目的總結缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）在組織工程成骨和成血管中的作用和應用進展。 方法查閱國內外關于HIF-1α在組織工程成骨和成血管中的相關研究文獻，進行分析和歸納總結。 結果HIF-1α在成血管-成骨耦連反應中發揮關鍵作用，作為上游基因調控著體內多種成血管、成骨基因的表達；在組織工程骨的再生修復中，HIF-1α不僅調節和促進血管生成，并且對種子細胞尤其是干細胞增殖和分化有重要影響和意義，從而為骨缺損修復奠定基礎。 結論隨著組織工程技術的發展，HIF-1α在應用中存在的有效劑量靶向控釋、促炎和致癌等相關問題將逐步得到解決，以期更好應用于臨床。
細胞膜片技術是通過物理的方法將擴增融合的細胞從培養皿底壁分離,獲得膜片狀細胞結構的一種技術。與傳統胰酶消化收集細胞的方法相比,運用該技術收集到的細胞保留了體外培養過程中分泌的胞外基質、建立的細胞-基質連接以及細胞間連接等結構。本文綜述了細胞膜片技術在構建包括軟組織(角膜、黏膜、心肌、血管、胰島、肝組織、膀胱、皮膚)和硬組織(骨、軟骨、牙根)等組織再生領域的相關應用,以期為組織工程和再生醫學的發展提供新思路,并提出今后可在提高該技術的操作性及構建大塊組織可行性方面進行深入研究。
本研究旨在建立一種更適合軟骨細胞生長的三維培養體系。首先通過酰胺鍵反應將甲基丙烯酸引入海藻酸鹽長鏈形成甲基丙烯酸海藻酸鹽(MA), 然后將MA和混合陽離子Ba2+∶Ca2+=5∶5進行光交聯反應, 形成內部結構為貫通式凝膠網絡(IPN)的凝膠小球(MA凝膠小球)。將P1代軟骨細胞包裹在MA凝膠小球中連續培養三周, 在培養的不同時間點取適量凝膠小球進行倒置顯微鏡觀察, 冰凍切片后HE染色和免疫組化染色, 掃描電鏡觀察第21 d細胞在支架中的情況; 通過Alamar blue法檢測軟骨細胞的增殖情況; 二甲基亞甲蘭法定量檢測糖胺多糖(GAG)的含量。結果顯示MA和混合陽離子Ba2+∶Ca2+=5∶5發生光交聯反應形成的MA凝膠小球, 與對照組藻酸鈣相比, P1代軟骨細胞在MA凝膠小球內增殖更明顯, 細胞外基質GAG的分泌也更多, 掃描電鏡下觀察到軟骨細胞可以良好地黏附在支架中生長, 免疫組化染色呈陽性。以上結果證實軟骨細胞在MA凝膠小球中的增殖和細胞外基質的分泌量優于藻酸鈣組, 并且能維持軟骨細胞的表型, 是一種更好的軟骨細胞三維培養載體。
目的總結細胞膜片技術在構建工程化血管化組織中的應用進展。 方法查閱近年來國內外細胞膜片技術及工程化血管化組織構建的相關研究文獻，進行綜合分析及歸納總結。 結果構建血管化組織方法較多，而細胞膜片技術在構建血管化組織中具有巨大潛力，利用該技術實現工程化組織的預血管化成為近年研究熱點。將內皮細胞與其他細胞形成的細胞膜片復合，內皮細胞能夠在膜片上形成三維血管化網絡結構和微血管空腔，有利于移植組織內功能性血管網的建立。 結論利用細胞膜片技術構建工程化血管化組織，是具有前景的一種策略，目前仍在進一步研究中。
目的探討構建預血管化細胞膜片新方法的可行性。 方法取3周齡日本大耳白兔分離培養BMSCs，并在VEGF和bFGF作用下誘導其向血管內皮樣細胞（endothelial like cells，ECs）分化（實驗組），以未誘導細胞作為對照組，倒置顯微鏡下觀察細胞形貌，并行血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及CD31免疫熒光染色觀察。將第2代BMSCs以9×104個/cm2密度體外培養14 d形成未分化細胞膜片，將BMSCs誘導14 d獲得的ECs以5×104個/cm2密度接種在細胞膜片上（A組）培養3、7、14 d，以單純未分化的兔BMSCs膜片為B組，BMSCs誘導14 d獲得的ECs單獨培養為C組。倒置顯微鏡下觀察血管網絡形成，并行CD31免疫熒光染色及組織學觀察。 結果原代BMSCs呈長梭形；誘導分化后細胞形態發生改變，呈“鋪路石”樣。實驗組vWF及CD31免疫熒光染色均呈陽性，而對照組均呈陰性。A組BMSCs誘導14 d后的ECs接種至未分化的BMSCs膜片上3、7、14 d后，細胞形態發生改變，鏡下可見空泡樣、網狀結構形成；CD31免疫熒光檢測顯示了進行性管腔形成過程；HE染色顯示了微血管管腔的形成。B、C組未觀察到類似改變。 結論BMSCs在合適條件下可誘導形成ECs；將由BMSCs誘導分化形成的ECs接種至未分化BMSCs膜片上，可在體外形成具有血管網絡結構的預血管化膜片，為工程化血管組織構建提供了新方法。
目的探討應用細胞膜片技術構建三維真皮樣組織的新策略。方法取 2～3 周齡新西蘭大白兔骨髓，采用全骨髓貼壁法分離培養兔 BMSCs（rabbit BMSCs，rBMSCs）并傳代，取人皮膚成纖維細胞（human dermal fibroblasts，HDFs）傳代培養。取第 2 代 rBMSCs、第 3 代 HDFs 分別于培養皿采用膜片條件培養基連續培養 2 周，獲得單層細胞膜片。取人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）接種于 rBMSCs 膜片上，構建預血管化膜片。培養期間于倒置相差顯微鏡下觀察膜片上細胞形態變化；共培養 1、3、7、14 d 后取材行 HE 染色、CD31 免疫熒光染色，觀察細胞分布及微血管網絡生成情況，以 rBMSCs 膜片作為對照。分別將培養 7 d 的預血管化膜片（實驗組）及 rBMSCs 膜片（對照組）放于 2 層 HDFs 膜片中間，制備三維真皮樣組織，培養 24 h 后行 CD31 免疫熒光染色及Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組織化學染色，評估細胞分布及膠原表達情況。結果細胞連續培養 2 周后成功制備 HDFs 膜片及 rBMSCs 膜片。HUVECs 接種于 rBMSCs 膜片 3 d 后重新排列，7 d 后形成網狀結構，14 d 后網狀結構更明顯；HE 染色見膜片間有空泡形成，且隨時間延長空泡日趨明顯、膜片厚度顯著增加；CD31 免疫熒光染色可見微血管管腔形成。而 rBMSCs 膜片僅見細胞膜片增厚，未見細胞形態改變、空泡結構形成。三維真皮樣組織觀測顯示，實驗組內皮細胞 CD31 免疫熒光染色呈陽性，rBMSCs、HDFs 及 HUVECs 細胞排列整齊；而對照組染色呈陰性，細胞隨機排列。實驗組和對照組Ⅰ、Ⅲ型膠原均呈陽性表達，與對照組比較，實驗組細胞排列緊密，細胞基質分布規律，呈“蜂巢狀”結構；兩組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達量差異無統計學意義（P>0.05）。結論應用細胞膜片技術可以構建三維真皮樣組織，其中采用 HUVECs 聯合 rBMSCs 膜片構建預血管化膜片后細胞基質分布較規律，具有形成組織工程真皮的潛力。