引用本文： 黃亮瑜, 柯屹峰, 林婷婷, 步紹翀, 任新軍, 焦明菲, 王勇, 胡立穎, 王瓊, 洪雅茹, 李筱榮, 東莉潔. 慢病毒介導聚嘧啶束結合蛋白相關剪接因子對氧誘導視網膜病變小鼠視網膜新生血管的抑制作用. 中華眼底病雜志, 2020, 36(1): 53-59. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2020.01.012 復制
由缺氧、高血糖等因素所致的線粒體內ROS大量堆積而誘發的氧化應激，可加重微血管代謝紊亂，導致微血管病變進一步惡化，從而在新生血管性疾病中發揮重要作用[1-3]。NF-E2相關因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶1（HO-1）通路作為關鍵的內源性抗氧化應激通路，在恢復氧化與抗氧化穩態平衡中發揮重要的調控作用[4-6]。本課題組前期研究結果證實，高表達聚嘧啶序列結合蛋白相關剪接因子（PSF）可以抑制ROS的產生進而緩解H2O2誘導的人RPE細胞凋亡[7]。鑒于在培養體系中添加H2O2是研究氧化應激的經典模型，而缺氧是氧化應激的重要觸發因素，我們推測PSF可能通過抑制氧化應激反應來調控新生血管的形成。為驗證這一推測，本研究觀察了玻璃體腔注射慢病毒介導的PSF對氧誘導視網膜病變（OIR）模型小鼠視網膜新生血管的抑制作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及OIR模型建立
5日齡C57BL/6J小鼠，雌雄不限，清潔級，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供。氧濃度90%、85%、（80±3）% 3個氧梯度濃度氮氧混合氣（天津塞米氣體有限公司）；CY-12C數字測氧儀（浙江建德梅城電化分析儀器廠）；高分子量異硫氰酸熒光素葡聚糖（FITC-dextran，美國Sigma公司）；10 μl微量注射器（Hamilton，美國Sigma公司）。腺病毒包裝及純化由本實驗室自行完成。Olymplus熒光顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）；7900HT實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；RNA提取試劑盒（美國Thermo公司）；逆轉錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）；SYBR熒光定量染料（德國Roche公司）；抗Nrf2（NFE2L2）抗體（PB0327）、抗HO-1抗體（BA0605-1）（美國Boster公司）；單克隆抗PSF抗體（P2860，美國Sigma公司）。
將5日齡C57BL/6J小鼠112只與成熟哺育雌鼠14只常規共養2 d。將112只小鼠隨機分為正常對照組、單純OIR模型組、OIR模型+慢病毒空載體處理組（以下簡稱Vec組）及OIR模型+ PSF慢病毒處理組（以下簡稱PSF組），分別為16、32、32、32只。于小鼠7日齡時，正常對照組小鼠與2只成熟哺育雌鼠繼續放置于常規環境飼養。單純OIR模型組、Vec組及PSF組小鼠與12只成熟哺乳雌鼠移入長方形密閉玻璃箱中飼養，預備90%、85%、80%氧氣注入密閉箱中，氧氣瓶濃度由高至低順序使用，密閉箱每日固定時間開啟一次，同時簡單更換墊料、添加食水，密閉后再以測氧儀確認密閉箱中氧濃度不低于氧氣瓶濃度10%，以確認飼養箱的密閉性持續維持高氧飼養環境。5 d后即小鼠12日齡時，將所有密閉箱雌鼠、小鼠移出密閉玻璃箱。正常對照組與單純OIR模型組小鼠不進行任何操作。Vec組與PSF組小鼠玻璃體腔注射空載體病毒或PSF慢病毒。顯微鑷輕輕撥開小鼠眼充分暴露眼球，33G微量注射器于上方垂直進針，確認針尖于眼內，未觸及晶狀體及視網膜，輕推滴度為1×1011 TU/ml的空載體病毒或PSF慢病毒1 μl，計時15 s后緩慢出針，給予左氧氟沙星滴眼液點眼抗炎抗感染治療，恢復至正常氧環境中繼續飼養至17日齡。
1.2 實驗方法
