引用本文： 陳佳, 馬東洋, 任利玲. 細胞膜片技術在構建工程化血管化組織中的應用進?展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(3): 368-371. doi: 10.7507/1002-1892.20150077 復制
組織工程研究為臨床組織缺損的修復提供了新思路和新方法。然而組織工程構建物在體內能夠成活并發揮其功能，必須以血管化為前提，這也是目前組織工程發展和臨床應用的瓶頸之一。近年來，大量研究表明預血管化的方法可實現工程化組織內的血管化。預血管化是指在移植前的工程化組織上進行人工植入體的前瞻性和程序性血管構建，以期解決植入體的營養代謝及功能維持問題。基于細胞膜片技術構建預血管化組織是研究方向之一。本文就細胞膜片技術在構建工程化血管化組織中的應用綜述如下。
1 預血管化策略
缺乏與宿主相連的功能性微血管系統是組織工程植入體移植失敗的關鍵問題，也是目前公認的組織工程研究的重大挑戰[1-2]。有研究表明[3]，將利用組織工程方法獲得的細胞-載體復合物在體外進行培養，很難獲得厚度超過7 mm的組織，而植入體內的種子細胞只有在血管周圍150～200 μm范圍內才能通過營養彌散得以成活，如果不能快速建立血運循環，則難以構建大的有效的器官。
為加速工程化組織內功能性血管網的建立，學者們創建了許多血管化策略，包括添加促血管形成生長因子、顯微外科技術、生物反應器系統、細胞共培養技術、支架材料的應用與修飾等，均在一定程度上解決了組織構建時的血管化問題。但所形成的血管結構往往不穩定，易發生退化[4]。因而現階段研究的焦點集中在如何構建穩定的新生血管系統，促進可長期存在的血管形成。周細胞和平滑肌細胞有利于原始血管網的穩定和成熟，因而是構建持久組織工程血管的基礎因素。
研究發現，在三維條件下將內皮細胞與其他類型細胞共培養，體外獲得毛細血管網[5-7]，植入體內后這些預先形成的毛細血管網能夠與宿主血管吻合，從而保證了移植細胞的活性[5, 8-9]。這種預血管化工程化組織的方法已逐漸受到學者們的關注。
但是，目前常用的細胞共培養方式主要有兩種：① 將不同類型細胞種植于三維多孔可降解支架材料上，以利于種子細胞附著、生長、增殖并形成正常組織，最終新生組織將取代逐漸降解的支架材料[10]。由于缺乏真正的細胞外基質，細胞利用率較低、附著效率差；同時，細胞在支架材料上分布不均勻，細胞-細胞間接觸及相互作用少，難以形成體內細胞應有的微環境；此外，常用的胰蛋白酶消化收集細胞的方法會改變細胞的表型、生化成分，進而影響細胞活性，培養過程中細胞分泌的細胞外基質以及形成的細胞間連接蛋白也會被破壞[11]。② 采用三維細胞聚集體共培養方式[12-13]，盡管也形成了毛細血管網，但細胞聚集體不具有賦形性，不能很好地構建具有一定尺寸的組織。基于上述構建策略中存在的問題，有學者開始嘗試應用細胞膜片技術構建預血管化組織。
細胞膜片技術，即采用一種特制的溫敏性培養皿培養細胞，細胞擴增融合后將局部溫度降低，皿底形成水化層，使細胞呈膜片狀結構分離[14]。與傳統胰蛋白酶消化收集細胞方法相比，該技術優點是避免了胰蛋白酶消化細胞的有創處理過程，保留了細胞在體外培養過程中自分泌的細胞外基質、細胞-基質連接、細胞-細胞連接，以及一些重要的細胞表面蛋白（如離子通道、生長因子受體）等結構。這些重要結構不僅對維持細胞表型及功能具有重要意義，同時也提高了細胞利用率。
2 細胞膜片技術在構建工程化血管化組織中的應用
2.1 細胞膜片技術在軟組織中的應用
