引用本文： 袁超, 王建, 朱曉龍, 鄭勇, 黃博, 李長青, 周躍. 應力調節人椎間盤軟骨終板干細胞成骨分化的研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(3): 351-355. doi: 10.7507/1002-1892.20150074 復制
椎間盤是脊柱運動節段中重要組成部分，椎間盤組織和細胞的生長發育處于復雜的力學微環境中，力學刺激對椎間盤細胞的生理、病理狀態和功能起著重要調節作用[1-2]。目前已認識到椎間盤退變是一種由生物力學和生物化學因素相互作用引起的復雜病理過程，但其確切發病機制仍不清楚[3]。BMP是屬于TGF-β家族的一類分泌型多功能蛋白，其在調節多種細胞的生長、分化、遷移和凋亡過程中起重要作用[4]。1999年，Takae等[5]首次在小鼠椎間盤中發現BMP及其受體；隨后，BMP在椎間盤退變過程中的作用及相關機制被廣泛關注和研究[6-7]。BMP-2是BMP家族的主要成員之一，具有誘導未分化MSCs向成骨細胞定向分化與增殖的能力[8]。研究表明，機械刺激同樣能增加MSCs中BMP-2的表達量，促進MSCs向成骨方向分化。Rui等[9]通過體外實驗，研究機械刺激對肌腱源性干細胞BMP-2表達的影響及BMP-2促進肌腱源性干細胞向成骨分化的作用，結果顯示機械刺激可增加肌腱源性干細胞的BMP-2表達，并提高了肌腱源性干細胞向成骨分化的能力。Susperregui等[10]研究發現，在缺少化學因子誘導情況下，單獨的周期性牽拉可增加多能干細胞系C2C12細胞中BMP-2的表達。在有力學刺激作用存在時BMP-2表達增強，提示BMP-2可能是力學信號傳導的重要分子。
既往研究中，我們利用瓊脂糖懸浮培養系統從人退變椎間盤軟骨終板中分離出軟骨終板干細胞（cartilage endplate-derived stem cells，CESCs），發現它們具有與BMSCs一致的生物學特性[11-12]。目前，有關機械應力在椎間盤退變中的作用一直受到學者們廣泛關注，但機械應力對CESCs分化的影響尚不清楚。本研究以CESCs為研究對象，使用周期性應力加載裝置對其進行機械拉伸，探討應力對CESCs成骨分化作用的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM/F12培養基、FBS、青鏈霉素（GIBCO公司，美國）；瓊脂糖、Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（HyClone公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；兔抗人BMP-2多克隆抗體（Proteintech公司，美國）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體多聚體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RNA逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）、RT-PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司，日本）。
倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；Flexcell-4000TM應力加載系統、BioFlex培養板（Flexcell公司，美國）；ABI7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；分光光度計（Thermo Scientific公司，美國）；凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 軟骨終板細胞原代培養及CESCs篩選與鑒定
軟骨終板標本來源于本科室6例因腰椎間盤退行性病變行后路椎間盤切除并融合手術的患者。術前患者均簽署知情同意書，本研究獲第三軍醫大學附屬新橋醫院倫理委員會批準。軟骨終板標本于分離后2 h內于超凈工作臺使用無菌眼科器械包進行再次分離，PBS液反復沖洗，去除軟骨終板表面血污。采用我們既往報道方法[11-12]進行軟骨終板細胞的分離、原代培養及CESCs的篩選、鑒定。選取第3代CESCs用于實驗研究。
1.3 軟骨終板組織的免疫組織化學染色觀察