采用HE染色計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核。小鼠17日齡時，各組選取8只小鼠以頸椎脫臼法處死。取雙眼眼球充分浸泡于4%多聚甲醛中固定過夜，經常規酒精梯度充分脫水，二甲苯透明化，石蠟包埋保存。將蠟塊取出，經6 μm厚度連續切片，切片粘附于載玻片上，破膜水進行破膜，常溫10 min，吸除后以清水沖洗2次，浸泡于蘇木精染液中40 s（浸泡時間隨蘇木精染液使用情況而調整），清水漂洗2次；將載玻片浸泡于1%醋酸中2～3 s，清水沖洗2次；將載玻片浸泡于0.5%氨水中2～3 s，清水漂洗2次；將載玻片浸泡于伊紅染液中30 s（浸泡時間隨伊紅染液使用情況而調整），迅速過水后，按照酒精梯度流程（80%、85%、95%、100%、100%）每缸充分浸泡30 s脫水，浸泡過程輕輕擺動載玻片；最終將載玻片浸泡于二甲苯中1 min，取出晾干后覆上蓋玻片，光學顯微鏡觀察并照相。以雙盲法計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核。
作視網膜鋪片，測量各組小鼠視網膜無灌注區相對面積。小鼠17日齡時，各組選取8只小鼠。手指按壓固定小鼠頭部，使用1 ml注射器+33G針頭組合，將50 μl濃度50 mg/ml的FITC-dextran注入小鼠球后靜脈竇，用以標記著染視網膜血管。注射后松開小鼠，靜置5 min后以頸椎脫臼法處死并取出雙眼眼球。將眼球完全浸泡于4%多聚甲醛中，40 min后取出放入PBS中，4 ℃過夜。次日，使用顯微剪沿角膜緣環形剪開眼球，剝除角膜獲得完整碗狀視網膜，RGC層向上放置，使用顯微剪自赤道部往視神經處人字型剪開，完全鋪平視網膜。
采用實時定量PCR檢測各組小鼠視網膜中Nrf2和HO-1的mRNA相對表達量。小鼠17日齡時，各組選取8只小鼠頸椎脫臼法處死。摘取眼球放入離心管中將組織剪碎，加入1 ml、4 ℃預冷的Trizol，提取總RNA，超微量分光光度計測量波長260、280 nm處吸光度［A，舊稱光密度（OD）］比值（A260/A280）。以比值介于1.8～2.0之間視為良好，可用于后續逆轉錄反應。按照逆轉錄試劑盒操作說明逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系：1 μg RNA，1 μl 多聚胸腺嘧啶（T重復寡核酸），無酶水補充至總體性12 μl，65 ℃ 5 min；繼續添加4 μl 5倍反應緩沖液，1 μl核糖核酸酶抑制劑，1 μl 逆轉錄，2 μl 脫氧核糖核苷三磷酸，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。在NCBI數據庫中設計目的基因和內參基因的引物序列（表1），由金唯智生物科技有限公司合成引物。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，重復35個循環；37 ℃ 5 min。目的基因擴增產物的相對表達量應用2?ΔΔCT進行計算。
表1
目的基因引物序列
采用Western blot檢測各組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF的蛋白相對表達量。小鼠17日齡時，各組選取8只小鼠頸椎脫臼法處死。取視網膜放置于含有100 μl組織裂解液的1.5 ml離心管中，提取總蛋白，調整蛋白濃度。配制10%分離膠聚丙烯酰胺凝膠，以每組40 μg的總蛋白量進行上樣，SDS-PAGE分離蛋白復合物，電泳結束后利用半干轉膜法將蛋白條帶轉印至聚偏氟乙烯膜后，依次歷經5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，抗Nrf2抗體、抗HO-1抗體、抗PSF抗體一抗室溫孵育2 h，PBS洗膜10 min，重復3次；加入HRP偶聯的二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜10 min，重復3次。最后加入化學發光法曝光底物，進行曝光并拍照，以檢測靶蛋白表達。采用ImageJ圖像分析軟件進行灰度分析，以GAPDH作為內參照進行校正，計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。
1.3 統計學分析
采用SPSS18.0統計軟件行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（
