引用本文： 陳以勝, 王景景, 陳旭義, 陳翀, 涂悅, 張賽, 李曉紅. 3D打印技術制備大鼠脊髓仿生支架的研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(3): 364-367. doi: 10.7507/1002-1892.20150076 復制
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）因致殘率高、恢復困難，越來越被人們關注[1]。支架聯合干細胞移植治療SCI是近年研究熱點，其中支架為細胞生長及組織重建提供了類似于細胞外基質的三維生長環境[2]。目前已有相關的動物研究報道[3]，但仍存在安全性及有效性等問題，因此對支架材料及其設計方面提出了更高的要求。
既往研究中脊髓支架多設計為直徑2～4 mm、長約5 mm的圓柱體，支架內部有大量平行的圓柱狀通道，以利神經軸突的生長連接以及脊髓兩斷端的橋接[4]。但這種單純圓柱形脊髓支架不能很好地與正常脊髓結構相契合。此外，大多數脊髓支架均由合成的高分子材料注塑制作而成[5]，制作工藝較繁瑣。本研究通過應用MRI及SolidWorks三維制圖軟件，針對脊髓外形及其內部神經傳導束結構設計脊髓三維模型，通過3D打印機制作脊髓仿生支架，為支架聯合干細胞治療SCI奠定基礎。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
成年雌性SD大鼠3只，體質量（250±10） g，由軍事醫學科學院提供。光敏樹脂材料（EJ-1680LS，上海穎天化工科技有限公司）。7.0T動物專用核磁共振儀（Bruker公司，德國）；3D打印機（杭州捷諾飛生物科技有限公司）；Getdata數據獲取軟件、Solid Works2010版三維制圖軟件（Dassault Systemes公司，法國）。
1.2 大鼠脊髓MRI掃描
取3只大鼠，經腹腔注射5%水合氯醛（6 mL/ kg）麻醉后，仰臥固定于MRI平臺上。以7.0T動物專用核磁共振儀，采用快速自旋回波序列對全脊柱序列進行定位掃描，獲得質子密度加權成像。掃描參數[6]：重復時間（repetition time，TR）3 050 ms，回波時間（echo time，TE）11 ms，矩陣320×320，翻轉角度149°，層厚0.5 mm，層間距0.5 mm；動脈增強掃描參數為TR 2 000 ms、TE 30 ms，視野128 mm×128 mm，翻轉角度90°，層厚0.5 mm。脊髓修復動物實驗通常選取T8～10節段，故掃描后每只大鼠取10個對應節段脊髓截面，采用Image J軟件測量脊髓橫徑和縱徑。
1.3 支架三維模型構建
正常脊髓根據其橫徑、縱徑測量結果，在Solid Works三維制圖軟件中按比例直接繪制脊髓截面輪廓。模擬SCI，應用Getdata數據獲取軟件獲取脊髓缺損部分截面數據：首先在軟件中打開脊髓橫截面MRI圖像，平行于脊髓橫徑、縱徑建立X、Y軸坐標系，圍繞脊髓損傷邊緣進行多點數據獲取，將獲得的數據導出并保存為TXT格式文件。根據脊髓內部神經傳導束分布情況[7]，同上法獲得各神經傳導束部位、形態相關數據。由于大鼠脊髓較細，神經傳導束結構復雜，3D打印制作有一定困難，因此在前期研究[7]基礎上，將神經傳導束結構進行簡化，將鄰近的神經傳導束融合成一束。由于脊髓近似為橢圓形，為了達到仿生目的，根據X、Y坐標值將神經傳導束相關數據按脊髓截面橫徑與縱徑比例進行縮放處理，并以TXT格式保存。
將上述TXT格式數據導入SolidWorks三維制圖軟件中，自動生成代表形態和矢量位置的曲線，通過拉伸凸臺和拉伸切除等特征性操作，繪制正常以及模擬SCI的脊髓支架三維模型，設置模型橫徑為2.05 mm，縱徑為2.20 mm，長度為3 mm，最后將模型保存為3D打印機所匹配的立體平版印刷（stereolithography，STL）格式文件[8-9]。
1.4 3D打印支架
