引用本文： 尋權, 羅宏武, 黃湘俊, 黃飛舟. 人羊膜上皮細胞移植治療肝纖維化免疫大鼠. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(3): 356-363. doi: 10.7507/1002-1892.20150075 復制
目前，藥物及其他輔助治療措施無法從根本上逆轉肝纖維化進展，恢復患者肝功能[1]。肝移植是唯一根治方法，但由于供體不足、醫療費昂貴，以及移植后因免疫排斥反應需長期服用免疫抑制劑等問題，該方法難以廣泛開展[2]。肝干細胞移植有望彌補器官移植存在的供體短缺、移植后免疫排斥反應和費用昂貴等方面問題[3-4]。目前，人羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）已用于臨床眼科疾病[5]、硬化癥[6]、肺纖維化[7]以及神經病變[8-9]等方面的治療；另外，hAECs的條件培養基也被證實能治療眼科疾病[10]。其在肝病研究方面目前仍處于實驗研究階段，但成果顯著。已有實驗證實，移植的hAECs能在免疫缺陷動物體內存活，并在一定程度上治療慢性肝病，緩解肝臟慢性炎癥，降低TGF-β1表達，改善血清谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）/谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平[6, 11-13]。羅宏武等[14]將hAECs移植入肝臟受損的裸鼠脾臟內后，發現細胞可向肝臟遷移，并仍表達肝細胞樣細胞特性及功能，改善裸鼠受損的肝功能。Marongiu等[15]將hAECs經脾臟植入60%肝部分切除的肝再生大鼠模型，移植6個月后，DNA-PCR檢測人Alu基因重復序列證實，0.1%～1%的人Alu基因重復序列在大鼠肝臟細胞中表達。目前相關研究均基于免疫缺陷或部分免疫缺陷的動物[6-7, 11-12]，而人類免疫系統極其復雜，無論是器官移植還是細胞移植，人體均會對其產生長久而復雜的免疫排斥反應。因此，hAECs移植入正常免疫動物體內能否存活、遷徙以及表達其肝細胞樣細胞特性而改善肝臟病變尚未明確。本實驗將hAECs通過脾臟移植入正常免疫能力的肝纖維化大鼠模型體內，觀察其大鼠體內的遷徙以及對肝纖維化的影響，旨在為hAECs應用于臨床提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級10周齡雄性SD大鼠64只，體重220～280 g，購于上海動物中心，飼養于中南大學湘雅三醫院動物實驗中心，采用單體換氣籠盒系統飼養，無菌飼料與水自由飲用，室溫（25±2）℃。
hAECs由中南大學生殖與干細胞工程研究所王建副研究員惠贈。四氯化碳（分析純；濟南鵬越化工有限公司）；Fast HiFidelity PCR Kit基因擴增試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。DSHZ-300型恒溫水浴箱（江蘇太倉醫用儀器廠）；MDF-382E型低溫冰箱（SANYO公司，日本）；BX51T-PHD-J11型顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus多功能真彩色細胞圖像分析管理系統（Media Cybernetics 公司，美國）；LDZ5-2型高速臺式離心機（北京醫用離心機廠）；RM2015型切片機（Leica公司，德國）；全自動生化分析儀（Beckman公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將64只SD大鼠隨機分為4組，每組16只。A組為肝纖維化+細胞移植組，B組為肝纖維化+生理鹽水組，C組為肝纖維化組，D組為空白對照組（不作任何處理）。
肝纖維化模型制備：取A、B、C組大鼠，飼養1周后開始模型制備。首次皮下注射四氯化碳溶液0.5 mL/100 g；以后每3天隨機于大鼠頸部、腹部或四肢根部皮下注射四氯化碳溶液，劑量為0.3 mL/100 g，同時加用高脂飼料喂養[16]。從第2次給藥開始記錄造模時間共8周。
細胞移植：造模給藥8周后，A、B組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉（鑒于是肝纖維化大鼠，麻醉藥易加重肝性腦病可能，其量減半，并酌情追加）。解剖并暴露脾臟，A、B組分別用1 mL注射器抽取0.4 mL hAECs細胞懸浮液（移植細胞量4×106個[7, 17]）、生理鹽水，從脾下極向脾實質內緩慢注射。注射后用無菌紗布輕壓注射點1 min，以防滲漏和出血。將脾臟回納腹腔，逐層縫合腹壁。每只大鼠術后當天及以后每天常規于大腿根部肌肉注射青霉素20萬U，持續1周。
1.3 檢測指標
1.3.1 標本收集及大體觀察
造模過程觀察大鼠存活情況。移植術后2周，于各組大鼠眶后靜脈抽血，以4 000×g離心15 min，保存上清液，標記備用。然后脊椎脫臼法處死各組大鼠，完整取出各組大鼠肝臟及A組大鼠脾、心、腎、腦、肺組織，肉眼觀察后液氮轉移至-80℃冰箱保存，備用。
1.3.2 人Alu基因重復序列檢測