±s）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，正常對照組小鼠視網膜未見突破內界膜的血管內皮細胞核；單純OIR模型組與Vec組小鼠視網膜中可見較多突破內界膜的血管內皮細胞核；PSF組小鼠視網膜中可見少量突破內界膜的血管內皮細胞核（圖1）。正常對照組、單純OIR模型組、Vec組、PSF組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數分別為0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09個。4組間小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數比較，差異有統計學意義（F=24.87，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數較正常對照組明顯增多，PSF組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數較單純OIR模型組、Vec組明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。
圖1
各組小鼠視網膜HE染色光學顯微鏡像。1A示正常對照組；1B示單純OIR模型組；1C示Vec組；1D示PSF組。正常對照組小鼠視網膜未見突破內界膜的血管內皮細胞核；單純OIR模型組與Vec組小鼠視網膜中可見較多突破內界膜的血管內皮細胞核；PSF組小鼠視網膜中可見少量突破內界膜的血管內皮細胞核 HE ×10
正常對照組小鼠視網膜血管呈亮綠色熒光著染，未見無灌注區；單純OIR模型組及Vec組小鼠視網膜可見大量無灌注區且周邊交界處清晰可見；PSF組小鼠視網膜可見少量未相連的無灌注區（圖2）。正常對照組、單純OIR模型組、Vec組、PSF組小鼠視網膜無灌注區面積分別為0.00%、（35.71±2.81）%、（36.57±4.53）%、（15.33±4.75）%。4組間小鼠視網膜無灌注區面積比較，差異有統計學意義（F=165.70，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠視網膜無灌注區面積較正常對照組明顯增大，PSF組小鼠視網膜無灌注區面積較單純OIR模型組、Vec組明顯減小，差異均有統計學意義（P＜0.05）。
圖2
各組小鼠視網膜鋪片熒光顯微鏡像。2A示正常對照組；2B示單純OIR模型組；2C示Vec組；2D示PSF組。正常對照組視網膜未見無灌注區，單純OIR模型組及Vec組小鼠視網膜可見大量無灌注區（紅色圈選區）；PSF組小鼠視網膜可見少量未相連的無灌注區（紅色圈選區） FITC-dextran ×10
實時定量PCR檢測結果顯示，4組間小鼠視網膜中Nrf2、PSF mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（F=53.66、83.54，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠視網膜中Nrf2、PSF mRNA相對表達量較正常對照組明顯降低，PSF組小鼠視網膜中Nrf2、PSF mRNA相對表達量較單純OIR模型組、Vec組明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。
圖3
各組小鼠視網膜中Nrf2、PSF mRNA相對表達量比較。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，4組間小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（F=58.38、52.69、24.79，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較正常對照組明顯降低，PSF組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較單純OIR模型組、Vec組明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。
圖4
各組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF的蛋白相對表達量比較。*P＜0.05
3 討論
研究發現，氧化應激在眼部病變中發揮重要作用[1,8-9]，氧化應激是指當體內抗氧化防御體系如超氧化物歧化酶、HO-1、過氧化氫酶等低于正常水平，導致ROS的產生與清除之間的穩態失衡，進而造成組織損傷的病理狀態[10-12]。在氧化應激情況下，ROS調控VEGF表達，活化VEGF受體，活化下游信號，導致內皮細胞的增生和遷移以及新生血管的形成[13-14]。不僅如此，諸多導致新生血管的因素如高氧、缺血再灌注和炎癥等均可引起體內產生過多的ROS[15-17]。換言之，由抗氧化治療入手很可能為抑制病理性新生血管的形成提供一種新的思路。