將獲得的部分軟骨終板組織塊置于4%多聚甲醛溶液固定1周，置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣4 周，每3天更換1次脫鈣液。組織脫鈣完成后，常規石蠟包埋、切片（5 μm厚），行BMP-2免疫組織化學染色。切片常規脫蠟水洗后，3%H2O2室溫下孵育15 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性；檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復后，使切片自然冷卻至室溫，然后用含0.1%Triton X-100的PBS沖洗3次，5%牛血清白蛋白封閉非特異性抗原；添加兔抗人BMP-2多克隆抗體（1∶100），空白對照不滴加一抗，4℃過夜；然后滴加HRP標記的山羊抗兔IgG抗體多聚體，37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.4 實驗分組及方法
1.4.1 周期性力學加載
將CESCs以2×105個/mL密度接種于Ⅰ型膠原蛋白包被的6孔BioFlex彈性硅膠膜培養板中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。待細胞貼壁生長至80%～90%融合后，換成含1%FBS的DMEM/F12培養液繼續培養12 h。然后換用含10%FBS的DMEM/F12培養液，在Flexcell-4000TM應力加載系統內分別施加1、6、12、24 h的拉伸刺激作為實驗組，拉伸率為10%，頻率1 Hz。以同樣條件接種于BioFlex培養板但不進行牽拉的靜態培養細胞作為對照組。
1.4.2 Western
blot檢測加載結束后吸出培養板中的培養基，PBS沖洗細胞2遍。細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。等量蛋白（30 μg）上樣，12%SDS-PAGE電泳，然后電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入BMP-2一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶2 000），于4℃孵育過夜；加入HRP標記的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL顯示蛋白條帶。凝膠成像儀上檢測條帶，采用ImageJ 灰度分析軟件進行定量分析。以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin灰度值的比值作為蛋白相對表達量。
1.4.3 實時熒光定量PCR檢測
檢測成骨相關基因Runx2、ALP及SOX9的表達。加載結束后吸出培養板中的培養基，PBS沖洗細胞2遍；根據Trizol試劑操作說明書提取細胞總RNA。分光光度計檢測 260 nm/280 nm處吸光度（A）值比值，并計算所提取RNA濃度。在RNA反轉錄成cDNA之前使用逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）去除基因組DNA，然后再根據試劑盒操作說明將總RNA（1 μg）反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，β-actin為內參照行實時定量PCR擴增，各基因引物序列見表 1。按照RT-PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）說明書操作，在ABI7500熒光定量PCR儀上進行RT-PCR反應。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s、60℃延伸34 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算定量結果。實驗重復3次。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨終板組織免疫組織化學染色觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，BMP-2蛋白表達于軟骨細胞，而空白對照未見陽性著色。見圖 1。
圖1
軟骨終板組織免疫組織化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×400） ? 空白對照 ? BMP-2表達于軟骨細胞（箭頭）? ?圖 2 Western blot 檢測機械拉伸對CESCs中BMP-2蛋白表達的影響 ? 電泳圖 1：對照組 2：拉伸1 h 3：拉伸6 h 4：拉伸12 h 5：拉伸24 h ? 各時間點BMP-2相對表達量 ? ?圖 3 實時熒光定量PCR檢測機械拉伸對CESCs成骨相關基因表達的影響 ? Runx2 ? ALP ? SOX9
Figure1.