取A組各臟器標本，參照下述方法提取基因組DNA。① 處理材料：將各組織打碎制備細胞懸液，然后以11 200×g離心1 min，棄上清，加200 μL緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。加入4 μL RNaseA（100 mg/mL）溶液（去除RNA），振蕩15 s，室溫放置5 min。加入20 μL Proteinase K溶液，混勻，56℃放置，直至組織溶解。以11 200×g離心1 min，以去除管蓋內壁水珠再行下一步驟。不同組織裂解時間不同，通常1～3 h即可完成。每小時顛倒混合樣品2～3次或采用水浴振蕩器混合樣品。② Alu基因重復序列擴增：參照Fast HiFidelity PCR Kit基因擴增試劑盒說明進行操作。PCR反應體系（20 μL）：5×Fast HiFidelity PCR Buffer，4 μL；10 μmol/L Primer1，1 μL；10 μmol/ L Primer1，1 μL；20×Fast PCR Enhancer，1 μL；DNA Template，2 μL；Fast HiFidelity，0.4 μL；ddH2O2，10.6 μL；振蕩混勻后置于PCR儀中。Alu的PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃復性10 s，68℃延伸15 s，35個循環；68℃延伸5 min。然后行2%瓊脂糖凝膠電泳。以正常人羊膜組織DNA為陽性對照，計算各組中人Alu基因重復序列陽性表達臟器的肝纖維化大鼠模型占全部大鼠的百分比。
1.3.3 免疫組織化學檢測
① 肝纖維化半定量分析：取各組肝左葉相同部位組織，置于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，0.5 μm厚切片，脫蠟水化，常規HE染色觀察；并采用Chevallier等[18]提出的肝纖維化組織學半定量計分系統（SSS）行肝纖維化組織學半定量計分。
② 人白細胞抗原G（human leucocyte antigen G，HLA-G）表達檢測：取A組各臟器組織，PBS沖洗，選取體積小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚切片；脫蠟入水，1%甲醇-H2O2室溫30 min，蒸餾水沖洗1次，0.1 mol/L PBS沖洗3 次 ×5 min；滴加抗原修復液，室溫10 min，0.1 mol/ L PBS沖洗3次×5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，棄去多余液體，不沖洗；滴加一抗，4℃過夜，0.1 mol/L PBS沖洗3次×5 min；滴加生物素化二抗（IgG），37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS沖洗3次×5 min；滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS沖洗3 次 ×5 min；DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，顯微鏡觀察，計算HLA-G陽性表達大鼠占全部大鼠的百分比。
③ TGF-β1表達檢測：取各組肝臟，同上述方法檢測TGF-β1表達。選擇各組陽性組織進行100倍顯微照相，對圖像進行免疫組織化學評分（immunohistochemical score，ISH）[19]，評價標準：A為陽性細胞數分級，80%～100%為4級、50%～80%為3級、10%～50%為2級、1%～10%為1級、＜1%為0級；B為陽性細胞顯色強度分級，強陽性為3級、陽性為2級、弱陽性為1級、陰性為0級；ISH=A×B。
1.3.4 血清肝功能檢測
取移植術后2周各組大鼠血清，自動生化儀檢測AST、ALT及白蛋白（albumin，ALB）濃度。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。人Alu基因重復序列及HLA-G結果以率表示（其中脾臟為細胞注入器官不納入統計），組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
A組2只大鼠于麻醉及細胞移植過程中死亡，可能與肝纖維化大鼠模型對水合氯醛麻醉過敏、麻醉耐受差有關；B組1只、C組2只分別于肝纖維化模型造模時死亡；D組大鼠均存活。死亡大鼠未予補充。
D組大鼠肝臟飽滿，呈正常肝臟形態；其余各組肝臟形態不規則，體積明顯縮小，邊緣呈鋸齒狀，表面粗糙，可見散在白色小結節，A組與B、C組比較無明顯差異。A組大鼠脾臟增大，組織輕度水腫；腎、心、腦組織形態無明顯改變，其中1只大鼠心、肺表面可見多發性增生結節，呈白色，質地較柔軟（不同于肝纖維化結節）；胸腔廣泛探查未見腫瘤形成；各臟器多點切開后，未見異常癌性結節及腫塊。
2.2 人Alu基因重復序列檢測
A組人Alu基因重復序列表達陽性，可見大量基因組片段位于200～300 bp之間，見圖 1。A組肝、脾、心、肺、腦、腎組織中人Alu基因重復序列陽性表達百分比分別為85.7%（12/14）、85.7%（12/14）、35.7%（5/14）、28.6%（4/14）、35.7%（5/14）、21.4%（3/14）。肝組織中陽性表達百分比顯著高于其余組織，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。
圖1
A組大鼠各標本人Alu基因重復序列電泳結果 M：Marker 1、7、13、19：心 2、8、14、20：腎 3、9、15、21：肝 4、10、16、22：腦 5、11、17、23：脾 6、12、18、24：肺
Figure1.