PSF是參與多種不同的生物學反應的多功能蛋白，包括DNA損傷修復、pre-mRNA的剪接加工以及基因的轉錄調控[18-19]。研究表明，IL-4刺激后，PSF可與信號轉導子和轉錄激活子6（STAT6）結合形成復合物，進而抑制IL-4/STAT6信號通路的轉錄激活[20]。并且，PSF通過調節細胞因子信號抑制物3的表達間接參與視神經再生的調控，這一發現對視神經損傷性疾病有重要的學術意義和潛在的應用價值[21]。
本課題組前期研究發現，PSF蛋白可以抑制OIR小鼠視網膜新生血管的形成，下調VEGF表達，從而抑制新生血管增生[22]。而將PSF引入RPE細胞體外氧化應激模型中，PSF蛋白可以抑制ROS堆積，維持RPE細胞的穩態平衡。考慮到氧化應激情況下，ROS調控VEGF表達，活化VEGF受體及下游信號，導致內皮細胞增生和遷移以及新生血管形成[23]。據此我們推測，PSF蛋白有可能通過活化抗氧化體系來抑制新生血管形成。為明確這一推論，本研究觀察分析了PSF對Nrf2及其下游基因HO-1的表達調控。Nrf2是參與調控抵抗氧化應激的主要核轉錄因子，當ROS等氧化應激因素存在時，Nrf2與抗氧化反應元件結合，誘導下游HO-1等多種抗氧化基因，從而發揮抗氧化應激保護細胞的作用[24]。
本研究結果顯示，玻璃體腔內注射PSF會導致小鼠視網膜組織內PSF的高表達，進而導致Nrf2 的表達上調；HO-1作為Nrf2的下游因子，其在視網膜組織內的表達量會隨之上調；HO-1作為ROS的負性調控因子，其表達上調會抑制視網膜組織內ROS生成，進而抑制HIF-1α表達。組織內HIF-1α表達減少，會導致VEGF以及VEGF受體表達下降，繼而在根本上抑制血管生成。PSF可以上調Nrf2的表達及其下游基因HO-1的表達，提示抑制氧化應激反應是PSF蛋白發揮作用的重要分子機制之一。
本課題組前期研究發現，PSF可以抑制視網膜血管內皮細胞中細胞外信號調節激酶信號通路的活化，下調VEGF表達，進而抑制內皮細胞增生[25]。此外，對于體外培養的RPE細胞，PSF可通過調控磷酸酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶信號通路的活化程度來影響VEGF的表達[26]。本研究結果顯示，PSF可上調HO-1的表達，抑制氧化應激反應。結合既往研究結果，我們認為，PSF與ROS誘導的VEGF表達之間可能存在某種關聯，即缺氧導致ROS堆積，過多的ROS誘導HIF-1α的轉錄活化，進而激活其下游VEGF表達。在后續的研究中，我們將把PSF引入人視網膜血管內皮細胞的缺氧模型，分別從細胞增生、遷移和管腔形成等多個方面去收集PSF參與血管新生的全面信息，解讀PSF對于視網膜新生血管調控的完整作用，從而為視網膜新生血管性疾病的基因治療夯實理論基礎。
由缺氧、高血糖等因素所致的線粒體內ROS大量堆積而誘發的氧化應激，可加重微血管代謝紊亂，導致微血管病變進一步惡化，從而在新生血管性疾病中發揮重要作用[1-3]。NF-E2相關因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶1（HO-1）通路作為關鍵的內源性抗氧化應激通路，在恢復氧化與抗氧化穩態平衡中發揮重要的調控作用[4-6]。本課題組前期研究結果證實，高表達聚嘧啶序列結合蛋白相關剪接因子（PSF）可以抑制ROS的產生進而緩解H2O2誘導的人RPE細胞凋亡[7]。鑒于在培養體系中添加H2O2是研究氧化應激的經典模型，而缺氧是氧化應激的重要觸發因素，我們推測PSF可能通過抑制氧化應激反應來調控新生血管的形成。為驗證這一推測，本研究觀察了玻璃體腔注射慢病毒介導的PSF對氧誘導視網膜病變（OIR）模型小鼠視網膜新生血管的抑制作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及OIR模型建立
5日齡C57BL/6J小鼠，雌雄不限，清潔級，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供。氧濃度90%、85%、（80±3）% 3個氧梯度濃度氮氧混合氣（天津塞米氣體有限公司）；CY-12C數字測氧儀（浙江建德梅城電化分析儀器廠）；高分子量異硫氰酸熒光素葡聚糖（FITC-dextran，美國Sigma公司）；10 μl微量注射器（Hamilton，美國Sigma公司）。腺病毒包裝及純化由本實驗室自行完成。Olymplus熒光顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）；7900HT實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；RNA提取試劑盒（美國Thermo公司）；逆轉錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）；SYBR熒光定量染料（德國Roche公司）；抗Nrf2（NFE2L2）抗體（PB0327）、抗HO-1抗體（BA0605-1）（美國Boster公司）；單克隆抗PSF抗體（P2860，美國Sigma公司）。