將STL格式文件導入3D打印機，系統軟件自動將其轉換為打印路徑，形成目標支架模型的外形，并細化為數層，每層各生成一個填充路徑并依次疊加，在保證長寬比的同時可以改變圖形比例來覆蓋整個打印區域[10]。打印機的打印頭端包含3個線性壓縮設備，連接特定的注射器針管以及最下端的可更換的打印針頭，選取內徑為210 μm的針頭，在X、Y軸上的精確度達到10 μm。將光敏樹脂材料裝入注射器中，排空氣泡。設置打印速度5 mm/s、材料擠出速度0.09 mm/ min。系統復位及針頭高度校對完畢后，打印針頭沿X、Y軸矢量坐標路徑進行打印，完成一層打印后，打印平臺在Z軸上相對升高，然后繼續打印，直至達目標長度[11]。打印出的支架三維模型在250～ 300 nm紫外光照射下發生聚合反應，并固化成型。
2 結果
2.1 MRI掃描觀測
MRI顯示，正常大鼠脊髓位于椎體和椎弓之間，脊髓總體呈高信號，T8～10節段脊髓截面呈縱軸較長、橫軸相對較短的橢圓形，外周環形稍高信號影提示腦脊液，中間蝴蝶形稍高信號影提示脊髓灰質。T8～10節段脊髓橫徑為（2.05±0.24）mm，縱徑為（2.20±0.52）mm。見圖 1。
圖1
MRI示大鼠脊髓紅色箭頭示T8椎體藍色箭頭示脊髓黃色線條為脊髓橫徑紅色線條為脊髓縱徑? ?圖 2 脊髓各神經傳導束形態、位置和大小? ?圖 3 正常大鼠脊髓支架三維模型圖 ? 脊髓神經傳導束結構圖[7] 1：脊髓小腦束 2：楔束 3：薄束 4：皮質脊髓束 5：脊髓丘腦束 6：紅核脊髓束 7：腦橋網狀脊髓束 8：皮質脊髓前束 9：前庭脊髓束 10：延髓網狀脊髓束 ? 應用SolidWorks三維制圖軟件簡化、整合處理后的脊髓支架三維模型? ?圖 4 SCI大鼠脊髓支架三維模型圖? ?圖 5 3D打印制備的正常大鼠脊髓支架
Figure1.
The MRI of rat spinal cord Red arrow indicated T8 vertebrae Blue arrow indicated spinal cord Yellow line indicated transverse diameter of spinal cord Red line indicated sagittal diameter of spinal cord? ? Fig. 2 The shape,location,and size of the nerve conduction bundle of the spinal cord? ? Fig. 3 The 3D model of normal rat spinal cord scaffold ? Nerve conduction bundle of spinal cord[7] 1: Spinocerebellar tract 2: Fasciculus cuneatus 3: Fasciculus gracilis 4: Corticospinal tract 5: Spinothalamic tract 6: Rubrospinal tract 7: Pontine reticulospinal tract 8: Anterior corticospinal tract 9: Vestibulospinal tract 10: Medullary reticulospinal tract ? Model of normal rat spinal cord scaffold which was simplified and integrated by SolidWorks software? ? Fig. 4 The 3D model of spinal cord scaffold in SCI rats? ? Fig. 5 Normal rat spinal cord scaffold made by 3D printer
2.2 支架三維模型構建
結合脊髓神經傳導束模型，應用Getdata數據獲取軟件得到相關數據（圖 2），應用SolidWorks三維制圖軟件設計大鼠脊髓支架三維模型，并保存為STL文件。正常脊髓支架三維模型圖顯示，模型內部含有多個平行于縱軸的通道，可清晰顯示神經傳導束位置和形狀數據（圖 3）。利用MRI和Getdata數據獲取軟件可獲得SCI大鼠的脊髓損傷處數據，結合SolidWorks三維制圖軟件設計SCI大鼠脊髓支架三維模型（圖 4）。