The electrophoresis results of human Alu gene repeat sequence in the organs of group A M: Marker 1,7,13,19: Heart 2,8,14,20: Kidney 3,9,15,21: Liver 4,10,16,22: Brain 5,11,17,23: Spleen 6,12,18,24: Lung
2.3 免疫組織化學檢測
2.3.1 肝纖維化半定量分析
HE染色示，A、B、C組可見匯管區片狀或條索狀區域，散在肝纖維化結節，肝纖維化程度明顯；D組匯管區清晰，無肝纖維結節及條索狀改變。見圖 2。A、B、C組肝纖維化組織學半定量計分分別為（10.47±3.20）、（13.84±3.46）、（13.85±3.16）分，A組顯著低于B、C組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。D組未作纖維化處理，不進行評分。
圖2
各組肝組織HE染色觀察（×200） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組? ?圖 3 A組各臟器HLA-G免疫組織化學 染色觀察（×200） ? 肝 ?脾 ? 心 ? 肺 ? 腦 ? 腎? ?圖 4 各組肝組織TGF-β1免疫組織化學染色觀察（×200） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組
Figure2.
HE staining of liver tissue in each group (×200) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D? ? Fig. 3 The expression of HLA-G by immunohistochemistry staining in the organs of group A (×200) ? Liver ? Spleen ? Heart ? Lung ? Brain ? Kidney? ? Fig. 4 The expression of TGF-β1 by immunohistochemistry staining in the liver of each group (×200) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D
2.3.2 HLA-G表達檢測
鏡下觀察示，A組各臟器中均可見顆粒狀散在分布的黃棕色斑點，HLA-G呈陽性表達。見圖 3。肝、脾、心、肺、腦、腎組織中HLA-G陽性表達百分比分別為92.9%（13/14）、92.9%（13/14）、42.9%（6/14）、50.0%（7/14）、28.6% （4/14）、28.6%（4/14）。肝組織中陽性表達百分比顯著高于其余組織，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.3.3 TGF-β1表達檢測
鏡下觀察示，各組肝臟中均可見散在分布的棕黃色染色，TGF-β1呈陽性表達。見圖 4。A、B、C、D組ISH評分分別為（3.60±1.50）、（5.38±2.60）、（5.50±2.40）、（1.87±1.36）分，A、B、C組顯著高于D組，A組顯著低于B、C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 血清肝功能檢測
A、B、C組血清AST、ALT濃度顯著高于D組，A組顯著低于B、C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。A、B、C組血清ALB濃度顯著低于D組，A組顯著高于B、C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組血清ALT、AST、ALB測定結果（3 討論
20世紀前葉，羊膜即被證實能促進燒傷皮膚愈合，之后有研究證明了其在角膜重建中的作用[20]。近年來，羊膜及羊膜來源細胞已被廣泛應用于各種疾病動物模型的研究，如帕金森病[21]、脊柱損傷[22]、糖尿病[23]、膽汁淤積性肝纖維化[24]等。根據羊膜形成過程表明，hAECs來源于內側細胞群形成的外胚葉，與3個胚層的原始細胞更相似。提示hAECs可能具有多能分化潛能，也是羊膜發揮治療作用的主要效應細胞。
hAECs在再生醫學的應用潛能已引起了研究者廣泛關注[25-26]，目前關于hAECs的提取、培養、凍存方法已有大量研究[27-28]。hAECs表達內胚層細胞系特有標記物，如GATA-4和肝細胞核因子3β（hepatocyte nuclear factor 3β，HNF-3β），表明未分化的hAECs可能具有肝細胞潛能。GATA-4和HNF-3β可黏附于ALB基因轉錄的增強子區，并能激活ALB的轉錄，這解釋了在未誘導分化的hAECs中可檢測到ALB的原因[29]。未分化的hAECs還可表達存在于肝細胞中的α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT）、細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）、氨甲酰磷酸合成酶1（carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS-1）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK） 等基因[30]。