌細胞橫截面積較 sham 組顯著增大。RT-qPCR 顯示（見圖 1b），TAC 組小鼠心臟組織中肥厚標志基因 ANP、BNP、β-MHC 的 mRNA 水平較 Sham 組明顯上升，差異具有統計學意義。
圖1
TAC 法誘導小鼠心肌肥厚模型的鑒定
a. 小鼠心肌組織 HE 染色；b. 小鼠心肌組織肥大基因表達水平（**
a. HE staining of mice myocardial tissue; b. hypertrophic gene expression of mice cardiac tissue (**
3.2 NE 誘導 NRCMs 和 H9c2 細胞發生肥大表型
3.2.1 NRCMs 肥大模型建立和鑒定
通過心肌細胞特異性蛋白 α-actinin 免疫熒光染色（見圖 2a、b），可見 NRCMs 受到 NE 刺激后，面積較對照組明顯增大，差異具有統計學意義。RT-qPCR 結果（見圖 2c）顯示，NE 刺激組 ANP、BNP、β-MHC 的 mRNA 水平較對照組明顯上升，差異具有統計學意義。
圖2
NRCMs 和 H9c2 細胞 1 × 10?5 mol/L NE 刺激后發生肥大表型改變
a，b. NRCMs α-actinin 染色；c. NRCMs 肥大基因表達水平；d，e. H9c2 細胞 F-actin 染色；f. H9c2 細胞系肥大基因表達水平（*
a, b. α-actinin staining of primary cultured NRCMs; c. hypertrophic gene expression in NRCMs; d, e. F-actin staining of H9c2 cells; f. hypertrophic gene expression in H9c2 cells (*
3.2.2 H9c2 細胞肥大模型建立及鑒定
通過 F-actin 免疫熒光染色（見圖 2d、e），可觀察到 NE 刺激后，H9c2 細胞面積較對照組明顯增大，差異具有統計學意義。RT-qPCR 結果（見圖 2f）顯示，H9c2 細胞 NE 刺激組 ANP、BNP、β-MHC 的 mRNA 水平較對照組明顯上升，差異具有統計學意義。
3.3 miR-130a-3p 在肥厚心肌組織、肥大 NRCMs 及肥大 H9c2 細胞中的表達變化
以 U6 為內參，RT-qPCR 結果顯示（見圖 3），心肌組織中，TAC 組小鼠 miR-130a-3p 與 Sham 組相比顯著下降；NRCMs 中 NE 刺激組 miR-130a-3p 與對照組相比顯著下降；H9c2 細胞中 NE 刺激組 miR-130a-3p 與對照組相比顯著下降，差異具有統計學意義。
圖3
miR-130a-3p 在肥厚心肌組織、肥大 NRCMs 和肥大 H9c2 細胞中的表達變化（* P < 0.05，**P < 0.01）
Figure3.
Expression of miR-130a-3p in mice hypertrophic myocardium，hypertrophic NRCMs and hypertrophic H9c2 cells (* P < 0.05, **P < 0.01)
3.4 過表達 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
3.4.1 特異性 miR-130a-3p mimics 可使 miR-130a-3p 過表達
為了探索 miR-130a-3p 能否調節心肌細胞肥大的程度，在培養的 H9c2 細胞內轉染特異性 miR-130a-3p mimics 以過表達 miR-130a-3p，通過 RT-qPCR 檢測其表達水平。觀察到轉染 48 h 后，miR-130a-3p mimics 組 miR-130a-3p 的表達較 mimics N.C.組顯著上升（見圖 4a）。
圖4
過表達 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
a. 轉染 miR-130a-3p mimics 后 miR-130a-3p 的表達改變；b，c，d. 過表達 miR-130a-3p 后肥大基因表達水平；e，f. 過表達 miR-130a-3p 后 H9c2 細胞面積的變化（*
a. expression of miR-130a-3p after transfection of miR-130a-3p mimics; b, c, d. hypertrophic gene expression in H9c2 cells after over expression of miR-130a-3p; e, f. cell surface area change after overexpression of miR-130a-3p (*
3.4.2 過表達 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
過表達 miR-130a-3p 24h 后，給予 H9c2 細胞 NE 刺激 24 h，觀察到 miR-130a-3p mimics+NE 組 ANP、BNP 和 β-MHC 水平較 mimics N.C.+NE 組顯著下降（見圖 4b、c、d），且 miR-130a-3p mimics + NE 組細胞面積較 mimics N.C.+NE 組也顯著減小（見圖 4e、f）。
以上結果提示過表達 miR-130a-3p 對 NE 誘導的 H9c2 細胞肥大過程有明顯的緩解作用。
3.5 抑制 miR-130a-3p 的表達對 H9c2 細胞肥大表型的影響
3.5.1 特異性 miR-130a-3p inhibitor 可抑制 miR-130a-3p 的表達
在培養的 H9c2 細胞內轉染特異性 miR-130a-3p inhibitor，以抑制 miR-130a-3p 的表達，通過 RT-qPCR 檢測其表達水平。觀察到轉染 48 h 后，miR-130a-3p inhibitor 組 miR-130a-3p 的表達較 inhibitor N.C.組下降約 98%（見圖 5a）。