細胞膜片技術已成功用于構建組織工程黏膜[15]、牙周組織[16]、心肌[17]等多種細胞、血管密集型軟組織。Miyahara等[18]通過結扎大鼠冠狀動脈制備心肌梗死模型，4周后將未分化的單層脂肪干細胞膜片植入缺血瘢痕化心肌區，術后發現移植膜片逐漸發育成由新生血管、未分化細胞和少量心肌細胞構成的一厚層組織，逆轉了瘢痕區變薄的心肌壁，使心臟功能得到顯著提高；同時還證實植入的干細胞膜片通過旁分泌途徑激發了血管發生。亦有學者[8-9]發現與內皮細胞共培養的心肌細胞膜片體外形成了內皮血管網，體內移植后發生了新生血管化，且新生血管來源于移植組織，并與宿主的脈管系統相通。趙潔[19]以直徑2 mm的聚四氟乙烯管作為支撐體，將BMSCs膜片纏繞其上，動態培養1周后，構建了小口徑血管移植物，將其與體內動脈血管連接后顯示，體外構建的血管移植物在體內能夠保持通暢長達4周，并在體內機械環境作用下，內部結構發生改建，移植物內壁完全內皮化，形成類似天然動脈血管的膠原纖維與彈性纖維的層狀結構。
Ohashi等[20]將雙層肝細胞膜片重疊復合，植入裸鼠皮下間隙內，形成了類似三維結構的肝組織塊。檢測結果表明新生肝組織形態穩定，功能明顯優于由單層膜片構建的肝組織，同時在新生組織中發現了大量血管。可見細胞膜片為宿主血管能夠長入移植組織提供了適宜環境。
2010年Asakawa等[21]的研究表明，以細胞膜片為基礎的共培養體系有利于工程化組織在體外形成內皮血管網絡。他們將人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、人真皮成纖維細胞以及二者混合共培養所形成的細胞膜片以不同形式和順序堆疊形成3層結構，發現在所有3層結構中均能形成血管化網絡，與原生微脈管系統一致。同年，Sasagawa等[22]利用細胞膜片技術成功構建血管化肌組織。他們將HUVECs種植于成肌細胞膜片上，發現植入的HUVECs在體外發芽并形成網狀結構；進一步將復合了內皮細胞的成肌細胞膜片組合形成“三明治”結構，結果發現內皮細胞在各層之間連接并形成了毛細血管網狀結構，同時將其植入體內，觀察發現新生血管網與宿主血管吻合形成了功能性的血管網。
2.2 細胞膜片技術在硬組織中的應用
利用細胞膜片技術構建工程化軟組織已得到了廣泛應用，越來越多研究開始關注于應用細胞膜片技術構建工程化血管化硬組織。2007年，新加坡國立大學 Zhou等[23]首次報道將細胞膜片與外源性支架材料復合構建組織工程骨。他們用成骨誘導分化的BMSCs膜片包裹塊狀磷酸三鈣-聚已酸內酯復合物材料，分別于復合后即刻和體外培養8周時植入裸鼠背部皮下組織，結果表明兩組均有皮質骨和血管化良好的松質骨形成，且新生組織塊的抗壓強度明顯高于未與膜片復合的對照組。說明利用細胞膜片技術與外源性支架結合能夠構建組織工程骨。此后，眾多學者通過不同的骨支架材料與細胞膜片復合也證實了這一結論[24-25]。進一步利用細胞膜片與支架復合體修復骨缺損的研究表明[26]，構建的組織工程骨可有效修復骨缺損；同時發現，當細胞膜片與支架材料復合并體內移植數周后，在支架材料外周也形成了礦化度較高的骨組織，并在材料內部也可見相當數量的骨小梁。表明作為細胞釋放載體系統，細胞膜片可賦予無機材料生物活性。
但由于支架材料本身的局限性，也有學者嘗試單純應用細胞膜片來構建組織工程骨。2008年，Syed-Picard等[27]利用成骨分化的BMSCs膜片首次構建出無外源性支架材料的圓柱狀骨樣組織，體內移植7 d后發現該骨組織進一步成熟且有血管形成，并證實構建的小體積組織在體內主要通過膜內成骨方式成骨。Ma等[28]研究表明，BMSCs膜片在體內具有良好的成骨能力，無需外源性支架即可用于構建較大體積的組織工程骨。他們將培養2周的3層成骨分化的BMSCs膜片折疊卷曲，形成直徑8 mm、高14 mm的圓柱狀組織，將其移植至裸鼠背部皮下。螺旋CT掃描及組織學檢測均顯示有新骨形成，同時發現形成的骨組織抗壓強度明顯增強，有望用于大體積組織工程骨構建。