另外，應用單步法培養體系，即僅用胰島素和地塞米松或聯合應用FGF-2和抑瘤素M培養hAECs 14～ 28 d后，細胞開始在膠原基質上生長，并表達肝細胞樣細胞特性[30]。對hAECs誘導的肝細胞樣細胞（hepatocyte-like cells，HLCs）研究表明，細胞內不僅α1-AT、 CK18、CPS-1、細胞色素P450同工酶3A4（cytochrome P450 proteins 3A4，CYP3A4）和PEPCK等相關基因表達增加，更重要的是HNF-4α和CYP1A1等蛋白增加[30-31]。近年研究發現，在鼠及豬來源的肝細胞外基質中培養hAECs，能在很大程度上促進其分化成HLCs[15]。Marongiu等[15]和Miki等[32]的研究表明，用豬肝臟來源的細胞外基質培養hAECs，其ALB和部分CYP基因的表達增加最顯著，hAECs誘導的HLCs還能表達CYP3A4同共酶CYP3A7，但與成人干細胞不同，其表達程度不能被苯巴比妥誘導。另外，未分化的hAECs具有肝細胞的部分特征，能特異性表達甲胎蛋白和ALB，但不表達HNF-4α[33]。本研究小組既往實驗證實[34]，hAECs可在體外向肝細胞樣細胞誘導分化，并能成功誘導分化為有功能的HLCs，并且首次檢測到hAECs對腺相關病毒有兼容，將經綠色熒光蛋白的腺相關病毒（adeno-associated virus，green fluorescent protein，AAV-GFP）轉染后的hAECs植入動物體內，明確了AAV-GFP作為hAECs運載載體和活體標記可行，為后續動物實驗細胞示蹤提供了依據。Manuelpillai等[12]將hAECs經尾靜脈注入四氯化碳誘導的C57BL/6小鼠肝纖維化模型體內，除了檢測到表達人血ALB外，還檢測到成熟肝細胞標記物HNF-4α的表達，表明hAECs在體內可分化為HLCs。Miki等[32]應用人類特異性引物檢測發現，hAECs能表達多種成熟肝細胞標記物的mRNA，如細胞色素P450 CYP酶、葡萄糖醛酸轉移酶（參與氨基酸運輸）、γ-谷氨酰轉移酶（藥物解毒作用和參與谷胱甘肽代謝）、ALB、HNF-4α。
本實驗中，我們選擇正常免疫能力的SD大鼠為實驗對象，根據文獻及既往研究[7, 17]，選擇經脾臟移植原代hAECs（4×106個）至四氯化碳誘導的經典肝纖維化大鼠模型體內，通過追蹤2周后人Alu基因重復序列和HLA-G蛋白的表達，表明細胞在體內能存活，并至少能存活2周。Bailo等[35]研究證實，hAECs和MSCs共同移植數周后，可在豬以及嚙齒目動物器官檢測到人類DNA的存在。有學者將hAECs移植至博萊霉素誘導的C57/BL6小鼠肺纖維化模型中，2周后通過免疫組織化學檢測Alu基因重復序列證明肺部有人類細胞的存在[36]，并進一步證實其對小鼠肺纖維化有治療作用。本研究中，A組肝臟人Alu基因重復序列和HLA-G蛋白的表達與其余各臟器比較，差異有統計學意義，考慮是在肝臟中的趨化因子作用下，肝臟中的陽性細胞增多或肝臟的陽性細胞在肝損傷作用下分化增殖所致。hAECs可分泌HLA-G已是共識，HLA-G為人類細胞特有，是一種非經典多表型的Ⅰ類分子，可作為移植細胞在大鼠體內遷徙的依據，在絨毛膜癌細胞首先發現[37]，也可在胎盤細胞中表達并進入母體子宮，并調節母體免疫反應對胎兒的作用[38]；另外，可抑制同種異體反應性T細胞的增殖作用[39]。本實驗結果表明，hAECs移植入正常免疫能力大鼠體內，于心、肝、肺、腦、腎組織中可觀察到不同程度HLA-G表達，與人Alu基因重復序列得到相同結果，肝臟陽性表達百分比最高。同樣的結果也在其他研究中有報道，人HLA-G在細胞移植后2周內能存在于大鼠心、肝、腦、腎等臟器中[30, 40]。Kamimura等[41]進行了細胞移植與尾靜脈、腹腔移植和脾內移植的對照研究，發現經脾臟移植時，肝臟總陽性細胞最多。因此我們采取脾內移植，并通過檢測大鼠肝臟陽性細胞百分比證實了這一點。雖然調節移植細胞的遷移和植入因素尚未知曉，但可能與趨化因子、黏附分子和肝細胞特有的因子（如1-磷酸鞘氨醇等）有關[42]。另外，大量文獻表明，在hAECs移植入腦損傷、脊髓損傷和肺損傷的部分免疫鼠模型2周后，各損傷臟器均存在陽性表達結果[7, 36, 43-44]。
本研究另一重點是將hAECs經脾內移植入肝纖維化大鼠模型。通過對各組肝臟相同部位組織進行HE染色以及SSS評分，發現A組評分顯著低于B、C組，且差異有統計學意義，提示hAECs移植后肝纖維化程度較未植入細胞組減輕。細胞移植2周后，大鼠血清肝功能恢復情況明顯優于B、C組。另外，上述結果亦表明hAECs在活體內可能誘導成肝細胞樣細胞，并發揮正常肝細胞的相關功能，改善大鼠肝纖維化程度、肝功能和降低TGF-β1表達。不僅如此，有研究表明hAECs移植入免疫小鼠體內，可降低肝組織炎性反應，低水平表達炎細胞因子IL-6和TNF-α，并高水平表達抗炎細胞因子IL-10[12]，這可能反映了抗肝纖維化、細胞因子之間的協同作用。近年一項研究表明，體外培養的hAECs可誘導IL-10增加、降低IL-6的表達[45]。
目前尚無任何形態學和組織學證據表明hAECs移植后存在宿主排斥反應，hAECs移植至脊髓損傷猴模型內也證實了這一觀點[8]。這可能與hAECs具有低水平表達的HLA類Ⅰα及Ⅱ分子和共刺激分子或宿主T細胞增殖活性的抑制作用等因素有關[37, 46]。