Immunohistochemical staining of the endplate cartilage tissue (Inverted phase contrast microscope×400) ? Blank control ? BMP-2 expression in cartilage cells (arrow)? ? Fig. 2 BMP-2 protein expression after mechanical stretch in CESCs by Western blot ? Electrophoresis 1: Control group 2: Stretch at 1 hour 3: Stretch at 6 hours 4: Stretch at 12 hours 5: Stretch at 24 hours ? The relative expression of BMP-2 at each time point? ? Fig. 3 Osteogenesis-related genes expression after mechanical stretch in CESCs by real-time fluorescent quantitative PCR ? Runx2 ? ALP ? SOX9
2.2 機械拉伸對CESCs中BMP-2表達的影響
Western blot檢測示，機械拉伸1、6、12、24 h后BMP-2蛋白相對表達量均高于對照組，除拉伸1 h時與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各時間點蛋白表達與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；且隨機械拉伸時間延長，BMP-2蛋白相對表達量升高越明顯，各時間點間比較差異有統計學意義（P＜0.05），具有時間依賴性。見圖 2。
2.3 機械拉伸對CESCs成骨相關基因表達的影響
實時熒光定量PCR檢測示，機械拉伸各時間點Runx2、ALP mRNA相對表達量均高于對照組，其中12 h和24 h時與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而且隨拉伸時間延長，Runx2、ALP mRNA相對表達量呈逐漸增加趨勢，各時間點間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。而機械拉伸各時間點SOX9 mRNA相對表達量則少于對照組，其中6、12、24 h時與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而且隨拉伸時間延長，SOX9 mRNA相對表達量呈逐漸減少趨勢，各時間點間比較差異有統計學意義（P＜0.05），具有時間依賴性。見圖 3。
3 討論
MSCs是一類具有自我增殖和分化的多能干細胞，研究認為MSCs生長的微環境對于其分化和表型表達有重要影響[13]。細胞生長的微環境是由包括細胞因子和生長因子在內的生物化學環境和復雜生物力學環境共同組成。大量研究表明，力學因素在MSCs定向分化過程中發揮著重要作用，機械應力通過不同信號途徑將力學信號轉化為生物學信號，啟動或調節相關基因表達與分布，從而影響MSCs的定向分化進程[14-15]。
CESCs是從椎間盤軟骨終板組織中分離出來的一種未分化的MSCs，研究發現其具有較強的克隆形成能力和多向分化潛能[11-12]。我們研究結果表明，在缺少化學誘導因子的條件下，周期性拉伸刺激可上調CESCs中BMP-2蛋白表達，且具有時間依賴性。作為BMP-2的靶基因，Runx2是成骨細胞分化、骨發育的重要調節因子[16]。研究表明，Runx2在力學信號的傳導過程中起著重要作用。Kanno等[17]報道機械牽拉能上調牙周膜細胞中Runx2基因及有關成骨因子的表達，表明機械牽拉可促使牙周膜細胞向成骨細胞分化。ALP被認為是一種早期骨化標志物，其活性的高低反映出細胞向成骨方向轉化的趨勢，與成骨細胞的分化成熟成正相關[18]。我們的研究結果表明，與對照組相比，在周期性應力的作用下CESCs中Runx2、ALP mRNA 表達量逐漸上調。本研究結果與Sumanasinghe等[19]結論相符，均表明施加10%周期性拉伸可增強MSCs的BMP-2及成骨相關基因表達，誘導MSCs向成骨方向分化。同時，免疫組織化學染色結果顯示，椎間盤軟骨終板組織中也存在著BMP-2蛋白表達。Sowa等[20]研究證實隨著椎間盤退變程度的增加，BMP-2表達不斷上調。結合Yang等[21]、Sato等[22]的研究結果我們分析，當軟骨終板內的CESCs受到應力刺激后，促使CESCs中BMP-2以自分泌或旁分泌形式釋放，激活細胞核內基因的轉錄，調控成骨有關基因表達，誘導CESCs的成骨分化。
SOX9基因最早是作為早期胚胎發育相關基因而被發現，但之后研究逐漸發現其具有調控軟骨細胞發育、成熟的重要功能[23-24]。SOX9在軟骨形成和刺激細胞外基質形成（例如Ⅱ型膠原和軟骨聚集蛋白多糖的表達）中扮演重要角色[25]。而在本實驗中，我們發現成軟骨分化標志物SOX9的mRNA水平隨拉伸應力作用時間的延長表達量卻逐漸降低。SOX9表達量的下調，進一步說明周期拉伸刺激促進CESCs向成骨方向分化，而不是成軟骨方向分化。