圖5
抑制 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
a. 轉染 miR-130a-3p inhibitor 可降低 miR-130a-3p 的表達水平；b，c，d. 抑制 miR-130a-3p 表達后肥大基因表達水平改變；e，f. 抑制 miR-130a-3p 表達后相對細胞面積的變化（*
a. expression of miR-130a-3p after transfection of miR-130a-3p inhibitor; b, c, d. hypertrophic gene expression in H9c2 cells after inhibition of miR-130a-3p; e, f. cell surface area change after inhibition of miR-130a-3p (*
3.5.2 抑制 miR-130a-3p 對 H9c2 細胞肥大表型的影響
miR-130a-3p 表達 24 h 后，給予 H9c2 細胞 NE 刺激，觀察到 miR-130a-3p inhibitor+NE 組 ANP、BNP 和 β-MHC 水平較 inhibitor N.C.+NE 組顯著升高（見圖 5b、c、d）。同時，H9c2 細胞面積在 miR-130a-3p inhibitor+NE 組較 inhibitor N.C.+NE 組也顯著上升（見圖 5e、f）。
以上結果提示敲低 miR-130a-3p 表達可進一步加重 NE 誘導的 H9c2 細胞肥大程度。
3.6 miR-130a-3p 調控 H9C2 心肌細胞肥大的機制探究
研究報道，miR-130a-3p 對 Akt 信號通路的活化有影響[10]，而 Akt 通路在心肌細胞肥大過程中起重要作用[11]。因此，我們觀察了 miR-130a-3p 對 Akt 通路信號分子，包括 p-mTOR、mTOR 和 p-Akt、Akt 蛋白表達的情況。
Western blot 結果發現，相對于 mimics N.C.組，在 mimics N.C.+NE 組中，H9c2 細胞中 Akt 蛋白表達顯著升高，而 miR-130a-3p mimics+NE 組較 mimics N.C.+NE 組的蛋白表達水平有明顯下調（見圖 6）。提示過表達 miR-130a-3p 可影響 Akt 信號通路中關鍵蛋白 Akt 的表達。
圖6
上調 miR-130a-3p 對 Akt 通路蛋白的影響（*P < 0.05）
Figure6.
Effect of up-regulation of miR-130a-3p on Akt pathway proteins in H9c2 cells (*P < 0.05)
4 討論
近年來研究發現，miRNA 在心肌肥厚的發生發展中起重要作用[12]。文獻報道，miR-1 可通過靶向 Calcineurin[13]和 MCU[14]影響 Calcium 通路，以及靶向 CDK6-Rb[15]和 IGF-1[16]影響轉錄而緩解心肌肥厚；而 miR-217 則可通過靶向 PTEN[17]和 H3K9me2/EHMT1&2[18]分別作用于 PI3K/Akt/mTOR 信號通路和轉錄通路加重心肌肥厚。本課題組[19]的前期研究也發現，miR-297 可通過靶向 Sig-1R 并影響 ATF4/Xbps1 內質網應激通路而加重心肌肥厚。
近期 miR-130a-3p 的研究在代謝相關疾病中引起學者關注。肝外泌體中的 miR-130a-3p 可通過抑制 PHLPP2 和激活 AKT-AS160-GLUT4 信號通路來改善脂肪細胞的糖耐量受損[10]。miR-130a-3p 在一些心血管疾病中也顯示出重要的調控作用，可能參與包括心肌纖維化等心力衰竭的病理生理過程[20]。本研究發現 miR-130a-3p 在壓力超負荷導致的肥厚心肌組織以及肥大的心肌細胞中表達均下降。隨著心肌肥厚的進展，心臟將發生重構，心肌間質的成纖維細胞發生活化[21-22]，過度增殖、合成及分泌增加，miRNA 在此過程中的作用也不可忽視[23]。例如，miR-133a[24]可通過靶向 IGF-1 而調節 Akt/GSK-3β 通路以抑制心肌纖維化；miR-29b[25]在丹參酮的作用下表達升高從而可緩解心肌纖維化的發生。我們在實驗中發現，miR-130a-3p 在 TGF-β1 誘導的活化原代心肌成纖維細胞中表達也下降，但由于心肌纖維化的發生機制與心肌細胞肥大的發生機制不同，故而本文僅關注 miR-130a-3p 在緩解心肌細胞肥大中的作用及機制。
我們的研究發現，過表達 miR-130a-3p 可緩解 NE 誘導的 H9c2 心肌細胞的肥大程度，而該作用可能是通過抑制 mTOR 及 Akt 信號分子的磷酸化水平來實現的。研究表明，mTOR 信號通路相關蛋白在壓力超負荷性心肌肥厚及 H9c2 細胞肥大時表達增加[26]。研究表明 PI3K/Akt 信號通路參與了心肌細胞肥大的病理過程[27]，如 NE 對心臟中 α-腎上腺素能受體的作用導致 PI3K 被激活，從而使 Akt 募集和激活。一些 microRNA 對該通路中的信號分子有直接的靶向作用或間接的調控作用。最近研究顯示，PIK3CA 是 miR-203 的直接靶基因[11]，而過表達 miR-203 可通過抑制 PI3K/Akt 的活化從而在糖尿病心肌病所致的心肌纖維化過程中起保護性作用。另外，miR-200a-3p 可間接激活 PI3k/Akt 通路而參與心肌肥厚過程[28]。因此，本研究為將來心肌肥厚的治療提供了新的思路。
我們目前的研究雖然觀察到過表達 miR-130a-3p 通過影響 Akt 等信號分子的活化，對心肌細胞肥大有緩解作用，但其具體作用的靶點尚不清楚，值得進一步探索。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