2.3 3D打印支架
應用3D打印機成功制備正常脊髓支架（圖 5），支架內平行于縱軸為若干形狀不一的孔道，模擬神經傳導束通道。該脊髓支架形態、截面與大鼠正常脊髓相似，其中各神經傳導束孔隙位置模擬了大鼠脊髓正常神經傳導束走行。
3 討論
既往SCI動物研究中，一般制備T8～10節段脊髓全橫斷或半橫斷損傷，然后將預先制備的脊髓支架材料植入損傷處并觀察療效，這種脊髓損傷模型一般較規則[12]。但是臨床上外傷引起的脊髓損傷形態各異，因此是否需要將損傷脊髓進行規則化處理或將尚未完全離斷的脊髓先行離斷，然后再植入規則的脊髓支架修復，仍存在爭議。多數臨床醫師認為通過手術修整損傷處脊髓會加劇病情。除此之外，目前用于研究的脊髓支架結構比較單一，外形和神經傳導通道不能模擬正常動物脊髓結構。因此制作脊髓仿生支架是一重要研究方向。
3D打印是應用層層相疊的打印技術來制作三維材料，通過電腦輔助設計和電腦輔助制作來實現快速成型打印，構建復雜組織結構[13]。目前已有研究采用3D打印技術成功制備膝關節半月板、血管、肝臟等三維模型，并已用于臨床，充分體現了3D打印技術在實現人體組織器官再生方面的的潛力[14-15]。
本研究通過將影像學技術、三維制圖軟件和3D打印技術相結合，在一定程度上解決了既往脊髓支架的不足，其設計的脊髓仿生支架具有以下優點：① MRI成像技術能更精確地獲取正常脊髓外部形狀和大小數據，對脊髓橫徑和縱徑的比例具有更嚴格設定，根據以上數據獲得的支架不是單純的圓柱形，故在植入脊髓支架時可以辨別脊髓方位，精確地與脊髓兩斷端相吻合，與既往研究制備的內部含有幾個規則通道的圓柱形支架[16]相比，具有更大優勢。② 該仿生支架以脊髓神經傳導束結構為基礎，在內部設計了一系列平行排列的通道，為兩斷端的脊髓神經傳導束提供了延伸空間，其中各神經傳導束孔隙位置模擬了大鼠脊髓正常神經傳導束走行，有利于移植細胞突起的延伸和兩斷端神經傳導束的連接。③ 由于脊髓損傷部位節段不一、形態各異，且大部分脊髓僅部分受損而未完全離斷，通過本研究方法可以設計出與損傷形狀相似的脊髓三維模型，并經3D打印制備目標脊髓支架。在保留未完全離斷的脊髓同時，也解決了不規則脊髓損傷的支架移植問題。
但本研究采用光敏樹脂進行模型制備，該材料因不可生物降解，不宜用于實驗研究。近年來對于可生物降解的合成材料研究較多，比如膠原蛋白[17]、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[18]等，這些材料在動物的中樞神經系統修復作用已得到證實，下一步可以將這些生物材料結合3D打印技術進行脊髓支架的制作。除了促進神經傳導束的縱向延伸、連接外，脊神經的橫向生長在脊髓神經功能恢復方面也具有重要意義[19-20]，因此脊髓支架設計時還需要關注側壁開孔。以上問題均有待進一步研究。
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）因致殘率高、恢復困難，越來越被人們關注[1]。支架聯合干細胞移植治療SCI是近年研究熱點，其中支架為細胞生長及組織重建提供了類似于細胞外基質的三維生長環境[2]。目前已有相關的動物研究報道[3]，但仍存在安全性及有效性等問題，因此對支架材料及其設計方面提出了更高的要求。
既往研究中脊髓支架多設計為直徑2～4 mm、長約5 mm的圓柱體，支架內部有大量平行的圓柱狀通道，以利神經軸突的生長連接以及脊髓兩斷端的橋接[4]。但這種單純圓柱形脊髓支架不能很好地與正常脊髓結構相契合。此外，大多數脊髓支架均由合成的高分子材料注塑制作而成[5]，制作工藝較繁瑣。本研究通過應用MRI及SolidWorks三維制圖軟件，針對脊髓外形及其內部神經傳導束結構設計脊髓三維模型，通過3D打印機制作脊髓仿生支架，為支架聯合干細胞治療SCI奠定基礎。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