綜上述，hAECs移植可在正常免疫大鼠體內存活，并能降低肝纖維化，促進肝功能恢復。但hAECs應用于臨床仍存在大量問題有待解決，比如移植細胞的最佳數量、細胞移植最佳方法等，需通過不同疾病和動物模型觀察研究。另外，本實驗結果雖然表明hAECs能改善肝纖維化，但細胞植入時間較短，時間延長后其能否存活及治療肝纖維化的作用仍待進一步研究。
目前，藥物及其他輔助治療措施無法從根本上逆轉肝纖維化進展，恢復患者肝功能[1]。肝移植是唯一根治方法，但由于供體不足、醫療費昂貴，以及移植后因免疫排斥反應需長期服用免疫抑制劑等問題，該方法難以廣泛開展[2]。肝干細胞移植有望彌補器官移植存在的供體短缺、移植后免疫排斥反應和費用昂貴等方面問題[3-4]。目前，人羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）已用于臨床眼科疾病[5]、硬化癥[6]、肺纖維化[7]以及神經病變[8-9]等方面的治療；另外，hAECs的條件培養基也被證實能治療眼科疾病[10]。其在肝病研究方面目前仍處于實驗研究階段，但成果顯著。已有實驗證實，移植的hAECs能在免疫缺陷動物體內存活，并在一定程度上治療慢性肝病，緩解肝臟慢性炎癥，降低TGF-β1表達，改善血清谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）/谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平[6, 11-13]。羅宏武等[14]將hAECs移植入肝臟受損的裸鼠脾臟內后，發現細胞可向肝臟遷移，并仍表達肝細胞樣細胞特性及功能，改善裸鼠受損的肝功能。Marongiu等[15]將hAECs經脾臟植入60%肝部分切除的肝再生大鼠模型，移植6個月后，DNA-PCR檢測人Alu基因重復序列證實，0.1%～1%的人Alu基因重復序列在大鼠肝臟細胞中表達。目前相關研究均基于免疫缺陷或部分免疫缺陷的動物[6-7, 11-12]，而人類免疫系統極其復雜，無論是器官移植還是細胞移植，人體均會對其產生長久而復雜的免疫排斥反應。因此，hAECs移植入正常免疫動物體內能否存活、遷徙以及表達其肝細胞樣細胞特性而改善肝臟病變尚未明確。本實驗將hAECs通過脾臟移植入正常免疫能力的肝纖維化大鼠模型體內，觀察其大鼠體內的遷徙以及對肝纖維化的影響，旨在為hAECs應用于臨床提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級10周齡雄性SD大鼠64只，體重220～280 g，購于上海動物中心，飼養于中南大學湘雅三醫院動物實驗中心，采用單體換氣籠盒系統飼養，無菌飼料與水自由飲用，室溫（25±2）℃。
hAECs由中南大學生殖與干細胞工程研究所王建副研究員惠贈。四氯化碳（分析純；濟南鵬越化工有限公司）；Fast HiFidelity PCR Kit基因擴增試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。DSHZ-300型恒溫水浴箱（江蘇太倉醫用儀器廠）；MDF-382E型低溫冰箱（SANYO公司，日本）；BX51T-PHD-J11型顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus多功能真彩色細胞圖像分析管理系統（Media Cybernetics 公司，美國）；LDZ5-2型高速臺式離心機（北京醫用離心機廠）；RM2015型切片機（Leica公司，德國）；全自動生化分析儀（Beckman公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將64只SD大鼠隨機分為4組，每組16只。A組為肝纖維化+細胞移植組，B組為肝纖維化+生理鹽水組，C組為肝纖維化組，D組為空白對照組（不作任何處理）。
肝纖維化模型制備：取A、B、C組大鼠，飼養1周后開始模型制備。首次皮下注射四氯化碳溶液0.5 mL/100 g；以后每3天隨機于大鼠頸部、腹部或四肢根部皮下注射四氯化碳溶液，劑量為0.3 mL/100 g，同時加用高脂飼料喂養[16]。從第2次給藥開始記錄造模時間共8周。
細胞移植：造模給藥8周后，A、B組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉（鑒于是肝纖維化大鼠，麻醉藥易加重肝性腦病可能，其量減半，并酌情追加）。解剖并暴露脾臟，A、B組分別用1 mL注射器抽取0.4 mL hAECs細胞懸浮液（移植細胞量4×106個[7, 17]）、生理鹽水，從脾下極向脾實質內緩慢注射。注射后用無菌紗布輕壓注射點1 min，以防滲漏和出血。將脾臟回納腹腔，逐層縫合腹壁。每只大鼠術后當天及以后每天常規于大腿根部肌肉注射青霉素20萬U，持續1周。
1.3 檢測指標
1.3.1 標本收集及大體觀察
造模過程觀察大鼠存活情況。移植術后2周，于各組大鼠眶后靜脈抽血，以4 000×g離心15 min，保存上清液，標記備用。然后脊椎脫臼法處死各組大鼠，完整取出各組大鼠肝臟及A組大鼠脾、心、腎、腦、肺組織，肉眼觀察后液氮轉移至-80℃冰箱保存，備用。
1.3.2 人Alu基因重復序列檢測