此外，Ma等[29]通過將裁剪BMSCs膜片獲取的膜片片段注射入兔下頜骨牽張間隙處，也有效促進了牽張區的成骨，為可注射骨的研究提供了新策略。但上述基于細胞膜片技術所構建的組織工程骨，由于缺乏足夠的營養供應，組織內部的成骨仍較外周少[26, 30]。為進一步構建血管化充足的組織工程骨，任利玲等[31]將HUVECs接種于未分化的BMSCs膜片上，內皮細胞迅速重組，能夠在體外形成大量血管化網絡結構和微血管空腔；進一步將預血管化膜片與成骨分化的細胞膜片復合，構建生物仿生的誘導性膜，異位移植實驗結果表明體外獲得的血管網能夠與宿主血管快速吻合形成功能性血管網，同時表現出良好的成骨特性[32]。此外，他們將復合的膜片作為仿生骨膜包裹羥基磷灰石支架材料，體外培養14 d后，掃描電鏡檢測發現大量細胞遷移至支架中心區，異位移植實驗也顯示了其成骨能力顯著優于無內皮細胞組[33]；提示預血管化膜片的方式有望解決組織工程骨的血管化問題。Mendes等[34]亦證實基于人BMSCs的研究，膜片和HUVECs復合構建的預血管化組織體內移植后具有成骨和成血管特性。Zhang等[35]將成骨誘導的BMSCs膜片復合內皮祖細胞 （endothelial progenitor cells，EPCs），折疊、卷曲成圓柱狀復合體，異位移植于裸鼠背部皮下，4周和8周后均形成外觀色紅、質硬的血管化骨樣組織；CT、掃描電鏡及組織學檢測均證實有新骨形成，而且所形成的組織骨密度和血管密度均高于無內皮細胞對照組。說明利用BMSCs膜片復合EPCs構建較大體積的無外支架血管化組織工程骨是可行的。上述研究均說明基于細胞膜片技術構建的預血管化骨組織有望修復大段骨缺損。
3 展望
應用細胞膜片技術構建工程化血管化組織，是一種具有巨大潛力的組織工程血管化新策略。此策略目前已廣泛應用于構建各種血管化組織，以再生修復受損組織。然而，隨著細胞膜片技術的發展也顯示出了一些需解決的問題。例如，內皮細胞與其他類型細胞共培養體系的培養基選擇，體外預血管化的進程、規律和血管分布情況，以及信號通路等。同時，細胞膜片機械強度較差也限制了其在臨床的應用，這一問題也有待深入研究。
組織工程研究為臨床組織缺損的修復提供了新思路和新方法。然而組織工程構建物在體內能夠成活并發揮其功能，必須以血管化為前提，這也是目前組織工程發展和臨床應用的瓶頸之一。近年來，大量研究表明預血管化的方法可實現工程化組織內的血管化。預血管化是指在移植前的工程化組織上進行人工植入體的前瞻性和程序性血管構建，以期解決植入體的營養代謝及功能維持問題。基于細胞膜片技術構建預血管化組織是研究方向之一。本文就細胞膜片技術在構建工程化血管化組織中的應用綜述如下。
1 預血管化策略
缺乏與宿主相連的功能性微血管系統是組織工程植入體移植失敗的關鍵問題，也是目前公認的組織工程研究的重大挑戰[1-2]。有研究表明[3]，將利用組織工程方法獲得的細胞-載體復合物在體外進行培養，很難獲得厚度超過7 mm的組織，而植入體內的種子細胞只有在血管周圍150～200 μm范圍內才能通過營養彌散得以成活，如果不能快速建立血運循環，則難以構建大的有效的器官。
為加速工程化組織內功能性血管網的建立，學者們創建了許多血管化策略，包括添加促血管形成生長因子、顯微外科技術、生物反應器系統、細胞共培養技術、支架材料的應用與修飾等，均在一定程度上解決了組織構建時的血管化問題。但所形成的血管結構往往不穩定，易發生退化[4]。因而現階段研究的焦點集中在如何構建穩定的新生血管系統，促進可長期存在的血管形成。周細胞和平滑肌細胞有利于原始血管網的穩定和成熟，因而是構建持久組織工程血管的基礎因素。
研究發現，在三維條件下將內皮細胞與其他類型細胞共培養，體外獲得毛細血管網[5-7]，植入體內后這些預先形成的毛細血管網能夠與宿主血管吻合，從而保證了移植細胞的活性[5, 8-9]。這種預血管化工程化組織的方法已逐漸受到學者們的關注。