成年雌性SD大鼠3只，體質量（250±10） g，由軍事醫學科學院提供。光敏樹脂材料（EJ-1680LS，上海穎天化工科技有限公司）。7.0T動物專用核磁共振儀（Bruker公司，德國）；3D打印機（杭州捷諾飛生物科技有限公司）；Getdata數據獲取軟件、Solid Works2010版三維制圖軟件（Dassault Systemes公司，法國）。
1.2 大鼠脊髓MRI掃描
取3只大鼠，經腹腔注射5%水合氯醛（6 mL/ kg）麻醉后，仰臥固定于MRI平臺上。以7.0T動物專用核磁共振儀，采用快速自旋回波序列對全脊柱序列進行定位掃描，獲得質子密度加權成像。掃描參數[6]：重復時間（repetition time，TR）3 050 ms，回波時間（echo time，TE）11 ms，矩陣320×320，翻轉角度149°，層厚0.5 mm，層間距0.5 mm；動脈增強掃描參數為TR 2 000 ms、TE 30 ms，視野128 mm×128 mm，翻轉角度90°，層厚0.5 mm。脊髓修復動物實驗通常選取T8～10節段，故掃描后每只大鼠取10個對應節段脊髓截面，采用Image J軟件測量脊髓橫徑和縱徑。
1.3 支架三維模型構建
正常脊髓根據其橫徑、縱徑測量結果，在Solid Works三維制圖軟件中按比例直接繪制脊髓截面輪廓。模擬SCI，應用Getdata數據獲取軟件獲取脊髓缺損部分截面數據：首先在軟件中打開脊髓橫截面MRI圖像，平行于脊髓橫徑、縱徑建立X、Y軸坐標系，圍繞脊髓損傷邊緣進行多點數據獲取，將獲得的數據導出并保存為TXT格式文件。根據脊髓內部神經傳導束分布情況[7]，同上法獲得各神經傳導束部位、形態相關數據。由于大鼠脊髓較細，神經傳導束結構復雜，3D打印制作有一定困難，因此在前期研究[7]基礎上，將神經傳導束結構進行簡化，將鄰近的神經傳導束融合成一束。由于脊髓近似為橢圓形，為了達到仿生目的，根據X、Y坐標值將神經傳導束相關數據按脊髓截面橫徑與縱徑比例進行縮放處理，并以TXT格式保存。
將上述TXT格式數據導入SolidWorks三維制圖軟件中，自動生成代表形態和矢量位置的曲線，通過拉伸凸臺和拉伸切除等特征性操作，繪制正常以及模擬SCI的脊髓支架三維模型，設置模型橫徑為2.05 mm，縱徑為2.20 mm，長度為3 mm，最后將模型保存為3D打印機所匹配的立體平版印刷（stereolithography，STL）格式文件[8-9]。
1.4 3D打印支架
將STL格式文件導入3D打印機，系統軟件自動將其轉換為打印路徑，形成目標支架模型的外形，并細化為數層，每層各生成一個填充路徑并依次疊加，在保證長寬比的同時可以改變圖形比例來覆蓋整個打印區域[10]。打印機的打印頭端包含3個線性壓縮設備，連接特定的注射器針管以及最下端的可更換的打印針頭，選取內徑為210 μm的針頭，在X、Y軸上的精確度達到10 μm。將光敏樹脂材料裝入注射器中，排空氣泡。設置打印速度5 mm/s、材料擠出速度0.09 mm/ min。系統復位及針頭高度校對完畢后，打印針頭沿X、Y軸矢量坐標路徑進行打印，完成一層打印后，打印平臺在Z軸上相對升高，然后繼續打印，直至達目標長度[11]。打印出的支架三維模型在250～ 300 nm紫外光照射下發生聚合反應，并固化成型。
2 結果
2.1 MRI掃描觀測
MRI顯示，正常大鼠脊髓位于椎體和椎弓之間，脊髓總體呈高信號，T8～10節段脊髓截面呈縱軸較長、橫軸相對較短的橢圓形，外周環形稍高信號影提示腦脊液，中間蝴蝶形稍高信號影提示脊髓灰質。T8～10節段脊髓橫徑為（2.05±0.24）mm，縱徑為（2.20±0.52）mm。見圖 1。
圖1
MRI示大鼠脊髓紅色箭頭示T8椎體藍色箭頭示脊髓黃色線條為脊髓橫徑紅色線條為脊髓縱徑? ?圖 2 脊髓各神經傳導束形態、位置和大小? ?圖 3 正常大鼠脊髓支架三維模型圖 ? 脊髓神經傳導束結構圖[7] 1：脊髓小腦束 2：楔束 3：薄束 4：皮質脊髓束 5：脊髓丘腦束 6：紅核脊髓束 7：腦橋網狀脊髓束 8：皮質脊髓前束 9：前庭脊髓束 10：延髓網狀脊髓束 ? 應用SolidWorks三維制圖軟件簡化、整合處理后的脊髓支架三維模型? ?圖 4 SCI大鼠脊髓支架三維模型圖? ?圖 5 3D打印制備的正常大鼠脊髓支架
Figure1.
