目的構建沉默信息調節因子1(sirt1)過表達慢病毒載體, 觀察其在體外培養的視網膜神經節細胞(RGC)中的表達。 方法構建大鼠sirt1 cDNA的過表達慢病毒載體, 采用PCR鑒定其是否構建成功。同時將其與GenBank上sirt1 cDNA標準序列進行對比分析。將鑒定后的慢病毒重組表達質粒pLV5-sirt1與包裝質粒共轉染293T細胞, 制備攜帶sirt1的慢病毒pLV5-sirt1。體外培養Sprague-Dawley大鼠的RGC, 應用pLV5-sirt1感染細胞設為sirt1過表達慢病毒組, 同時設未感染組和空載體感染組。采用熒光顯微鏡觀察細胞感染效率, 實時PCR和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測sirt1 mRNA和蛋白表達水平。 結果PCR鑒定結果顯示, 在1680堿基對處有擴增條帶, 表達的DNA條帶與sirt1目的片段大小一致。與GenBank上sirt1 cDNA標準序列進行對比分析, 測序結果顯示其含有與設計相同的靶序列。熒光顯微鏡觀察發現, 空載體感染組和sirt1過表達慢病毒組均可看到綠色熒光, 感染效率在90%以上。實時PCR檢測結果顯示, sirt1過表達慢病毒組sirt1 mRNA表達水平較未感染組、空載體感染組均明顯升高, 差異有統計學意義(P＜0.05)。Western blot檢測結果顯示, sirt1過表達慢病毒組sirt1蛋白表達水平較未感染組、空載體感染組均明顯升高, 差異有統計學意義(P＜0.05)。 結論成功構建的大鼠sirt1過表達慢病毒載體能夠在體外有效感染大鼠RGC, 提高sirt1在RGC中的表達水平。
目的 觀察解偶聯蛋白-2（UCP-2）基因差異表達對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增生及凋亡的影響。 方法 構建UCP-2 rs660339位點堿基是胞嘧啶（C）或胸腺嘧啶（T）的慢病毒載體UCP-2C、UCP-2T。將HUVEC分為UCP-2C組、UCP-2T組、陰性對照（NC）組，分別轉染UCP-2C、UCP-2T、無意義陰性病毒。熒光顯微鏡觀察各組HUVEC病毒感染效率；實時定量聚合酶鏈反應檢測各組HUVEC UCP-2 mRNA表達；細胞計數試劑盒、流式細胞儀檢測各組HUVEC增生、凋亡情況；蛋白免疫印跡法、激光共聚焦顯微鏡檢測各組HUVEC B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白的表達及熒光強度。 結果 各組HUVEC病毒感染效率均＞80%。UCP-2C組、UCP-2T組HUVEC UCP-2 mRNA表達較NC組顯著增高,差異有統計學意義（F=29.183，P=0.001）。目的病毒感染后48、72、96 h，UCP-2C組、UCP-2T組HUVEC增生顯著高于NC組，差異有統計學意義（F=15.970、16.738、5.414，P=0.004、0.004、0.045）。感染后72 h，與NC組比較，UCP-2T組、UCP-2C組HUVEC凋亡率均降低，差異有統計學意義（F=277.138，P=0.000）；UCP-2T組HUVEC凋亡率較UCP-2C組低（P=0.003）。UCP-2T組、UCP-2C組HUVEC Bcl-2蛋白表達顯著高于NC組，差異有統計學意義（F=425.679，P=0.000）；UCP-2T組HUVEC Bcl-2蛋白表達高于UCP-2C組（P=0.002）。UCP-2T組、UCP-2C組HUVEC Bcl-2蛋白熒光強度顯著高于NC組，差異有統計學意義（F=11.827，P=0.008）；UCP-2T組、UCP-2C組之間HUVEC Bcl-2蛋白熒光強度差異無統計學意義（P=0.404）。 結論 UCP-2 rs660339位點差異表達可能影響HUVEC增生及凋亡；UCP-2T較UCP-2C抑制凋亡作用更顯著。
目的 觀察靶向大鼠沉默信息調節因子1（Sirt1）基因的小干擾（si）RNA慢病毒載體對大鼠視網膜神經節細胞（RGC）中Sirt1表達的影響。 方法 設計4條靶向大鼠Sirt1基因的siRNA靶點序列，構建靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒載體。采用菌落聚合酶鏈反應（PCR）和DNA測序鑒定陽性克隆。應用陽性重組質粒與包裝質粒共轉染293T細胞，進行慢病毒包裝及病毒滴度測定。將RGC分為空白對照組、轉染陰性對照病毒載體組（NC組）以及分別轉染4個帶有干擾序列的si-Sirt1-1組、si-Sirt1-2組、si-Sirt1-3組、si-Sirt1-4組。采用熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法（Western blot）分別檢測各組RGC中Sirt1 mRNA、蛋白相對表達量。 