但是，目前常用的細胞共培養方式主要有兩種：① 將不同類型細胞種植于三維多孔可降解支架材料上，以利于種子細胞附著、生長、增殖并形成正常組織，最終新生組織將取代逐漸降解的支架材料[10]。由于缺乏真正的細胞外基質，細胞利用率較低、附著效率差；同時，細胞在支架材料上分布不均勻，細胞-細胞間接觸及相互作用少，難以形成體內細胞應有的微環境；此外，常用的胰蛋白酶消化收集細胞的方法會改變細胞的表型、生化成分，進而影響細胞活性，培養過程中細胞分泌的細胞外基質以及形成的細胞間連接蛋白也會被破壞[11]。② 采用三維細胞聚集體共培養方式[12-13]，盡管也形成了毛細血管網，但細胞聚集體不具有賦形性，不能很好地構建具有一定尺寸的組織。基于上述構建策略中存在的問題，有學者開始嘗試應用細胞膜片技術構建預血管化組織。
細胞膜片技術，即采用一種特制的溫敏性培養皿培養細胞，細胞擴增融合后將局部溫度降低，皿底形成水化層，使細胞呈膜片狀結構分離[14]。與傳統胰蛋白酶消化收集細胞方法相比，該技術優點是避免了胰蛋白酶消化細胞的有創處理過程，保留了細胞在體外培養過程中自分泌的細胞外基質、細胞-基質連接、細胞-細胞連接，以及一些重要的細胞表面蛋白（如離子通道、生長因子受體）等結構。這些重要結構不僅對維持細胞表型及功能具有重要意義，同時也提高了細胞利用率。
2 細胞膜片技術在構建工程化血管化組織中的應用
2.1 細胞膜片技術在軟組織中的應用
細胞膜片技術已成功用于構建組織工程黏膜[15]、牙周組織[16]、心肌[17]等多種細胞、血管密集型軟組織。Miyahara等[18]通過結扎大鼠冠狀動脈制備心肌梗死模型，4周后將未分化的單層脂肪干細胞膜片植入缺血瘢痕化心肌區，術后發現移植膜片逐漸發育成由新生血管、未分化細胞和少量心肌細胞構成的一厚層組織，逆轉了瘢痕區變薄的心肌壁，使心臟功能得到顯著提高；同時還證實植入的干細胞膜片通過旁分泌途徑激發了血管發生。亦有學者[8-9]發現與內皮細胞共培養的心肌細胞膜片體外形成了內皮血管網，體內移植后發生了新生血管化，且新生血管來源于移植組織，并與宿主的脈管系統相通。趙潔[19]以直徑2 mm的聚四氟乙烯管作為支撐體，將BMSCs膜片纏繞其上，動態培養1周后，構建了小口徑血管移植物，將其與體內動脈血管連接后顯示，體外構建的血管移植物在體內能夠保持通暢長達4周，并在體內機械環境作用下，內部結構發生改建，移植物內壁完全內皮化，形成類似天然動脈血管的膠原纖維與彈性纖維的層狀結構。
Ohashi等[20]將雙層肝細胞膜片重疊復合，植入裸鼠皮下間隙內，形成了類似三維結構的肝組織塊。檢測結果表明新生肝組織形態穩定，功能明顯優于由單層膜片構建的肝組織，同時在新生組織中發現了大量血管。可見細胞膜片為宿主血管能夠長入移植組織提供了適宜環境。
2010年Asakawa等[21]的研究表明，以細胞膜片為基礎的共培養體系有利于工程化組織在體外形成內皮血管網絡。他們將人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、人真皮成纖維細胞以及二者混合共培養所形成的細胞膜片以不同形式和順序堆疊形成3層結構，發現在所有3層結構中均能形成血管化網絡，與原生微脈管系統一致。同年，Sasagawa等[22]利用細胞膜片技術成功構建血管化肌組織。他們將HUVECs種植于成肌細胞膜片上，發現植入的HUVECs在體外發芽并形成網狀結構；進一步將復合了內皮細胞的成肌細胞膜片組合形成“三明治”結構，結果發現內皮細胞在各層之間連接并形成了毛細血管網狀結構，同時將其植入體內，觀察發現新生血管網與宿主血管吻合形成了功能性的血管網。
2.2 細胞膜片技術在硬組織中的應用