本研究結果表明，周期性拉伸應力可促進CESCs中部分成骨相關基因的表達，誘導CESCs向成骨方向分化。但本研究仍存在幾點不足：① 研究使用的樣本來源于退變的軟骨終板組織，其生化組成會有一定程度改變；② 體內的CESCs是包裹在膠原和蛋白多糖的三維結構之中，而本研究是體外單層培養，對于CESCs的生物學特性有一定影響；③ 只對周期性應力對CESCs成骨分化影響進行了初步研究和探討，其具體調節機制和作用仍需進一步深入研究。
椎間盤是脊柱運動節段中重要組成部分，椎間盤組織和細胞的生長發育處于復雜的力學微環境中，力學刺激對椎間盤細胞的生理、病理狀態和功能起著重要調節作用[1-2]。目前已認識到椎間盤退變是一種由生物力學和生物化學因素相互作用引起的復雜病理過程，但其確切發病機制仍不清楚[3]。BMP是屬于TGF-β家族的一類分泌型多功能蛋白，其在調節多種細胞的生長、分化、遷移和凋亡過程中起重要作用[4]。1999年，Takae等[5]首次在小鼠椎間盤中發現BMP及其受體；隨后，BMP在椎間盤退變過程中的作用及相關機制被廣泛關注和研究[6-7]。BMP-2是BMP家族的主要成員之一，具有誘導未分化MSCs向成骨細胞定向分化與增殖的能力[8]。研究表明，機械刺激同樣能增加MSCs中BMP-2的表達量，促進MSCs向成骨方向分化。Rui等[9]通過體外實驗，研究機械刺激對肌腱源性干細胞BMP-2表達的影響及BMP-2促進肌腱源性干細胞向成骨分化的作用，結果顯示機械刺激可增加肌腱源性干細胞的BMP-2表達，并提高了肌腱源性干細胞向成骨分化的能力。Susperregui等[10]研究發現，在缺少化學因子誘導情況下，單獨的周期性牽拉可增加多能干細胞系C2C12細胞中BMP-2的表達。在有力學刺激作用存在時BMP-2表達增強，提示BMP-2可能是力學信號傳導的重要分子。
既往研究中，我們利用瓊脂糖懸浮培養系統從人退變椎間盤軟骨終板中分離出軟骨終板干細胞（cartilage endplate-derived stem cells，CESCs），發現它們具有與BMSCs一致的生物學特性[11-12]。目前，有關機械應力在椎間盤退變中的作用一直受到學者們廣泛關注，但機械應力對CESCs分化的影響尚不清楚。本研究以CESCs為研究對象，使用周期性應力加載裝置對其進行機械拉伸，探討應力對CESCs成骨分化作用的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM/F12培養基、FBS、青鏈霉素（GIBCO公司，美國）；瓊脂糖、Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（HyClone公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；兔抗人BMP-2多克隆抗體（Proteintech公司，美國）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體多聚體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RNA逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）、RT-PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司，日本）。
倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；Flexcell-4000TM應力加載系統、BioFlex培養板（Flexcell公司，美國）；ABI7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；分光光度計（Thermo Scientific公司，美國）；凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 軟骨終板細胞原代培養及CESCs篩選與鑒定
軟骨終板標本來源于本科室6例因腰椎間盤退行性病變行后路椎間盤切除并融合手術的患者。術前患者均簽署知情同意書，本研究獲第三軍醫大學附屬新橋醫院倫理委員會批準。軟骨終板標本于分離后2 h內于超凈工作臺使用無菌眼科器械包進行再次分離，PBS液反復沖洗，去除軟骨終板表面血污。采用我們既往報道方法[11-12]進行軟骨終板細胞的分離、原代培養及CESCs的篩選、鑒定。選取第3代CESCs用于實驗研究。
1.3 軟骨終板組織的免疫組織化學染色觀察