取A組各臟器標本，參照下述方法提取基因組DNA。① 處理材料：將各組織打碎制備細胞懸液，然后以11 200×g離心1 min，棄上清，加200 μL緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。加入4 μL RNaseA（100 mg/mL）溶液（去除RNA），振蕩15 s，室溫放置5 min。加入20 μL Proteinase K溶液，混勻，56℃放置，直至組織溶解。以11 200×g離心1 min，以去除管蓋內壁水珠再行下一步驟。不同組織裂解時間不同，通常1～3 h即可完成。每小時顛倒混合樣品2～3次或采用水浴振蕩器混合樣品。② Alu基因重復序列擴增：參照Fast HiFidelity PCR Kit基因擴增試劑盒說明進行操作。PCR反應體系（20 μL）：5×Fast HiFidelity PCR Buffer，4 μL；10 μmol/L Primer1，1 μL；10 μmol/ L Primer1，1 μL；20×Fast PCR Enhancer，1 μL；DNA Template，2 μL；Fast HiFidelity，0.4 μL；ddH2O2，10.6 μL；振蕩混勻后置于PCR儀中。Alu的PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃復性10 s，68℃延伸15 s，35個循環；68℃延伸5 min。然后行2%瓊脂糖凝膠電泳。以正常人羊膜組織DNA為陽性對照，計算各組中人Alu基因重復序列陽性表達臟器的肝纖維化大鼠模型占全部大鼠的百分比。
1.3.3 免疫組織化學檢測
① 肝纖維化半定量分析：取各組肝左葉相同部位組織，置于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，0.5 μm厚切片，脫蠟水化，常規HE染色觀察；并采用Chevallier等[18]提出的肝纖維化組織學半定量計分系統（SSS）行肝纖維化組織學半定量計分。
② 人白細胞抗原G（human leucocyte antigen G，HLA-G）表達檢測：取A組各臟器組織，PBS沖洗，選取體積小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚切片；脫蠟入水，1%甲醇-H2O2室溫30 min，蒸餾水沖洗1次，0.1 mol/L PBS沖洗3 次 ×5 min；滴加抗原修復液，室溫10 min，0.1 mol/ L PBS沖洗3次×5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，棄去多余液體，不沖洗；滴加一抗，4℃過夜，0.1 mol/L PBS沖洗3次×5 min；滴加生物素化二抗（IgG），37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS沖洗3次×5 min；滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS沖洗3 次 ×5 min；DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，顯微鏡觀察，計算HLA-G陽性表達大鼠占全部大鼠的百分比。
③ TGF-β1表達檢測：取各組肝臟，同上述方法檢測TGF-β1表達。選擇各組陽性組織進行100倍顯微照相，對圖像進行免疫組織化學評分（immunohistochemical score，ISH）[19]，評價標準：A為陽性細胞數分級，80%～100%為4級、50%～80%為3級、10%～50%為2級、1%～10%為1級、＜1%為0級；B為陽性細胞顯色強度分級，強陽性為3級、陽性為2級、弱陽性為1級、陰性為0級；ISH=A×B。
1.3.4 血清肝功能檢測
取移植術后2周各組大鼠血清，自動生化儀檢測AST、ALT及白蛋白（albumin，ALB）濃度。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。人Alu基因重復序列及HLA-G結果以率表示（其中脾臟為細胞注入器官不納入統計），組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
A組2只大鼠于麻醉及細胞移植過程中死亡，可能與肝纖維化大鼠模型對水合氯醛麻醉過敏、麻醉耐受差有關；B組1只、C組2只分別于肝纖維化模型造模時死亡；D組大鼠均存活。死亡大鼠未予補充。
D組大鼠肝臟飽滿，呈正常肝臟形態；其余各組肝臟形態不規則，體積明顯縮小，邊緣呈鋸齒狀，表面粗糙，可見散在白色小結節，A組與B、C組比較無明顯差異。A組大鼠脾臟增大，組織輕度水腫；腎、心、腦組織形態無明顯改變，其中1只大鼠心、肺表面可見多發性增生結節，呈白色，質地較柔軟（不同于肝纖維化結節）；胸腔廣泛探查未見腫瘤形成；各臟器多點切開后，未見異常癌性結節及腫塊。
2.2 人Alu基因重復序列檢測
A組人Alu基因重復序列表達陽性，可見大量基因組片段位于200～300 bp之間，見圖 1。A組肝、脾、心、肺、腦、腎組織中人Alu基因重復序列陽性表達百分比分別為85.7%（12/14）、85.7%（12/14）、35.7%（5/14）、28.6%（4/14）、35.7%（5/14）、21.4%（3/14）。肝組織中陽性表達百分比顯著高于其余組織，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。
圖1
A組大鼠各標本人Alu基因重復序列電泳結果 M：Marker 1、7、13、19：心 2、8、14、20：腎 3、9、15、21：肝 4、10、16、22：腦 5、11、17、23：脾 6、12、18、24：肺
Figure1.