將5日齡C57BL/6J小鼠112只與成熟哺育雌鼠14只常規共養2 d。將112只小鼠隨機分為正常對照組、單純OIR模型組、OIR模型+慢病毒空載體處理組（以下簡稱Vec組）及OIR模型+ PSF慢病毒處理組（以下簡稱PSF組），分別為16、32、32、32只。于小鼠7日齡時，正常對照組小鼠與2只成熟哺育雌鼠繼續放置于常規環境飼養。單純OIR模型組、Vec組及PSF組小鼠與12只成熟哺乳雌鼠移入長方形密閉玻璃箱中飼養，預備90%、85%、80%氧氣注入密閉箱中，氧氣瓶濃度由高至低順序使用，密閉箱每日固定時間開啟一次，同時簡單更換墊料、添加食水，密閉后再以測氧儀確認密閉箱中氧濃度不低于氧氣瓶濃度10%，以確認飼養箱的密閉性持續維持高氧飼養環境。5 d后即小鼠12日齡時，將所有密閉箱雌鼠、小鼠移出密閉玻璃箱。正常對照組與單純OIR模型組小鼠不進行任何操作。Vec組與PSF組小鼠玻璃體腔注射空載體病毒或PSF慢病毒。顯微鑷輕輕撥開小鼠眼充分暴露眼球，33G微量注射器于上方垂直進針，確認針尖于眼內，未觸及晶狀體及視網膜，輕推滴度為1×1011 TU/ml的空載體病毒或PSF慢病毒1 μl，計時15 s后緩慢出針，給予左氧氟沙星滴眼液點眼抗炎抗感染治療，恢復至正常氧環境中繼續飼養至17日齡。
1.2 實驗方法
采用HE染色計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核。小鼠17日齡時，各組選取8只小鼠以頸椎脫臼法處死。取雙眼眼球充分浸泡于4%多聚甲醛中固定過夜，經常規酒精梯度充分脫水，二甲苯透明化，石蠟包埋保存。將蠟塊取出，經6 μm厚度連續切片，切片粘附于載玻片上，破膜水進行破膜，常溫10 min，吸除后以清水沖洗2次，浸泡于蘇木精染液中40 s（浸泡時間隨蘇木精染液使用情況而調整），清水漂洗2次；將載玻片浸泡于1%醋酸中2～3 s，清水沖洗2次；將載玻片浸泡于0.5%氨水中2～3 s，清水漂洗2次；將載玻片浸泡于伊紅染液中30 s（浸泡時間隨伊紅染液使用情況而調整），迅速過水后，按照酒精梯度流程（80%、85%、95%、100%、100%）每缸充分浸泡30 s脫水，浸泡過程輕輕擺動載玻片；最終將載玻片浸泡于二甲苯中1 min，取出晾干后覆上蓋玻片，光學顯微鏡觀察并照相。以雙盲法計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核。
作視網膜鋪片，測量各組小鼠視網膜無灌注區相對面積。小鼠17日齡時，各組選取8只小鼠。手指按壓固定小鼠頭部，使用1 ml注射器+33G針頭組合，將50 μl濃度50 mg/ml的FITC-dextran注入小鼠球后靜脈竇，用以標記著染視網膜血管。注射后松開小鼠，靜置5 min后以頸椎脫臼法處死并取出雙眼眼球。將眼球完全浸泡于4%多聚甲醛中，40 min后取出放入PBS中，4 ℃過夜。次日，使用顯微剪沿角膜緣環形剪開眼球，剝除角膜獲得完整碗狀視網膜，RGC層向上放置，使用顯微剪自赤道部往視神經處人字型剪開，完全鋪平視網膜。
采用實時定量PCR檢測各組小鼠視網膜中Nrf2和HO-1的mRNA相對表達量。小鼠17日齡時，各組選取8只小鼠頸椎脫臼法處死。摘取眼球放入離心管中將組織剪碎，加入1 ml、4 ℃預冷的Trizol，提取總RNA，超微量分光光度計測量波長260、280 nm處吸光度［A，舊稱光密度（OD）］比值（A260/A280）。以比值介于1.8～2.0之間視為良好，可用于后續逆轉錄反應。按照逆轉錄試劑盒操作說明逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系：1 μg RNA，1 μl 多聚胸腺嘧啶（T重復寡核酸），無酶水補充至總體性12 μl，65 ℃ 5 min；繼續添加4 μl 5倍反應緩沖液，1 μl核糖核酸酶抑制劑，1 μl 逆轉錄，2 μl 脫氧核糖核苷三磷酸，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。在NCBI數據庫中設計目的基因和內參基因的引物序列（表1），由金唯智生物科技有限公司合成引物。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，重復35個循環；37 ℃ 5 min。目的基因擴增產物的相對表達量應用2?ΔΔCT進行計算。