利用細胞膜片技術構建工程化軟組織已得到了廣泛應用，越來越多研究開始關注于應用細胞膜片技術構建工程化血管化硬組織。2007年，新加坡國立大學 Zhou等[23]首次報道將細胞膜片與外源性支架材料復合構建組織工程骨。他們用成骨誘導分化的BMSCs膜片包裹塊狀磷酸三鈣-聚已酸內酯復合物材料，分別于復合后即刻和體外培養8周時植入裸鼠背部皮下組織，結果表明兩組均有皮質骨和血管化良好的松質骨形成，且新生組織塊的抗壓強度明顯高于未與膜片復合的對照組。說明利用細胞膜片技術與外源性支架結合能夠構建組織工程骨。此后，眾多學者通過不同的骨支架材料與細胞膜片復合也證實了這一結論[24-25]。進一步利用細胞膜片與支架復合體修復骨缺損的研究表明[26]，構建的組織工程骨可有效修復骨缺損；同時發現，當細胞膜片與支架材料復合并體內移植數周后，在支架材料外周也形成了礦化度較高的骨組織，并在材料內部也可見相當數量的骨小梁。表明作為細胞釋放載體系統，細胞膜片可賦予無機材料生物活性。
但由于支架材料本身的局限性，也有學者嘗試單純應用細胞膜片來構建組織工程骨。2008年，Syed-Picard等[27]利用成骨分化的BMSCs膜片首次構建出無外源性支架材料的圓柱狀骨樣組織，體內移植7 d后發現該骨組織進一步成熟且有血管形成，并證實構建的小體積組織在體內主要通過膜內成骨方式成骨。Ma等[28]研究表明，BMSCs膜片在體內具有良好的成骨能力，無需外源性支架即可用于構建較大體積的組織工程骨。他們將培養2周的3層成骨分化的BMSCs膜片折疊卷曲，形成直徑8 mm、高14 mm的圓柱狀組織，將其移植至裸鼠背部皮下。螺旋CT掃描及組織學檢測均顯示有新骨形成，同時發現形成的骨組織抗壓強度明顯增強，有望用于大體積組織工程骨構建。此外，Ma等[29]通過將裁剪BMSCs膜片獲取的膜片片段注射入兔下頜骨牽張間隙處，也有效促進了牽張區的成骨，為可注射骨的研究提供了新策略。但上述基于細胞膜片技術所構建的組織工程骨，由于缺乏足夠的營養供應，組織內部的成骨仍較外周少[26, 30]。為進一步構建血管化充足的組織工程骨，任利玲等[31]將HUVECs接種于未分化的BMSCs膜片上，內皮細胞迅速重組，能夠在體外形成大量血管化網絡結構和微血管空腔；進一步將預血管化膜片與成骨分化的細胞膜片復合，構建生物仿生的誘導性膜，異位移植實驗結果表明體外獲得的血管網能夠與宿主血管快速吻合形成功能性血管網，同時表現出良好的成骨特性[32]。此外，他們將復合的膜片作為仿生骨膜包裹羥基磷灰石支架材料，體外培養14 d后，掃描電鏡檢測發現大量細胞遷移至支架中心區，異位移植實驗也顯示了其成骨能力顯著優于無內皮細胞組[33]；提示預血管化膜片的方式有望解決組織工程骨的血管化問題。Mendes等[34]亦證實基于人BMSCs的研究，膜片和HUVECs復合構建的預血管化組織體內移植后具有成骨和成血管特性。Zhang等[35]將成骨誘導的BMSCs膜片復合內皮祖細胞 （endothelial progenitor cells，EPCs），折疊、卷曲成圓柱狀復合體，異位移植于裸鼠背部皮下，4周和8周后均形成外觀色紅、質硬的血管化骨樣組織；CT、掃描電鏡及組織學檢測均證實有新骨形成，而且所形成的組織骨密度和血管密度均高于無內皮細胞對照組。說明利用BMSCs膜片復合EPCs構建較大體積的無外支架血管化組織工程骨是可行的。上述研究均說明基于細胞膜片技術構建的預血管化骨組織有望修復大段骨缺損。
3 展望
應用細胞膜片技術構建工程化血管化組織，是一種具有巨大潛力的組織工程血管化新策略。此策略目前已廣泛應用于構建各種血管化組織，以再生修復受損組織。然而，隨著細胞膜片技術的發展也顯示出了一些需解決的問題。例如，內皮細胞與其他類型細胞共培養體系的培養基選擇，體外預血管化的進程、規律和血管分布情況，以及信號通路等。同時，細胞膜片機械強度較差也限制了其在臨床的應用，這一問題也有待深入研究。