The MRI of rat spinal cord Red arrow indicated T8 vertebrae Blue arrow indicated spinal cord Yellow line indicated transverse diameter of spinal cord Red line indicated sagittal diameter of spinal cord? ? Fig. 2 The shape,location,and size of the nerve conduction bundle of the spinal cord? ? Fig. 3 The 3D model of normal rat spinal cord scaffold ? Nerve conduction bundle of spinal cord[7] 1: Spinocerebellar tract 2: Fasciculus cuneatus 3: Fasciculus gracilis 4: Corticospinal tract 5: Spinothalamic tract 6: Rubrospinal tract 7: Pontine reticulospinal tract 8: Anterior corticospinal tract 9: Vestibulospinal tract 10: Medullary reticulospinal tract ? Model of normal rat spinal cord scaffold which was simplified and integrated by SolidWorks software? ? Fig. 4 The 3D model of spinal cord scaffold in SCI rats? ? Fig. 5 Normal rat spinal cord scaffold made by 3D printer
2.2 支架三維模型構建
結合脊髓神經傳導束模型，應用Getdata數據獲取軟件得到相關數據（圖 2），應用SolidWorks三維制圖軟件設計大鼠脊髓支架三維模型，并保存為STL文件。正常脊髓支架三維模型圖顯示，模型內部含有多個平行于縱軸的通道，可清晰顯示神經傳導束位置和形狀數據（圖 3）。利用MRI和Getdata數據獲取軟件可獲得SCI大鼠的脊髓損傷處數據，結合SolidWorks三維制圖軟件設計SCI大鼠脊髓支架三維模型（圖 4）。
2.3 3D打印支架
應用3D打印機成功制備正常脊髓支架（圖 5），支架內平行于縱軸為若干形狀不一的孔道，模擬神經傳導束通道。該脊髓支架形態、截面與大鼠正常脊髓相似，其中各神經傳導束孔隙位置模擬了大鼠脊髓正常神經傳導束走行。
3 討論
既往SCI動物研究中，一般制備T8～10節段脊髓全橫斷或半橫斷損傷，然后將預先制備的脊髓支架材料植入損傷處并觀察療效，這種脊髓損傷模型一般較規則[12]。但是臨床上外傷引起的脊髓損傷形態各異，因此是否需要將損傷脊髓進行規則化處理或將尚未完全離斷的脊髓先行離斷，然后再植入規則的脊髓支架修復，仍存在爭議。多數臨床醫師認為通過手術修整損傷處脊髓會加劇病情。除此之外，目前用于研究的脊髓支架結構比較單一，外形和神經傳導通道不能模擬正常動物脊髓結構。因此制作脊髓仿生支架是一重要研究方向。
3D打印是應用層層相疊的打印技術來制作三維材料，通過電腦輔助設計和電腦輔助制作來實現快速成型打印，構建復雜組織結構[13]。目前已有研究采用3D打印技術成功制備膝關節半月板、血管、肝臟等三維模型，并已用于臨床，充分體現了3D打印技術在實現人體組織器官再生方面的的潛力[14-15]。
本研究通過將影像學技術、三維制圖軟件和3D打印技術相結合，在一定程度上解決了既往脊髓支架的不足，其設計的脊髓仿生支架具有以下優點：① MRI成像技術能更精確地獲取正常脊髓外部形狀和大小數據，對脊髓橫徑和縱徑的比例具有更嚴格設定，根據以上數據獲得的支架不是單純的圓柱形，故在植入脊髓支架時可以辨別脊髓方位，精確地與脊髓兩斷端相吻合，與既往研究制備的內部含有幾個規則通道的圓柱形支架[16]相比，具有更大優勢。② 該仿生支架以脊髓神經傳導束結構為基礎，在內部設計了一系列平行排列的通道，為兩斷端的脊髓神經傳導束提供了延伸空間，其中各神經傳導束孔隙位置模擬了大鼠脊髓正常神經傳導束走行，有利于移植細胞突起的延伸和兩斷端神經傳導束的連接。③ 由于脊髓損傷部位節段不一、形態各異，且大部分脊髓僅部分受損而未完全離斷，通過本研究方法可以設計出與損傷形狀相似的脊髓三維模型，并經3D打印制備目標脊髓支架。在保留未完全離斷的脊髓同時，也解決了不規則脊髓損傷的支架移植問題。
但本研究采用光敏樹脂進行模型制備，該材料因不可生物降解，不宜用于實驗研究。近年來對于可生物降解的合成材料研究較多，比如膠原蛋白[17]、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[18]等，這些材料在動物的中樞神經系統修復作用已得到證實，下一步可以將這些生物材料結合3D打印技術進行脊髓支架的制作。除了促進神經傳導束的縱向延伸、連接外，脊神經的橫向生長在脊髓神經功能恢復方面也具有重要意義[19-20]，因此脊髓支架設計時還需要關注側壁開孔。以上問題均有待進一步研究。