表1
目的基因引物序列
采用Western blot檢測各組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF的蛋白相對表達量。小鼠17日齡時，各組選取8只小鼠頸椎脫臼法處死。取視網膜放置于含有100 μl組織裂解液的1.5 ml離心管中，提取總蛋白，調整蛋白濃度。配制10%分離膠聚丙烯酰胺凝膠，以每組40 μg的總蛋白量進行上樣，SDS-PAGE分離蛋白復合物，電泳結束后利用半干轉膜法將蛋白條帶轉印至聚偏氟乙烯膜后，依次歷經5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，抗Nrf2抗體、抗HO-1抗體、抗PSF抗體一抗室溫孵育2 h，PBS洗膜10 min，重復3次；加入HRP偶聯的二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜10 min，重復3次。最后加入化學發光法曝光底物，進行曝光并拍照，以檢測靶蛋白表達。采用ImageJ圖像分析軟件進行灰度分析，以GAPDH作為內參照進行校正，計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。
1.3 統計學分析
采用SPSS18.0統計軟件行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，正常對照組小鼠視網膜未見突破內界膜的血管內皮細胞核；單純OIR模型組與Vec組小鼠視網膜中可見較多突破內界膜的血管內皮細胞核；PSF組小鼠視網膜中可見少量突破內界膜的血管內皮細胞核（圖1）。正常對照組、單純OIR模型組、Vec組、PSF組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數分別為0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09個。4組間小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數比較，差異有統計學意義（F=24.87，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數較正常對照組明顯增多，PSF組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數較單純OIR模型組、Vec組明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。
圖1
各組小鼠視網膜HE染色光學顯微鏡像。1A示正常對照組；1B示單純OIR模型組；1C示Vec組；1D示PSF組。正常對照組小鼠視網膜未見突破內界膜的血管內皮細胞核；單純OIR模型組與Vec組小鼠視網膜中可見較多突破內界膜的血管內皮細胞核；PSF組小鼠視網膜中可見少量突破內界膜的血管內皮細胞核 HE ×10
正常對照組小鼠視網膜血管呈亮綠色熒光著染，未見無灌注區；單純OIR模型組及Vec組小鼠視網膜可見大量無灌注區且周邊交界處清晰可見；PSF組小鼠視網膜可見少量未相連的無灌注區（圖2）。正常對照組、單純OIR模型組、Vec組、PSF組小鼠視網膜無灌注區面積分別為0.00%、（35.71±2.81）%、（36.57±4.53）%、（15.33±4.75）%。4組間小鼠視網膜無灌注區面積比較，差異有統計學意義（F=165.70，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠視網膜無灌注區面積較正常對照組明顯增大，PSF組小鼠視網膜無灌注區面積較單純OIR模型組、Vec組明顯減小，差異均有統計學意義（P＜0.05）。
圖2
各組小鼠視網膜鋪片熒光顯微鏡像。2A示正常對照組；2B示單純OIR模型組；2C示Vec組；2D示PSF組。正常對照組視網膜未見無灌注區，單純OIR模型組及Vec組小鼠視網膜可見大量無灌注區（紅色圈選區）；PSF組小鼠視網膜可見少量未相連的無灌注區（紅色圈選區） FITC-dextran ×10
實時定量PCR檢測結果顯示，4組間小鼠視網膜中Nrf2、PSF mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（F=53.66、83.54，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠視網膜中Nrf2、PSF mRNA相對表達量較正常對照組明顯降低，PSF組小鼠視網膜中Nrf2、PSF mRNA相對表達量較單純OIR模型組、Vec組明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。