The electrophoresis results of human Alu gene repeat sequence in the organs of group A M: Marker 1,7,13,19: Heart 2,8,14,20: Kidney 3,9,15,21: Liver 4,10,16,22: Brain 5,11,17,23: Spleen 6,12,18,24: Lung
2.3 免疫組織化學檢測
2.3.1 肝纖維化半定量分析
HE染色示，A、B、C組可見匯管區片狀或條索狀區域，散在肝纖維化結節，肝纖維化程度明顯；D組匯管區清晰，無肝纖維結節及條索狀改變。見圖 2。A、B、C組肝纖維化組織學半定量計分分別為（10.47±3.20）、（13.84±3.46）、（13.85±3.16）分，A組顯著低于B、C組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。D組未作纖維化處理，不進行評分。
圖2
各組肝組織HE染色觀察（×200） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組? ?圖 3 A組各臟器HLA-G免疫組織化學 染色觀察（×200） ? 肝 ?脾 ? 心 ? 肺 ? 腦 ? 腎? ?圖 4 各組肝組織TGF-β1免疫組織化學染色觀察（×200） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組
Figure2.
HE staining of liver tissue in each group (×200) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D? ? Fig. 3 The expression of HLA-G by immunohistochemistry staining in the organs of group A (×200) ? Liver ? Spleen ? Heart ? Lung ? Brain ? Kidney? ? Fig. 4 The expression of TGF-β1 by immunohistochemistry staining in the liver of each group (×200) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D
2.3.2 HLA-G表達檢測
鏡下觀察示，A組各臟器中均可見顆粒狀散在分布的黃棕色斑點，HLA-G呈陽性表達。見圖 3。肝、脾、心、肺、腦、腎組織中HLA-G陽性表達百分比分別為92.9%（13/14）、92.9%（13/14）、42.9%（6/14）、50.0%（7/14）、28.6% （4/14）、28.6%（4/14）。肝組織中陽性表達百分比顯著高于其余組織，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.3.3 TGF-β1表達檢測
鏡下觀察示，各組肝臟中均可見散在分布的棕黃色染色，TGF-β1呈陽性表達。見圖 4。A、B、C、D組ISH評分分別為（3.60±1.50）、（5.38±2.60）、（5.50±2.40）、（1.87±1.36）分，A、B、C組顯著高于D組，A組顯著低于B、C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 血清肝功能檢測
A、B、C組血清AST、ALT濃度顯著高于D組，A組顯著低于B、C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。A、B、C組血清ALB濃度顯著低于D組，A組顯著高于B、C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組血清ALT、AST、ALB測定結果（3 討論
20世紀前葉，羊膜即被證實能促進燒傷皮膚愈合，之后有研究證明了其在角膜重建中的作用[20]。近年來，羊膜及羊膜來源細胞已被廣泛應用于各種疾病動物模型的研究，如帕金森病[21]、脊柱損傷[22]、糖尿病[23]、膽汁淤積性肝纖維化[24]等。根據羊膜形成過程表明，hAECs來源于內側細胞群形成的外胚葉，與3個胚層的原始細胞更相似。提示hAECs可能具有多能分化潛能，也是羊膜發揮治療作用的主要效應細胞。
hAECs在再生醫學的應用潛能已引起了研究者廣泛關注[25-26]，目前關于hAECs的提取、培養、凍存方法已有大量研究[27-28]。hAECs表達內胚層細胞系特有標記物，如GATA-4和肝細胞核因子3β（hepatocyte nuclear factor 3β，HNF-3β），表明未分化的hAECs可能具有肝細胞潛能。GATA-4和HNF-3β可黏附于ALB基因轉錄的增強子區，并能激活ALB的轉錄，這解釋了在未誘導分化的hAECs中可檢測到ALB的原因[29]。未分化的hAECs還可表達存在于肝細胞中的α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT）、細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）、氨甲酰磷酸合成酶1（carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS-1）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK） 等基因[30]。