結果 菌落PCR鑒定和DNA測序結果顯示，靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒載體構建成功。在293T細胞中成功包裝后，其病毒滴度為8×108 TU/ml。熒光定量PCR和Western blot檢測結果顯示，與NC組比較，si-Sirt1-1組、si-Sirt1-2組、si-Sirt1-3組、si-Sirt1-4組RGC中Sirt1 mRNA、蛋白相對表達量均明顯下降，差異有統計學意義（F=27.682、1 185.206，P=0.000、0.000）；其中，以si-Sirt1-2組Sirt1 mRNA、蛋白相對表達量下降幅度最為明顯。 結論 靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒載體可降低大鼠RGC中sirt1 mRNA、蛋白表達。
目的 構建攜帶色素上皮衍生因子（PEDF）基因的慢病毒（LV）載體并轉染人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs），初步探討基因修飾PEDF-間充質干細胞的可行性。 方法 采用基因重組方法構建LV-PEDF載體，測定其LV滴度，以感染復數（MOI）值為10、30、50 的LV體外轉染hUCMSCs，并據此分為相應MOI值實驗組；以不含PEDF基因的相同MOI值的重組LV載體[LV-綠色熒光蛋白（GFP）]轉染hUCMSCs，并據此分為 相應MOI值對照組。熒光顯微鏡觀察兩組細胞轉染效率并計算轉染率。采用細胞免疫熒光法、免疫細胞化學法、實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測50MOI實驗組、50MOI對照組細胞中PEDF、血管內皮生長因子（VEGF） 表達水平。 結果 經酶切以及基因測序鑒定證明LV載體構建成功。轉染96 h后，50MOI實驗組細胞可見大量GFP表達，轉染效率為72.1%。熒光顯微鏡觀察發現，轉染后96 h，50MOI實驗組細胞胞漿PEDF、VEGF表達增強。光學顯微鏡觀察發現，轉染后96 h，50MOI實驗組細胞胞漿PEDF表達較低，而VEGF表達較強。RT-PCR檢測結果發現，50MOI實驗組、50MOI對照組細胞中PEDF mRNA相對表達量分別為0.170±0.028、0.015±0.007；VEGF mRNA相對表達量分別為0.265±0.022、0.285±0.049。兩組細胞中PEDF mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（F=70.29，P＜0.001）；VEGF mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（F=9.57，P＞0.05）。 結論 成功構建攜帶PEDF基因LV表達載體，并在hUCMSCs中過表達PEDF基因。
目的構建結締組織生長因子（CTGF）重組干擾載體（shRNA），觀察其對視網膜血管內皮細胞內源性CTGF表達的抑制作用。 方法構建人源CTGF shRNA，應用三質粒包裝系統獲得高滴度的CTGF shRNA慢病毒顆粒。感染視網膜血管內皮細胞，利用干擾載體中的紅色熒光標記示蹤并篩選慢病毒的最佳感染復數及起效時間。將細胞分為空白對照組（正常培養）、感染對照組（Scramble shRNA病毒感染）及CTGF敲低組（CTGF shRNA病毒感染）。通過Transwell細胞遷移實驗觀察3組細胞的遷移能力；實時定量聚合酶鏈反應（PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測3組細胞的結締組織生長因子（CTGF）、纖連蛋白（FN）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）的mRNA和蛋白表達。3組間數據比較采用方差分析。 結果CTGF shRNA的最佳感染復數為20，最佳起效時間是72 h。Transwell細胞遷移實驗結果顯示，CTGF敲低組穿過小孔細胞數較空白對照組及感染對照組明顯降低，差異均有統計學意義（F=20.64，P=0.002）。實時定量PCR及Western blot檢測結果顯示，CTGF敲低組CTGF、FN、α-SMA、ColⅠ mRNA（F=128.83、124.44、144.76、1 374.44，P=0.000、0.000、0.000、0.000）和蛋白表達（F=22.55、41.60、25.73、161.68，P=0.002、0.000、0.001、0.000）較空白對照組、感染對照組明顯降低，差異均有統計學意義。 結論成功構建的CTGF shRNA慢病毒顆粒可有效抑制視網膜血管內皮細胞遷移并下調內源性CTGF的表達。