圖3
各組小鼠視網膜中Nrf2、PSF mRNA相對表達量比較。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，4組間小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（F=58.38、52.69、24.79，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較正常對照組明顯降低，PSF組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較單純OIR模型組、Vec組明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。
圖4
各組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1、PSF的蛋白相對表達量比較。*P＜0.05
3 討論
研究發現，氧化應激在眼部病變中發揮重要作用[1,8-9]，氧化應激是指當體內抗氧化防御體系如超氧化物歧化酶、HO-1、過氧化氫酶等低于正常水平，導致ROS的產生與清除之間的穩態失衡，進而造成組織損傷的病理狀態[10-12]。在氧化應激情況下，ROS調控VEGF表達，活化VEGF受體，活化下游信號，導致內皮細胞的增生和遷移以及新生血管的形成[13-14]。不僅如此，諸多導致新生血管的因素如高氧、缺血再灌注和炎癥等均可引起體內產生過多的ROS[15-17]。換言之，由抗氧化治療入手很可能為抑制病理性新生血管的形成提供一種新的思路。
PSF是參與多種不同的生物學反應的多功能蛋白，包括DNA損傷修復、pre-mRNA的剪接加工以及基因的轉錄調控[18-19]。研究表明，IL-4刺激后，PSF可與信號轉導子和轉錄激活子6（STAT6）結合形成復合物，進而抑制IL-4/STAT6信號通路的轉錄激活[20]。并且，PSF通過調節細胞因子信號抑制物3的表達間接參與視神經再生的調控，這一發現對視神經損傷性疾病有重要的學術意義和潛在的應用價值[21]。
本課題組前期研究發現，PSF蛋白可以抑制OIR小鼠視網膜新生血管的形成，下調VEGF表達，從而抑制新生血管增生[22]。而將PSF引入RPE細胞體外氧化應激模型中，PSF蛋白可以抑制ROS堆積，維持RPE細胞的穩態平衡。考慮到氧化應激情況下，ROS調控VEGF表達，活化VEGF受體及下游信號，導致內皮細胞增生和遷移以及新生血管形成[23]。據此我們推測，PSF蛋白有可能通過活化抗氧化體系來抑制新生血管形成。為明確這一推論，本研究觀察分析了PSF對Nrf2及其下游基因HO-1的表達調控。Nrf2是參與調控抵抗氧化應激的主要核轉錄因子，當ROS等氧化應激因素存在時，Nrf2與抗氧化反應元件結合，誘導下游HO-1等多種抗氧化基因，從而發揮抗氧化應激保護細胞的作用[24]。
本研究結果顯示，玻璃體腔內注射PSF會導致小鼠視網膜組織內PSF的高表達，進而導致Nrf2 的表達上調；HO-1作為Nrf2的下游因子，其在視網膜組織內的表達量會隨之上調；HO-1作為ROS的負性調控因子，其表達上調會抑制視網膜組織內ROS生成，進而抑制HIF-1α表達。組織內HIF-1α表達減少，會導致VEGF以及VEGF受體表達下降，繼而在根本上抑制血管生成。PSF可以上調Nrf2的表達及其下游基因HO-1的表達，提示抑制氧化應激反應是PSF蛋白發揮作用的重要分子機制之一。
本課題組前期研究發現，PSF可以抑制視網膜血管內皮細胞中細胞外信號調節激酶信號通路的活化，下調VEGF表達，進而抑制內皮細胞增生[25]。此外，對于體外培養的RPE細胞，PSF可通過調控磷酸酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶信號通路的活化程度來影響VEGF的表達[26]。本研究結果顯示，PSF可上調HO-1的表達，抑制氧化應激反應。結合既往研究結果，我們認為，PSF與ROS誘導的VEGF表達之間可能存在某種關聯，即缺氧導致ROS堆積，過多的ROS誘導HIF-1α的轉錄活化，進而激活其下游VEGF表達。在后續的研究中，我們將把PSF引入人視網膜血管內皮細胞的缺氧模型，分別從細胞增生、遷移和管腔形成等多個方面去收集PSF參與血管新生的全面信息，解讀PSF對于視網膜新生血管調控的完整作用，從而為視網膜新生血管性疾病的基因治療夯實理論基礎。