將獲得的部分軟骨終板組織塊置于4%多聚甲醛溶液固定1周，置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣4 周，每3天更換1次脫鈣液。組織脫鈣完成后，常規石蠟包埋、切片（5 μm厚），行BMP-2免疫組織化學染色。切片常規脫蠟水洗后，3%H2O2室溫下孵育15 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性；檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復后，使切片自然冷卻至室溫，然后用含0.1%Triton X-100的PBS沖洗3次，5%牛血清白蛋白封閉非特異性抗原；添加兔抗人BMP-2多克隆抗體（1∶100），空白對照不滴加一抗，4℃過夜；然后滴加HRP標記的山羊抗兔IgG抗體多聚體，37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.4 實驗分組及方法
1.4.1 周期性力學加載
將CESCs以2×105個/mL密度接種于Ⅰ型膠原蛋白包被的6孔BioFlex彈性硅膠膜培養板中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。待細胞貼壁生長至80%～90%融合后，換成含1%FBS的DMEM/F12培養液繼續培養12 h。然后換用含10%FBS的DMEM/F12培養液，在Flexcell-4000TM應力加載系統內分別施加1、6、12、24 h的拉伸刺激作為實驗組，拉伸率為10%，頻率1 Hz。以同樣條件接種于BioFlex培養板但不進行牽拉的靜態培養細胞作為對照組。
1.4.2 Western
blot檢測加載結束后吸出培養板中的培養基，PBS沖洗細胞2遍。細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。等量蛋白（30 μg）上樣，12%SDS-PAGE電泳，然后電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入BMP-2一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶2 000），于4℃孵育過夜；加入HRP標記的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL顯示蛋白條帶。凝膠成像儀上檢測條帶，采用ImageJ 灰度分析軟件進行定量分析。以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin灰度值的比值作為蛋白相對表達量。
1.4.3 實時熒光定量PCR檢測
檢測成骨相關基因Runx2、ALP及SOX9的表達。加載結束后吸出培養板中的培養基，PBS沖洗細胞2遍；根據Trizol試劑操作說明書提取細胞總RNA。分光光度計檢測 260 nm/280 nm處吸光度（A）值比值，并計算所提取RNA濃度。在RNA反轉錄成cDNA之前使用逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）去除基因組DNA，然后再根據試劑盒操作說明將總RNA（1 μg）反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，β-actin為內參照行實時定量PCR擴增，各基因引物序列見表 1。按照RT-PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）說明書操作，在ABI7500熒光定量PCR儀上進行RT-PCR反應。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s、60℃延伸34 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算定量結果。實驗重復3次。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨終板組織免疫組織化學染色觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，BMP-2蛋白表達于軟骨細胞，而空白對照未見陽性著色。見圖 1。
圖1
軟骨終板組織免疫組織化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×400） ? 空白對照 ? BMP-2表達于軟骨細胞（箭頭）? ?圖 2 Western blot 檢測機械拉伸對CESCs中BMP-2蛋白表達的影響 ? 電泳圖 1：對照組 2：拉伸1 h 3：拉伸6 h 4：拉伸12 h 5：拉伸24 h ? 各時間點BMP-2相對表達量 ? ?圖 3 實時熒光定量PCR檢測機械拉伸對CESCs成骨相關基因表達的影響 ? Runx2 ? ALP ? SOX9
Figure1.