另外，應用單步法培養體系，即僅用胰島素和地塞米松或聯合應用FGF-2和抑瘤素M培養hAECs 14～ 28 d后，細胞開始在膠原基質上生長，并表達肝細胞樣細胞特性[30]。對hAECs誘導的肝細胞樣細胞（hepatocyte-like cells，HLCs）研究表明，細胞內不僅α1-AT、 CK18、CPS-1、細胞色素P450同工酶3A4（cytochrome P450 proteins 3A4，CYP3A4）和PEPCK等相關基因表達增加，更重要的是HNF-4α和CYP1A1等蛋白增加[30-31]。近年研究發現，在鼠及豬來源的肝細胞外基質中培養hAECs，能在很大程度上促進其分化成HLCs[15]。Marongiu等[15]和Miki等[32]的研究表明，用豬肝臟來源的細胞外基質培養hAECs，其ALB和部分CYP基因的表達增加最顯著，hAECs誘導的HLCs還能表達CYP3A4同共酶CYP3A7，但與成人干細胞不同，其表達程度不能被苯巴比妥誘導。另外，未分化的hAECs具有肝細胞的部分特征，能特異性表達甲胎蛋白和ALB，但不表達HNF-4α[33]。本研究小組既往實驗證實[34]，hAECs可在體外向肝細胞樣細胞誘導分化，并能成功誘導分化為有功能的HLCs，并且首次檢測到hAECs對腺相關病毒有兼容，將經綠色熒光蛋白的腺相關病毒（adeno-associated virus，green fluorescent protein，AAV-GFP）轉染后的hAECs植入動物體內，明確了AAV-GFP作為hAECs運載載體和活體標記可行，為后續動物實驗細胞示蹤提供了依據。Manuelpillai等[12]將hAECs經尾靜脈注入四氯化碳誘導的C57BL/6小鼠肝纖維化模型體內，除了檢測到表達人血ALB外，還檢測到成熟肝細胞標記物HNF-4α的表達，表明hAECs在體內可分化為HLCs。Miki等[32]應用人類特異性引物檢測發現，hAECs能表達多種成熟肝細胞標記物的mRNA，如細胞色素P450 CYP酶、葡萄糖醛酸轉移酶（參與氨基酸運輸）、γ-谷氨酰轉移酶（藥物解毒作用和參與谷胱甘肽代謝）、ALB、HNF-4α。
本實驗中，我們選擇正常免疫能力的SD大鼠為實驗對象，根據文獻及既往研究[7, 17]，選擇經脾臟移植原代hAECs（4×106個）至四氯化碳誘導的經典肝纖維化大鼠模型體內，通過追蹤2周后人Alu基因重復序列和HLA-G蛋白的表達，表明細胞在體內能存活，并至少能存活2周。Bailo等[35]研究證實，hAECs和MSCs共同移植數周后，可在豬以及嚙齒目動物器官檢測到人類DNA的存在。有學者將hAECs移植至博萊霉素誘導的C57/BL6小鼠肺纖維化模型中，2周后通過免疫組織化學檢測Alu基因重復序列證明肺部有人類細胞的存在[36]，并進一步證實其對小鼠肺纖維化有治療作用。本研究中，A組肝臟人Alu基因重復序列和HLA-G蛋白的表達與其余各臟器比較，差異有統計學意義，考慮是在肝臟中的趨化因子作用下，肝臟中的陽性細胞增多或肝臟的陽性細胞在肝損傷作用下分化增殖所致。hAECs可分泌HLA-G已是共識，HLA-G為人類細胞特有，是一種非經典多表型的Ⅰ類分子，可作為移植細胞在大鼠體內遷徙的依據，在絨毛膜癌細胞首先發現[37]，也可在胎盤細胞中表達并進入母體子宮，并調節母體免疫反應對胎兒的作用[38]；另外，可抑制同種異體反應性T細胞的增殖作用[39]。本實驗結果表明，hAECs移植入正常免疫能力大鼠體內，于心、肝、肺、腦、腎組織中可觀察到不同程度HLA-G表達，與人Alu基因重復序列得到相同結果，肝臟陽性表達百分比最高。同樣的結果也在其他研究中有報道，人HLA-G在細胞移植后2周內能存在于大鼠心、肝、腦、腎等臟器中[30, 40]。Kamimura等[41]進行了細胞移植與尾靜脈、腹腔移植和脾內移植的對照研究，發現經脾臟移植時，肝臟總陽性細胞最多。因此我們采取脾內移植，并通過檢測大鼠肝臟陽性細胞百分比證實了這一點。雖然調節移植細胞的遷移和植入因素尚未知曉，但可能與趨化因子、黏附分子和肝細胞特有的因子（如1-磷酸鞘氨醇等）有關[42]。另外，大量文獻表明，在hAECs移植入腦損傷、脊髓損傷和肺損傷的部分免疫鼠模型2周后，各損傷臟器均存在陽性表達結果[7, 36, 43-44]。
本研究另一重點是將hAECs經脾內移植入肝纖維化大鼠模型。通過對各組肝臟相同部位組織進行HE染色以及SSS評分，發現A組評分顯著低于B、C組，且差異有統計學意義，提示hAECs移植后肝纖維化程度較未植入細胞組減輕。細胞移植2周后，大鼠血清肝功能恢復情況明顯優于B、C組。另外，上述結果亦表明hAECs在活體內可能誘導成肝細胞樣細胞，并發揮正常肝細胞的相關功能，改善大鼠肝纖維化程度、肝功能和降低TGF-β1表達。不僅如此，有研究表明hAECs移植入免疫小鼠體內，可降低肝組織炎性反應，低水平表達炎細胞因子IL-6和TNF-α，并高水平表達抗炎細胞因子IL-10[12]，這可能反映了抗肝纖維化、細胞因子之間的協同作用。近年一項研究表明，體外培養的hAECs可誘導IL-10增加、降低IL-6的表達[45]。
目前尚無任何形態學和組織學證據表明hAECs移植后存在宿主排斥反應，hAECs移植至脊髓損傷猴模型內也證實了這一觀點[8]。這可能與hAECs具有低水平表達的HLA類Ⅰα及Ⅱ分子和共刺激分子或宿主T細胞增殖活性的抑制作用等因素有關[37, 46]。
綜上述，hAECs移植可在正常免疫大鼠體內存活，并能降低肝纖維化，促進肝功能恢復。但hAECs應用于臨床仍存在大量問題有待解決，比如移植細胞的最佳數量、細胞移植最佳方法等，需通過不同疾病和動物模型觀察研究。另外，本實驗結果雖然表明hAECs能改善肝纖維化，但細胞植入時間較短，時間延長后其能否存活及治療肝纖維化的作用仍待進一步研究。