目的觀察慢病毒介導（LV）的微小RNA（miR）-191對氧誘導視網膜病變（OIR）模型小鼠視網膜新生血管（RNV）的抑制作用。方法7日齡C57BL/6J小鼠80只，隨機分為正常組、非干預組、LV miR-191（LV-191）組、生理鹽水（NS）組、LV-綠色熒光蛋白（GFP）組，每組均為16只。參照文獻方法建立OIR小鼠模型。12日齡時，LV-191組、NS組、LV-GFP組，小鼠右眼玻璃體腔分別注射1 μl LV-191、NS、LV-GFP；正常組、非干預組小鼠不做處理。視網膜鋪片觀察視網膜無灌注區相對面積，病理切片計數突破內界膜的視網膜血管內皮細胞核數；實時定量PCR（RT-PCR）檢測小鼠視網膜中LV-191、p21 mRNA相對表達量。結果正常組、非干預組、LV-191組、NS組、LV-GFP組小鼠視網膜無灌注區面積比較，差異有統計學意義（F=127.20，P＜0.001）；突破內界膜的血管內皮細胞核計數比較，差異有統計學意義（F=31.71，P＜0.05）。RT-PCR檢測結果顯示，正常組、非干預組、LV-191組、NS組、LV-GFP組小鼠視網膜中miR-191、p21 mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（F=10.95、15.60，P＜0.05、＜0.05）。與正常組、非干預組、NS組、LV-GFP組小鼠比較，LV-191組視網膜中miR-191、p21 mRNA相對表達量均明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論慢病毒介導的miR-191可通過上調p21表達抑制RNV的生成。
目的觀察慢病毒介導聚嘧啶束結合蛋白相關剪接因子（PSF）對氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠視網膜新生血管的抑制作用。方法5日齡C57BL/6J小鼠112只隨機分為正常對照組、單純OIR模型組、OIR模型+慢病毒空載體處理組（以下簡稱Vec組）及OIR模型+ PSF慢病毒處理組（以下簡稱PSF組），分別為16、32、32、32只。小鼠7日齡時，正常對照組小鼠常規環境飼養；單純OIR模型組、Vec組及PSF組小鼠建立OIR模型。小鼠12日齡時，Vec組、PSF組小鼠玻璃體腔分別注射滴度為1×1011 TU/ml的空載體病毒或PSF慢病毒1 μl。正常對照組和單純OIR模型組小鼠不再做任何處理。小鼠17日齡時，采用HE染色計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核；作視網膜鋪片，測量各組小鼠視網膜無灌注區相對面積；采用實時定量PCR檢測各組小鼠視網膜中NF-E2相關因子2（Nrf2）和血紅素氧合酶1（HO-1）的mRNA相對表達量；采用Western blot檢測各組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相對表達量。組間比較采用單因素方差分析。結果正常對照組、單純OIR模型組、Vec組、PSF組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數分別為0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09個；視網膜無灌注區面積分別為0.00%、（35.71±2.81）%、（36.57±4.53）%、（15.33±4.75）%。4組間小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數及視網膜無灌注區面積比較，差異均有統計學意義（F=24.87、165.70，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組較正常對照組突破內界膜的血管內皮細胞核數增多，視網膜無灌注區面積增大；PSF組較單純OIR模型組、Vec組突破內界膜的血管內皮細胞核數減少，視網膜無灌注區面積減小，差異均有統計學意義（P＜0.05）。實時定量PCR及Western blot檢測結果顯示，4組間小鼠視網膜Nrf2、PSF mRNA相對表達量（F=53.66、83.54）以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量（F=58.38、52.69、24.79）比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠視網膜Nrf2、PSF mRNA相對表達量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較正常對照組明顯降低，PSF組小鼠視網膜Nrf2、PSF mRNA相對表達量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較單純OIR模型組、Vec組明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論慢病毒介導的PSF可通過上調Nrf2及HO-1的表達抑制OIR小鼠視網膜新生血管形成。