Immunohistochemical staining of the endplate cartilage tissue (Inverted phase contrast microscope×400) ? Blank control ? BMP-2 expression in cartilage cells (arrow)? ? Fig. 2 BMP-2 protein expression after mechanical stretch in CESCs by Western blot ? Electrophoresis 1: Control group 2: Stretch at 1 hour 3: Stretch at 6 hours 4: Stretch at 12 hours 5: Stretch at 24 hours ? The relative expression of BMP-2 at each time point? ? Fig. 3 Osteogenesis-related genes expression after mechanical stretch in CESCs by real-time fluorescent quantitative PCR ? Runx2 ? ALP ? SOX9
2.2 機械拉伸對CESCs中BMP-2表達的影響
Western blot檢測示，機械拉伸1、6、12、24 h后BMP-2蛋白相對表達量均高于對照組，除拉伸1 h時與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各時間點蛋白表達與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；且隨機械拉伸時間延長，BMP-2蛋白相對表達量升高越明顯，各時間點間比較差異有統計學意義（P＜0.05），具有時間依賴性。見圖 2。
2.3 機械拉伸對CESCs成骨相關基因表達的影響
實時熒光定量PCR檢測示，機械拉伸各時間點Runx2、ALP mRNA相對表達量均高于對照組，其中12 h和24 h時與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而且隨拉伸時間延長，Runx2、ALP mRNA相對表達量呈逐漸增加趨勢，各時間點間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。而機械拉伸各時間點SOX9 mRNA相對表達量則少于對照組，其中6、12、24 h時與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而且隨拉伸時間延長，SOX9 mRNA相對表達量呈逐漸減少趨勢，各時間點間比較差異有統計學意義（P＜0.05），具有時間依賴性。見圖 3。
3 討論
MSCs是一類具有自我增殖和分化的多能干細胞，研究認為MSCs生長的微環境對于其分化和表型表達有重要影響[13]。細胞生長的微環境是由包括細胞因子和生長因子在內的生物化學環境和復雜生物力學環境共同組成。大量研究表明，力學因素在MSCs定向分化過程中發揮著重要作用，機械應力通過不同信號途徑將力學信號轉化為生物學信號，啟動或調節相關基因表達與分布，從而影響MSCs的定向分化進程[14-15]。
CESCs是從椎間盤軟骨終板組織中分離出來的一種未分化的MSCs，研究發現其具有較強的克隆形成能力和多向分化潛能[11-12]。我們研究結果表明，在缺少化學誘導因子的條件下，周期性拉伸刺激可上調CESCs中BMP-2蛋白表達，且具有時間依賴性。作為BMP-2的靶基因，Runx2是成骨細胞分化、骨發育的重要調節因子[16]。研究表明，Runx2在力學信號的傳導過程中起著重要作用。Kanno等[17]報道機械牽拉能上調牙周膜細胞中Runx2基因及有關成骨因子的表達，表明機械牽拉可促使牙周膜細胞向成骨細胞分化。ALP被認為是一種早期骨化標志物，其活性的高低反映出細胞向成骨方向轉化的趨勢，與成骨細胞的分化成熟成正相關[18]。我們的研究結果表明，與對照組相比，在周期性應力的作用下CESCs中Runx2、ALP mRNA 表達量逐漸上調。本研究結果與Sumanasinghe等[19]結論相符，均表明施加10%周期性拉伸可增強MSCs的BMP-2及成骨相關基因表達，誘導MSCs向成骨方向分化。同時，免疫組織化學染色結果顯示，椎間盤軟骨終板組織中也存在著BMP-2蛋白表達。Sowa等[20]研究證實隨著椎間盤退變程度的增加，BMP-2表達不斷上調。結合Yang等[21]、Sato等[22]的研究結果我們分析，當軟骨終板內的CESCs受到應力刺激后，促使CESCs中BMP-2以自分泌或旁分泌形式釋放，激活細胞核內基因的轉錄，調控成骨有關基因表達，誘導CESCs的成骨分化。
SOX9基因最早是作為早期胚胎發育相關基因而被發現，但之后研究逐漸發現其具有調控軟骨細胞發育、成熟的重要功能[23-24]。SOX9在軟骨形成和刺激細胞外基質形成（例如Ⅱ型膠原和軟骨聚集蛋白多糖的表達）中扮演重要角色[25]。而在本實驗中，我們發現成軟骨分化標志物SOX9的mRNA水平隨拉伸應力作用時間的延長表達量卻逐漸降低。SOX9表達量的下調，進一步說明周期拉伸刺激促進CESCs向成骨方向分化，而不是成軟骨方向分化。
本研究結果表明，周期性拉伸應力可促進CESCs中部分成骨相關基因的表達，誘導CESCs向成骨方向分化。但本研究仍存在幾點不足：① 研究使用的樣本來源于退變的軟骨終板組織，其生化組成會有一定程度改變；② 體內的CESCs是包裹在膠原和蛋白多糖的三維結構之中，而本研究是體外單層培養，對于CESCs的生物學特性有一定影響；③ 只對周期性應力對CESCs成骨分化影響進行了初步研究和探討，其具體調節機制和作用仍需進一步深入研究。
